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usp1-regulated reciprocal differentiation of Th17 cells and Treg cells by deubiquitinating and stabilizing TAZ

Cellular & Molecular Immunology 2023年第3期20卷 252-263页

作者： Xiaotong Zhu Peng Wang Xiaoxia Zhan Yuping Zhang Junli Sheng Shitong He Yitian Chen Dingnai Nie Xiaolong You Haiyan Mai Qinghong Yu Laisheng Li Ligang Jie Shengfeng Hu Department of Rheumatology and Clinical Immunology Zhujiang HospitalSouthern Medical UniversityGuangzhouChina Department of Emergency Medicine Sun Yat-sen Memorial HospitalSun Yat-sen UniversityGuangzhouChina Department of Laboratory Medicine The First Affiliated Hospital of Sun Yat-sen UniversityGuangzhouGuangdongChina Institute of Molecular Immunology School of Laboratory Medicine and BiotechnologySouthern Medical UniversityGuangzhouGuangdongChina Provincial Key Laboratory of Immune Regulation and Immunotherapy School of Laboratory Medicine and BiotechnologySouthern Medical UniversityGuangzhouGuangdongChina

The balance between inflammatory T helper type 17(Th17)and immunosuppressive regulatory T(Treg)cells is critical for maintaining immune homeostasis in the human body and is tightly regulated under healthy *** increasing number of studies have reported that deubiquitinases(DUBs)play a vital role in regulating Th17-and Treg-cell ***,the biological functions of only a small fraction of DUBs in Th17-and Treg-cell differentiation are well *** this study,we identified ubiquitin-specific peptidase 1(usp1)as a vital regulator of CD4+T-cell ***1 promoted Th17-cell differentiation but attenuated Treg-cell differentiation,thereby promoting the development of inflammatory ***,usp1 in CD4+T cells enhanced the activity of RORγt but promoted the proteasomal degradation of Foxp3 through deubiquitination and stabilization of TAZ in vitro and in ***,ML323,a specific inhibitor of the usp1/UAF1 deubiquitinase complex,inhibited Th17-cell differentiation and promoted Treg-cell differentiation in vitro and in vivo,indicating that ML323 might be a promising candidate for the treatment of diseases associated with an imbalance between Th17 and Treg *** study highlights the critical role of usp1 in regulating adaptive immune responses and suggests that usp1 might be a drug target for the treatment of diseases associated with an imbalance between Th17 and Treg cells.

关键词： usp1 TAZ Th17 Treg

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Diet high in branched-chain amino acid promotes PDAC development by usp1-mediated BCAT2 stabilization

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National Science Review 2022年第5期9卷 119-128页

作者： Jin-Tao Li Kai-Yue Li Ying Su Yuan Shen Ming-Zhu Lei Fan Zhang Miao Yin Zheng-Jun Chen Wen-Yu Wen Wei-Guo Hu Dan Su Jia Qu Qun-Ying Lei Fudan University Shanghai Cancer Center and Institutes of Biomedical Sciences Cancer Institutes Key Laboratory of Breast Cancer in ShanghaiShanghai Key Laboratory of Medical EpigeneticsInternational Co-Laboratory of Medical Epigenetics and MetabolismMinistry of Science and Technology Shanghai Medical College Fudan University State Key Laboratory of Cell Biology Shanghai Institute of Biochemistry and Cell Biology Center for Excellence in Molecular Cell ScienceChinese Academy of Sciences Cancer Research Institute Zhejiang Cancer Hospital and Key Laboratory Diagnosis and Treatment Technology on Thoracic Oncology of Zhejiang Province Department of Oncology Shanghai Medical College Fudan University State Key Laboratory of Medical Neurobiology Fudan University

BCAT2-mediated branched-chain amino acid(BCAA) catabolism is critical for pancreatic ductal adenocarcinoma(PDAC) development,especially at an early ***,whether a high-BCAA diet promotes PDAC development in vivo,and the underlying mechanism of BCAT2 upregulation,remain ***,we find that a high-BCAA diet promotes pancreatic intraepithelial neoplasia(PanIN)progression in LSL-KrasG12 D/+; Pdx1-Cre(KC) ***,we screened with an available deubiquitylase library which contains 31 members of usp family and identified that usp1 deubiquitylates BCAT2 at the K229 ***,BCAA increases usp1 protein at the translational level via the GCN2-eIF2α pathway both in vitro and in *** importantly,usp1 inhibition recedes cell proliferation and clone formation in PDAC cells and attenuates pancreas tumor growth in an orthotopic transplanted mice ***,a positive correlation between usp1 and BCAT2 is found in KC;LSL-KrasG12D/+;p53flox/+;Pdx1-Cre mice and clinical ***,a therapeutic targeting usp1-BCAT2-BCAA metabolic axis could be considered as a rational strategy for treatment of PDAC and precisive dietary intervention of BCAA has potentially translational significance.

关键词： usp1 deubiquitylation BCAT2 PanIN PDAC

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usp1影响MDCK细胞内流感病毒复制的机制研究

USP1影响MDCK细胞内流感病毒复制的机制研究

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作者：廖月姣西北民族大学

学位级别：硕士

流感是由流感病毒感染引起的人畜共患的常见呼吸道疾病之一,可造成相当大的公共卫生负担,接种流感疫苗是预防和控制流感的直接有效手段。与传统的鸡胚基质疫苗相比,细胞基质流感疫苗可有效降低鸡胚源蛋白质残留可能造成的过敏问题。研... 详细信息

流感是由流感病毒感染引起的人畜共患的常见呼吸道疾病之一,可造成相当大的公共卫生负担,接种流感疫苗是预防和控制流感的直接有效手段。与传统的鸡胚基质疫苗相比,细胞基质流感疫苗可有效降低鸡胚源蛋白质残留可能造成的过敏问题。研究细胞内的抗病毒应答调控机制,可以为有效提高细胞内疫苗的生产效率提供理论支持,进一步阐明宿主细胞中影响流感病毒感染和增殖的潜在分子机制。本研究依据于实验室前期蛋白组学数据,发现H3N2流感病毒感染MDCK细胞后,去泛素化酶1(Ubiquitin Specific Peptidase 1,usp1)的蛋白与基因水平显著上调,推测usp1可能参与MDCK细胞内对流感病毒应答的调控。本研究通过慢病毒表达载体构建usp1过表达及敲低的MDCK细胞系,发现usp1可以显著抑制MDCK细胞中流感病毒的增殖。机制上,通过Flag-Pulldown实验,对流感病毒感染后的细胞内可能与usp1互作的蛋白进行质谱分析,进一步通过Co-IP和免疫荧光共定位分析发现usp1和RIG-I在MDCK细胞中存在互作关系。usp1通过降低RIG-I的K63/K48位点泛素化,稳定RIG-I的表达,敲低usp1抑制了RIG-I的K63/K48位点的去泛素化,降低了RIG-I蛋白水平。以上实验结果表明usp1可通过去泛素化促进RIG-I的蛋白稳定性,从而参与抗流感病毒免疫应答。另一方面敲低usp1基因能够显著促进细胞内流感病毒复制,显著上调流感病毒滴度,且对细胞增殖活性未产生显著影响,初步判断usp1是建立流感疫苗高产MDCK基因工程细胞株的有效靶基因。以上研究结果有助于我们更全面的理解usp1基因的生物学功能以及宿主细胞与流感病毒间的互作机制,同时为人工建立疫苗高产MDCK细胞株的靶基因筛选提供理论和方法依据。

关键词：流感病毒流感疫苗去泛素化酶 usp1 MDCK细胞

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探索usp1/MAPK/c-JUN在胃癌中的增殖和迁移作用

探索USP1/MAPK/c-JUN在胃癌中的增殖和迁移作用

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作者：彭勇江苏大学

学位级别：硕士

胃癌是中国乃至世界常见的消化道肿瘤之一,发病率及死亡率在所有肿瘤中排前列。由于胃癌起病隐匿,很难做到早发现,早诊断,早治疗。大部分患者发现时已是晚期,失去最佳手术治疗时机,影响患者生存时间。usp1在多种肿瘤组织中异常表达,包... 详细信息

胃癌是中国乃至世界常见的消化道肿瘤之一,发病率及死亡率在所有肿瘤中排前列。由于胃癌起病隐匿,很难做到早发现,早诊断,早治疗。大部分患者发现时已是晚期,失去最佳手术治疗时机,影响患者生存时间。usp1在多种肿瘤组织中异常表达,包括乳腺癌、骨肉瘤和肝癌等,并通过各种信号通路参与肿瘤的增殖和迁移过程。虽目前有少量报道usp1在胃癌中的作用,但分子机制仍不清楚。本研究目的在于探索usp1在胃癌中增殖和迁移作用及作用机制,为胃癌治疗寻找新的靶点。研究目的:1.探索usp1在胃癌中的表达及在胃癌中的生物学功能。2.研究usp1的导致胃癌发病的分子机制,为胃癌靶向治疗提供理论依据。方法:1.运用生物信息学相关知识,获取TCGA及CCLE数据库中组织及细胞相关数据,评估usp1在胃癌组织表达。通过基因效率评分,对不同胃癌细胞株进行基因敲低筛选。2.构建敲低usp1质粒载体,然后转染到胃癌细胞株AGS,并进行细胞计数试剂盒(CCK-8)、迁移能力和克隆形成,验证usp1在胃癌增殖和转移过程中的作用。3.对敲低usp1胃癌细胞株进行转录组测序,通过差异基因表达分析、功能及信号通路分析等,进一步阐述usp1与胃癌的相关性。4.通过q PCR和Western blot检测敲低usp1和抑制剂组中c-JUN mRNA和蛋白的表达水平。5.挽救实验验证在usp1敲低的AGS胃癌细胞中过表达c-JUN,观察usp1对胃癌细胞株增殖和迁移的能力的影响;同时抑制剂组中过表达c-JUN,观察usp1对胃癌细胞株的增殖和迁移的能力的影响。结果:1.生信分析显示usp1在胃癌组织高表达,并筛选出后续实验的胃癌细胞株。***1敲低抑制了胃癌细胞株的增殖及迁移。3.对敲低usp1的胃癌细胞株进行转录组测序,并对转录数据进行差异分析、通路分析及聚类分析,发现usp1与MAPK/c-JUN存在显著相关性。4.在敲低usp1的AGS胃癌细胞株中,usp1及c-JUN mRNA及蛋白水平均显著下降;加入抑制剂后,usp1及c-JUN mRNA及蛋白水平进一步下降。5.敲低usp1后的胃癌细胞株的增殖和迁移能力减弱,而在敲低usp1的胃癌细胞株中过表达c-JUN,能够逆转这一趋势;在抑制组过表达c-JUN同样能逆转胃癌细胞株的增殖和迁移能力。结论:usp1与胃癌增殖和迁移有关,其在胃癌组织表达上调;敲低usp1能显著抑制胃癌细胞株的增殖和迁移;基于转录组测序发现usp1与c-JUN相互作用,调节胃癌细胞株增殖和迁移。usp1可能作为胃癌增殖和迁移的预测因子,也可作为胃癌潜在治疗靶点进行深入研究,具一定的转化应用价值,值得进一步研究。

关键词：泛素特异性蛋白酶 usp1 胃癌增殖迁移

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去泛素化酶usp1调节肠道内环境稳态的功能研究

去泛素化酶USP1调节肠道内环境稳态的功能研究

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作者：李瑗馨大连医科大学

学位级别：硕士

泛素-蛋白酶体系统(Ubiquitin-proteasome system,UPS)是一种高度调控的细胞内蛋白质降解途径,由酶联反应控制蛋白质泛素化作用,在细胞生存、增殖、发育、DNA损伤反应中都发挥着重要作用。UPS是通过E3泛素连接酶将一种或多种泛素共价附... 详细信息

泛素-蛋白酶体系统(Ubiquitin-proteasome system,UPS)是一种高度调控的细胞内蛋白质降解途径,由酶联反应控制蛋白质泛素化作用,在细胞生存、增殖、发育、DNA损伤反应中都发挥着重要作用。UPS是通过E3泛素连接酶将一种或多种泛素共价附着在赖氨酸残基上,从而对目标蛋白进行翻译后修饰,如降解和释放错误折叠或损坏的蛋白质以及功能失调的细胞器,破坏细胞稳态。该过程通过去泛素化酶(deubiquitinating enzymes,DUBs)的拮抗作用维持动态平衡。去泛素化酶usp1属于DUBs大家族中的去泛素化蛋白半胱氨酸蛋白酶家族(usps家族),其可以通过其结合受体usp1相关因子1-UAF1发挥去泛素化酶功能,二者形成的去泛素酶复合物参与多种生物过程。其最重要的功能之一是作为肿瘤调节因子,调控包括SIK2MMP-2、GSK-3B、Bcl-2、Stat3、cyclin E1、Wnt-1和cyclin A1在内的多种肿瘤发生相关蛋白。除此之外,usp1还可作为DNA复制叉的稳定器和细胞处于营养匮乏状态下的能量调配因子。但有关usp1如何影响肠道干细胞发育的研究仍是未知的。在哺乳动物中,由肠道干细胞参与调节的肠道内环境稳态对个体的生长、代谢和发育起到至关重要的作用,而果蝇肠道从干细胞层面到形态结构层面与哺乳动物存在很高的相似度,因此果蝇肠道上皮被广泛用于研究干细胞的再生和维持,以及不同细胞类型的信号转导事件如何影响干细胞行为。并且果蝇还具有传代速度快、容易饲养、遗传学背景清晰、遗传学工具丰富多样等别的模式生物无法比拟的优点。本课题发现在果蝇肠道干细胞和前体细胞中敲低去泛素化酶基因usp1的表达导致果蝇肠道干细胞和前体细胞数目显著减少,肠道分泌细胞数量增多,并且肠道干细胞核型异常;进一步研究发现JAK-STAT、Hippo和Notch信号通路的活力降低,JNK信号通路被激活;在发育过程中果蝇肠道屏障完整性遭到破坏,果蝇寿命显著缩短。

关键词：肠道干细胞 usp1 肠道稳态寿命

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UAF1-usp1去泛素化酶复合体稳定cGAS并促进抗病毒免疫反应

UAF1-USP1去泛素化酶复合体稳定cGAS并促进抗病毒免疫反应

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作者：马晨凯山东大学

学位级别：硕士

环磷酸鸟苷—磷酸腺苷合酶(cyclic guanosine monophosphate-adenosine monophosphate synthase,cGAS)是启动天然免疫应答的关键模式识别受体。cGAS检测病毒DNA或基因组不稳定导致的细胞质DNA的出现,并合成第二信使环鸟苷酸—腺苷酸(cyc... 详细信息

环磷酸鸟苷—磷酸腺苷合酶(cyclic guanosine monophosphate-adenosine monophosphate synthase,cGAS)是启动天然免疫应答的关键模式识别受体。cGAS检测病毒DNA或基因组不稳定导致的细胞质DNA的出现,并合成第二信使环鸟苷酸—腺苷酸(cyclic guanosine monophosphate-adenosine monophosphate,cGAMP),进而通过干扰素基因刺激因子(stimulator of interferon genes,STING)诱导Ⅰ型干扰素的表达。cGAS-STING信号通路在抗病毒免疫反应中起着重要作用。然而,细胞质中的自体DNA被识别后导致的cGAS的异常活化与自身炎症性疾病、衰老和恶性肿瘤等有关。因此,应严格控制cGAS的活化,以防御病毒感染并避免有害的免疫疾病。cGAS-STING信号通路的活化与cGAS的表达水平有关。多种翻译后修饰,如泛素化和SUMO化,通过控制cGAS蛋白的稳定性,以此微调其激活水平。自噬受体p62检测cGAS的K48位的多泛素化,以促进其自噬体降解。去泛素化酶usp14和usp29介导K48位的去泛素化以增强cGAS稳定性。分别由TRIM38和SENP2介导的cGAS的SUMO化和去SUMO化也可以控制cGAS稳定性。然而,控制cGAS稳定性的更深层机制,尤其是其在病毒感染期间的反馈调节,在很大程度上仍然未知。泛素特异性肽酶 1(ubiquitin specific peptidase 1,usp1)相关因子 1(usp1-associated factor 1,UAF1,也称为WDR48或p80)是三种去泛素化酶的伴侣蛋白,包括 usp1、usp12 和 usp46。UAF1 组成性地与 usp1、usp12 和 usp46结合,形成去泛素化酶复合体,从而增强其去泛素化酶活性。UAF1/usp1复合体在多种生物学过程中发挥调节作用,如DNA损伤反应和肿瘤发病机制。UAF1/usp1复合体去泛素化并稳定DNA结合抑制剂ID1,ID2,ID3。从而抑制成骨细胞分化并增强增殖。UAF1/usp12通过去泛素化作用稳定B细胞淋巴瘤/白血病10(BCL10),从而激活CD4+T细胞信号。此前,我们还发现了 UAF1/usp1去泛素化酶复合体可以稳定TBK1和NLRP3,并促进RLR和炎症小体的活化。ML323是UAF1/usp1去泛素化酶复合体的特异性抑制剂,能在体内减弱RLR驱动的IFN反应并改善NLRP3依赖性炎症。这些发现表明UAF1/usp1可能是药物设计的一个靶点。然而,UAF1/usp1去泛素化酶复合体是否具有其他靶点及其在cGAS激活中的潜在作用,仍需要研究。在本研究中,我们发现病毒感染能够诱导UAF1/usp1的表达。Uaf1缺陷和ML323处理都减弱了 cGAS介导的抗病毒免疫反应,并促进了病毒复制。机制上,UAF1和usp1都与cGAS相互作用,介导其K48位去泛素化,从而稳定其蛋白质表达。因此,我们的研究揭示了去泛素化酶复合体UAF1/usp1靶向cGAS抗病毒固有免疫反应的调节机制,并为治疗cGAS异常活化引起的疾病提供了潜在的靶点。

关键词： cGAS 去泛素化抗病毒免疫 usp1 UAF1

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鸡usp1基因的克隆及原核表达

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畜牧与兽医 2012年第S1期44卷 309-310页

作者：赵程程郑海南吴山力吴涵张玉静艾永兴吉林大学畜牧兽医学院吉林长春130062

泛素(ubiquitin)是一种真核细胞中的小蛋白,由76个氨基酸组成,分子量大约为8.5 kDa。最初发现的主要功能是标记需要降解的蛋白质,使其进入泛素-蛋白酶体降解系统降解。泛素在泛素激活酶(E1)、泛素结合酶(E2)及泛素蛋白质连接酶(E3)的作... 详细信息

泛素(ubiquitin)是一种真核细胞中的小蛋白,由76个氨基酸组成,分子量大约为8.5 kDa。最初发现的主要功能是标记需要降解的蛋白质,使其进入泛素-蛋白酶体降解系统降解。泛素在泛素激活酶(E1)、泛素结合酶(E2)及泛素蛋白质连接酶(E3)的作用下共价修饰底物蛋白质的过程称为泛素化。泛素-蛋白酶体途径是细胞内一个重要的蛋白质降解调节系统。

关键词： usp1 泛素激活酶原核表达泛素-蛋白酶体氨基酸组成共价修饰 ubiquitin 蛋白质降解基因表达载体泛素结合酶

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抑制肺鳞癌细胞FANCM和usp1基因对顺铂的增敏效应

抑制肺鳞癌细胞FANCM和USP1基因对顺铂的增敏效应

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作者：李玫瑜江苏大学

学位级别：硕士

目的:DNA损伤修复是肿瘤细胞对铂类药物耐药的重要机制,FA/BRCA通路在铂类药物所致细胞DNA损伤的修复中发挥了关键作用。本研究通过抑制人肺鳞癌细胞SK-MES-1株FA/BRCA通路上游蛋白FANCM和去泛素化蛋白usp1,观察FA/BRCA通路激活状态,探... 详细信息

目的:DNA损伤修复是肿瘤细胞对铂类药物耐药的重要机制,FA/BRCA通路在铂类药物所致细胞DNA损伤的修复中发挥了关键作用。本研究通过抑制人肺鳞癌细胞SK-MES-1株FA/BRCA通路上游蛋白FANCM和去泛素化蛋白usp1,观察FA/BRCA通路激活状态,探讨这些干预对化疗药物顺铂(DDP)敏感性的影响。方法:体外培养人肺鳞癌SK-MES-1细胞,按照脂质体转染试剂盒说明书介绍的程序将特异性针对FANCM和usp1基因的si RNA(FANCM-si RNA和usp1-si RNA)分别和共转染于SK-MES-1细胞株。采用蛋白质印迹法(Western Blot)测定转染后FANCM和usp1蛋白表达以验证si RNA转染效率确保转染成功;Annexin V/PI流式细胞术测定转染前后SK-MES-1细胞经10μg/ml DDP处理24h后的早期凋亡率变化;CCK-8(Cell Counting Kit-8)法测定转染前后细胞经10μg/ml DDP处理24h和48h后的生存率;蛋白质印迹法检测转染前后细胞经不同浓度梯度DDP处理后FANCD2蛋白单泛素化水平,以及免疫荧光染色检测转染前后细胞核内FANCD2核聚小体的表达状态。结果:(1)SK-MES-1细胞分别经FANCM-siRNA和usp1-siRNA转染后,与空白对照组和阴性对照组比较,FANCM蛋白和usp1蛋白表达均明显降低(两者均Pusp1-si RNA转染皆有效;(2)肺鳞癌细胞SK-MES-1分别转染和双转染FANCM-si RNA和usp1-si RNA后,用10μg/ml DDP处理24h,流式细胞术检测结果显示细胞的早期凋亡率明显高于未转染的细胞。但转染usp1-si RNA的细胞早期凋亡率高于转染FANCM-si RNA的细胞。usp1-si RNA和FANCM-si RNA双转染后的细胞早期凋亡率明显高于单转染FANCM-si RNA细胞的早期凋亡率(Pusp1-si RNA细胞的早期凋亡率比较无明显差异(P>0.05)。(3)肺鳞癌细胞SK-MES-1分别转染和双转染FANCM-si RNA和usp1-si RNA后,用10μg/ml DDP分别处理24h和48h,细胞生存率和半数抑制率(IC50)明显下降,与未转染组比较均有统计学意义(Pusp1-si RNA细胞的生存率低于转染FANCM-si RNA的细胞(Pusp1-si RNA和FANCM-si RNA双转染后经DDP处理24h和48h的细胞生存率和IC50明显低于单转染FANCM-si RNA细胞生存率(Pusp1-si RNA细胞生存率比较无明显差异(P>0.05)。(4)肺鳞癌SK-MES-1细胞经FANCM-si RNA转染并经DDP处理后,以FANCD2-L/S比值所表示的FANCD2单泛素化水平下调,同时胞核内的FANCD2核聚小体表达降低,提示FA/BRCA通路上游基因FANCM沉默导致FANCD2单泛素化受抑制。转染usp1-si RNA后,DDP诱导的FANCD2单泛素化水平上调,核内FANCD2核聚小体表达增强,提示FANCD2去泛素化酶usp1被抑制后,造成单泛素化的FANCD2堆积。此外,双转染FANCM-si RNA和usp1-si RNA后,DDP诱导的细胞FANCD2单泛素化水平明显高于单转染FANCM-si RNA的细胞,但低于单转染usp1-si RNA的细胞,胞核内FANCD2核聚小体表达无明显改变,这一结果的机制如上所述。结论:沉默FANCM基因后通过抑制FA/BRCA通路FANCD2蛋白单泛素化,使得FA/BRCA通路下游蛋白不能被激活,从而无法对DDP诱导的DNA损伤实施修复;沉默usp1基因后可使FANCD2去泛素化受抑制,导致已泛素化的FANCD2在细胞内堆积,亦不能激活FA/BRCA通路下游蛋白。两者都可阻断FA/BRCA通路,抑制DNA损伤修复,导致SK-MES-1细胞对DDP的敏感性增高,值得注意的是沉默usp1基因后对DDP的增敏效应更为明显。

关键词：肺鳞癌细胞 FA/BRCA通路顺铂 FANCM usp1 si RNA

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去泛素化酶复合体usp1-UAF1在抗病毒固有免疫反应中的作用及分子机制

去泛素化酶复合体USP1-UAF1在抗病毒固有免疫反应中的作用及分子...

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作者：余仲夏山东大学

学位级别：硕士

研究背景Toll样受体(Toll-like receptors,TLRs)及维甲酸诱导基因Ⅰ样受体(RIG-1-like receptors,RLRs)等识别病原体相关分子模式(pathogen associated molecular patterns,PAMPs)后,可通过募集多种不同接头分子,激活TANK结合激酶1(TANK-binding kinase 1,TBK1)。活化的TBK1磷酸化干扰素调节因子3(interferon regulatory 3,IRF3),促进其二聚化及核内转位,进而形成有活性的转录复合体,启动Ⅰ型干扰素(IFNα/β)基因转录。Ⅰ型干扰素可与Ⅰ型干扰素受体结合,通过JAK-STAT通路,诱导多种抗病毒基因的表达。因此,TBK1作为Ⅰ型干扰素产生所必需的关键激酶,其适度活化对机体抗病毒免疫及维持免疫稳态均非常重要。已有报道,多个E3泛素连接酶可通过促进TBK1泛素化,调控TBK1表达及活化;然而去泛素化酶及其介导的去泛素化,对TBK1表达及活化的影响尚不清楚。泛素特异性蛋白酶1(ubiquitin specific peptidase,usp1)是泛素特异性蛋白酶家族中的一员,能够去除一系列底物的泛素化修饰,进而参与调控多种信号通路。usp1 可与 usp1 相关因子 1(usp1-associatedfactor1,UAF1)结合形成一个去泛素化酶复合体,并显著增强usp1的去泛素化酶活性。usp1-UAF1去泛素化酶复合体通过去除其靶分子的泛素化修饰,参与多个信号通路的调控,如调节DNA损伤修复过程和肿瘤发生过程等。然而,usp1-UAF1去泛素化酶复合体在免疫系统,特别是固有抗病毒免疫反应中的作用,尚不清楚。本研究中,我们发现病毒感染可诱导usp1和UAF1的表达;usp1-UAF1去泛素化酶复合体可抑制TLR3/4和RIG-I介导的IRF3活化以及后续的IFN-β的分泌。usp1、UAF1均可特异性结合TBK1,并去除其K48位偶联的泛素化修饰,进而稳定TBK1的蛋白表达。同时,usp1-UAF1去泛素化酶复合体的特异性抑制剂ML323,可抑制TBK1蛋白表达及IFN-β分泌。小鼠病毒感染模型中,ML323处理抑制抗病毒固有免疫反应,并促进病毒复制。本研究为TBK1活化提出了新的调控机制;usp1-UAF1去泛素化酶复合体可能作为潜在靶点,用于病毒感染性疾病等的防治。材料和方法***1-UAF1对IFN-β表达的影响***1-UAF1特异性抑制剂ML323不同浓度(0,15,30,60 μM.)预处理小鼠原代腹腔巨噬细胞4h后,仙台病毒(Sendai virus,SeV)感染12h,ELISA检测IFN-β的分泌情况。1.2.设计合成分别针对usp1、UAF1的特异性干扰RNA(siRNA),使用脂质体Interferin将siRNA转染入小鼠原代腹腔巨噬细胞,36h后,分别用LPS、poly(I:C)刺激或SeV感染细胞,ELISA检测IFN-β、TNF-α及IL-6的分泌情况。1.3.构建usp1、UAF1表达质粒,使用脂质体JetPEI将usp1、UAF1表达质粒及相关报告基因质粒,共转染入RAW264.7细胞;24h后,分别用LPS、poly(I:C)刺激或SeV感染细胞,报告基因检测IFN-β及NF-κB报告基因活化情况。1.4.分别用SeV感染或IFN-β刺激小鼠原代腹腔巨噬细胞不同时间,Western blot检测usp1和UAF1的表达变化。***1-UAF1对IRF3活化的影响2.1.利用脂质体JetPEI将分别usp1、UAF1表达质粒及不同接头分子,与IRF3或NF-κB报告基因质粒,共转染入HEK293T细胞。报告基因检测由TRIF、TBK1介导的IRF3报告基因活化情况,以及由Myd88、TRIF、RIG-I介导的NF-κB报告基因活化情况。2.2.利用脂质体Interferin分别将usp1、UAF1 siRNA转染入小鼠原代腹腔巨噬细胞;36h后,分别用LPS刺激或SeV感染细胞;Western blot检测IRF3及STAT1的磷酸化变化。***1-UAF1与TBK1的相互作用3.1.利用脂质体JetPEI将usp1、UAF1表达质粒及不同接头分子,与IFN-β报告基因质粒,共转染入HEK293T细胞;报告基因检测由RIG-I、MDA5、MAVS、TRIF、TBK1、IRF3-5D介导的IFN-β报告基因活化情况。将usp1、UAF1表达质粒及TBK1,分别与IRF3、ISRE或NF-κB报告基因质粒,共转染入HEK293T细胞;报告基因检测由TBK1介导的IRF3、ISRE、NF-κB报告基因活化情况。***刺激小鼠原代腹腔

关键词： IFN-β TBK1 usp1 UAF1 泛素化

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番茄usp1响应干旱和高温胁迫的研究

番茄USP1响应干旱和高温胁迫的研究

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作者：宗宁合肥工业大学

学位级别：硕士

泛素-蛋白酶体系统是生物体当中降解以及修饰蛋白质的重要系统,与生物体的生长发育息息相关。泛素-蛋白酶体系统由泛素分子、泛素活化酶E1、泛素结合酶E2、泛素连接酶E3、蛋白酶体及其底物构成,能够完成对底物泛素化的修饰,其中E3决定... 详细信息

泛素-蛋白酶体系统是生物体当中降解以及修饰蛋白质的重要系统,与生物体的生长发育息息相关。泛素-蛋白酶体系统由泛素分子、泛素活化酶E1、泛素结合酶E2、泛素连接酶E3、蛋白酶体及其底物构成,能够完成对底物泛素化的修饰,其中E3决定了被修饰底物的特异性。CUL4-DDB1复合物（CRL4）是近年来研究较多的一类E3泛素连接酶。DDB1作为CUL4泛素连接酶的核心组件参与细胞内许多重要的生命活动。前期研究发现番茄CUL4-DDB1复合物调节植物细胞的非生物胁迫应答。为进一步阐明DDB1在植物抗逆中的调控机制和生理功能,通过酵母双杂交筛选,发现普遍应激蛋白usp1与DDB1存在相互作用。usps家族蛋白在生物体中是一类保守蛋白,在包括植物在内的生物体中都有广泛分布,其主要功能是参与提高生物体对逆境胁迫的耐受;进一步研究发现usp1定位于细胞质中,且其基因表达受到多种胁迫条件诱导。泛素化实验揭示usp1可以被泛素化修饰降解,上调usp1表达导致植株对干旱和高温抗性的增强,同时增强了番茄幼苗对于干旱胁迫的耐受性,表明usp1可能正调控番茄植株对逆境下胁迫的应答,且它的作用受CUL4-DDB1泛素连接酶的靶向降解的调控。此外,研究还发现usp1过表达植株的叶片性状发生了明显的变化。与野生型相比,usp1过表达植株的叶片更宽,叶片的长宽比较小,同时气孔变得更加粗大,密度明显减小,叶片的叶绿素含量也显著高于野生型。这些变化很可能是造成usp1过表达植株对于干旱和高温胁迫耐受性增强的直接原因。本研究不仅揭示新的植物抗逆机理,而且为植物抗逆分子育种提供新的基因资源和技术途径。

关键词：番茄 usp1 CUL4-DDB1 泛素化修饰环境胁迫

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