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urg11的表达与胃癌恶性生物学行为的关系及其可能机制

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URG11的表达与胃癌恶性生物学行为的关系及其可能机制

作者：杜锐第四军医大学

学位级别：硕士

【背景】 urg11是利用抑制消减杂交及全长PCR扩增技术(RACE-PCR)克隆的一个可以被HBx蛋白上调新基因，该基因定位在人的11号染色体长臂，含有13个外显子，编码区为2022个碱基对，编码约70KD的蛋白。基因结构域分析，该基因含有表皮... 详细信息

【背景】 urg11是利用抑制消减杂交及全长PCR扩增技术(RACE-PCR)克隆的一个可以被HBx蛋白上调新基因，该基因定位在人的11号染色体长臂，含有13个外显子，编码区为2022个碱基对，编码约70KD的蛋白。基因结构域分析，该基因含有表皮生长因子重复结构域;蛋白结构分析urg11蛋白含有2个VWC结构域和一个C型凝集素结构域(C-lectin)。VWC即威勒德布兰因子，是一个血管黏附分子，参与凝血和血栓形成，VWC结构域广泛存在生物界各种蛋白中：人的补体分子B，C2，CR3和CR4;整合素家族分子;6，12，14型胶原以及其它细胞外蛋白，与细胞黏附、迁移、淋巴细胞的归巢、及信号转导密切相关。而C-lectin结构域和细胞的增殖，分化及信号通路密切相关。urg11还能促进肝癌细胞系的增殖、分化，并促进肝癌细胞G1期向S期进展，及促进肝癌细胞裸鼠体内的成瘤能力。特别是将此基因转染入肿瘤细胞，可促进β-连接蛋白(β-catenin)

关键词：胃癌 urg11 细胞内钙离子增殖转移

上调基因-11(urg11)生物信息学与功能分析

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生物技术通报 2016年第3期32卷 203-208页

作者：姚杨苏杰刘凯歌徐锐西安医学院第一附属医院西安710077

应用基因芯片技术获取以稳定转染HBx基因的肝癌细胞Hep G(Hep G22-X)Y,以及非转染的肝癌细胞Hep G 2的差异表达基因,利用生物信息学方法对其进行初步分析表明,该蛋白基因编码673个氨基酸,预测分子量为17.06 k D,理论等电点为4.83,定位... 详细信息

应用基因芯片技术获取以稳定转染HBx基因的肝癌细胞Hep G(Hep G22-X)Y,以及非转染的肝癌细胞Hep G 2的差异表达基因,利用生物信息学方法对其进行初步分析表明,该蛋白基因编码673个氨基酸,预测分子量为17.06 k D,理论等电点为4.83,定位于细胞核,具有转录调控、生长因子、信号传导的功能,同源性分析结果表明,其碱基序列与已经报道的其他12个物种的相似率为76%-97%,且符合种属之间的进化关系。

关键词：乙肝相关性肝癌生物信息学分析 urg11 HBx

抗-urg11和抗-urg4单克隆抗体的制备及初步鉴定

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抗-URG11和抗-URG4单克隆抗体的制备及初步鉴定

作者：邹学第四军医大学

学位级别：硕士

【背景】urg11(up regulated gene 11)和urg4(up regulated gene 4)是近期发现的可以被乙肝病毒X(hepatitis B Virus x, HBx)蛋白上调的两个新基因。研究表明[1, 2]urg11不但可以增强细胞体外增殖能力、促进细胞在软琼脂中非锚定生长和... 详细信息

【背景】urg11(up regulated gene 11)和urg4(up regulated gene 4)是近期发现的可以被乙肝病毒X(hepatitis B Virus x, HBx)蛋白上调的两个新基因。研究表明[1, 2]urg11不但可以增强细胞体外增殖能力、促进细胞在软琼脂中非锚定生长和加快裸鼠体内成瘤,而且还可以通过上调β-连接蛋白(β-catenin)的表达参与肝细胞癌的发生。urg4 [3, 4]不仅可以增强细胞体外增殖能力、促进细胞在软琼脂中非锚定生长和加快裸鼠体内成瘤,而且还可以促进肝癌的形成和胃癌的发生。更重要的是urg11和urg4联合其它新克隆的基因可以提前3年预警肝癌的发生[5]。因此,进一步研究其功能具有重要的科学价值,但目前尚未有可用的针对urg11或urg4的单克隆抗体。【目的】通过人工合成多肽片段制备抗-urg11和抗-urg4单克隆抗体,并对所制备的单克隆抗体进行初步鉴定。【方法】(1)根据已发表的文献[1,3]通过人工合成多肽,并将此多肽分别连接钥孔戚血蓝素(简称:peptide-KLH)或牛血清蛋白(简称:peptide-BSA);(2)以peptide-KLH作为抗原免疫BALB/c小鼠;(3)取血清效价大于1:10000的小鼠的脾细胞与骨髓瘤细胞SP2/0进行融合,以peptide-BSA包被,通过酶联免疫吸附实验(ELISA)检测杂瘤细胞的上清进行筛选;阳性孔的杂交瘤细胞予保留,用有限稀释法进行三次克隆化,得到能稳定分泌单克隆抗体的杂交瘤细胞株;(4)应用所得的杂交瘤细胞株通过腹腔注射BALB/c小鼠以大量生产单克隆抗体;(5)通过鼠单克隆抗体亚类分型试剂盒鉴定单克隆抗体的亚类,采用蛋白质印迹法(Western blotting)和免疫组化方法证明新制备的单克隆抗体能识别目的蛋白。【结果】(1)得到一株能稳定分泌抗-urg11单克隆抗体的杂交瘤细胞株(3D2);应用蛋白质印迹法和免疫组化方法证明新制备的抗-urg11单克隆抗体能识别天然的urg11;此单克隆抗体的亚类为IgG2a/κ。(2)得到一株能稳定分泌抗-urg4单克隆抗体的杂交瘤细胞株(1A8);其分泌的单克隆抗体的亚类为IgG2a/κ;通过蛋白质印迹法和免疫组化方法证实新制备的抗-urg4单克隆抗体能识别天然的urg4。【结论】两株杂交瘤细胞株(3D2和1A8)都能稳定分泌目的单克隆抗体;蛋白印迹法和免疫组化方法证明新制备的两种单克隆抗体能分别识别自己天然的目的蛋白(urg11或urg4),为更好地研究urg11和urg4的生物学功能奠定了基础。

关键词： urg11 urg4 多肽单克隆抗体

沉默urg11基因对前列腺癌细胞功能的影响

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沉默URG11基因对前列腺癌细胞功能的影响

作者：邓志海暨南大学

学位级别：硕士

1.1背景和目的urg11在肝癌、胃癌、肺癌、甲状腺癌、膀胱癌等肿瘤组织证实比正常组织表达高[1-5],同时也在细胞生长增殖、细胞黏附、迁移、淋巴细胞转移、以及信号通路转导都有关键作用[6-9]。有研究通过si RNA技术干扰胃癌细胞urg11的... 详细信息

1.1背景和目的urg11在肝癌、胃癌、肺癌、甲状腺癌、膀胱癌等肿瘤组织证实比正常组织表达高[1-5],同时也在细胞生长增殖、细胞黏附、迁移、淋巴细胞转移、以及信号通路转导都有关键作用[6-9]。有研究通过si RNA技术干扰胃癌细胞urg11的表达,胃癌细胞的增殖和克隆形成能力受到明显抑制,而且还可显著削弱其在体外转移和侵袭能力,以及抑制在动物体内的成瘤性和生物学行为[10-14],肿瘤的生物学行为明显受到抑制。经过我们前期研究,证实了urg11在前列腺癌中比正常前列腺组织表达有差异,并且urg11表达强度与其在癌症的病理等级、分化程度、TNM及是否转移有密切关联。在前列腺癌细胞细胞系中urg11 m RNA及蛋白表达明显高于前列腺上皮细胞,且有显著性差异,在LNCa P系中表达异常最显著[15]。然而urg11在前列腺癌细胞生物学功能的影响尚未阐述,RNA干扰（RNAi）是一种新兴的的基因诊治方法,是指利用小RNA序列抑制特定基因信号序列,利用治疗序列的si RNA使细胞出现特定基因缺失,以达到某些实验或治疗目的,在肿瘤的基因诊治中有光明前途[10-14]。本课题拟拟运用细胞转染（慢病毒质粒）、Real-time-PCR和Western blot检测沉默urg11在前列腺癌细胞（LNCa P细胞系）表达特性及MTS/CCK-8法、流式检测技术、细胞迁移实验（划痕检测）及Transwell检测发探究沉默urg11基因后对于LNCa P细胞增殖、凋亡及侵袭力的生物学行为的改变影响,本研究采用RNAi方法干扰沉默urg11在前列腺癌细胞的中表达,明确其在PCa中发生、发展作用功能,阐明urg11在PCa中发病变机制,证实urg11基因可以作为PCa的基因治疗提供了一个新的潜在靶点,进一步证实urg11在PCa表达特性及基因靶向诊治有效性,为治疗PCa基因治疗提供新的路线和理论基础。1.2方法1.细胞培养,设计urg11si RNA干扰序列片段及反密码链（由sigma公司提供）、通过通过细胞转染技术筛选最合适的urg11si RNA及抑制适合浓度。根据文献我们设计urg11si RNA干扰片段（3对）,构建含urg11si RNA慢病毒质粒载体,将慢病毒载体质粒与LNCa P细胞混合培养,用慢病毒质粒感染LNCa P细胞,Real-time-PCR和Western blot鉴定有效的干扰载体及合适浓度。2.培养沉默良好的urg11的前列腺癌细胞株。利用筛选出urg11si RNA特异性干扰片段的质粒感染LNCa P细胞,用含空载质粒体的做对照,通过Real-time-PCR和Western blot测定干扰后urg11基因m RNA在细胞中的表达。3.沉默urg11对PCa细胞生物学行为改变的影响。MTS/CCK-8法检测沉默后列腺癌细胞增殖;FCM检测细胞方法检测沉默后生长周期及凋亡程度;迁移实验及Transwell小室检测沉默后侵袭及转移能力等其他生物学行为。1.3结果1.筛选urg11siRNA特异性干扰片段通过由sigma公司提供干扰序列片段及反密码链SASI-Hs01-00182412、SASI-Hs01-00182413、SASI-Hs01-0018241和空白UUCUCCGAACGUGUCACGUTT转染urg11高表达的前列腺癌LNCa P细胞,利用Real-time-PCR、Western blot及RNA Structure软件分析得出三条干扰片段各个浓度的urg11 m RNA表达能力显示:SASI-Hs01-00182413（50n M/ul）对细胞urg11 m RNA抑制能力是最高的,△Ct值分别为30.54±0.18、30.24±0.15、430.39±0.24;经2-△△Ct法计算处理,经过与空白组的对比,LNCa P前列腺癌细胞中urg11 m RNA表达抑制率高达78.25%,经方差分析F=952.12,P＜0.000,按α=0.05,具有统计学意义,三个干扰片段中SASI-Hs01-00182413（50n M/ul）具有良好的抑制urg11效果,SASI-Hs01-00182413片段干扰效率最高、最稳定及最有效浓度50n M/ul。2.培养沉默良好的urg11的前列腺癌细胞株将筛选的有效urg11si RNA干扰片段构建质粒转染LNCa P细胞株,Real-time-PCR和WB检测沉默后的LNCa P的细胞株,在LNCa P细胞urg11 m RNA抑制能力是最高的,△Ct值分别为31.62±0.15、30.76±0.11、31.19±0.18;经2-△△Ct法计算处理,经过与空白组的对比,LNCa P前列腺癌细胞中urg11 m RNA表达抑制率高达78.72%,在PC3前列腺癌细胞系

关键词： urg11 urg11siRNA 前列腺癌前列腺癌基因治疗

urg11基因介导Wnt/β-catenin信号通路调控EMT参与非小细胞肺癌转移的分子机制研究

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中国现代手术学杂志 2021年第4期25卷 239-245页

作者：刘哲亮彭豪邬娇李旭吴冠宇陈跃军王林纤郭慧李跃进中南大学湘雅医学院附属肿瘤医院湖南省肿瘤医院胸外科湖南长沙410013 湖南大学数学院湖南长沙410082 中南大学湘雅医学院附属肿瘤医院湖南省肿瘤医院麻醉科湖南长沙410013 中南大学湘雅医学院附属肿瘤医院湖南省肿瘤医院检验科湖南长沙410013 中南大学湘雅医学院附属肿瘤医院湖南省肿瘤医院病理科湖南长沙410013

目的探讨urg11基因介导的Wnt/β-Catenin信号通路调控EMT参与非小细胞肺癌转移的分子机制。方法非小细胞肺癌细胞系A549经shRNA质粒转染48h,敲除urg11后收集细胞行后续实验。实验共分两组,分别为敲除urg11的A549细胞组(实验组)和未敲除U... 详细信息

目的探讨urg11基因介导的Wnt/β-Catenin信号通路调控EMT参与非小细胞肺癌转移的分子机制。方法非小细胞肺癌细胞系A549经shRNA质粒转染48h,敲除urg11后收集细胞行后续实验。实验共分两组,分别为敲除urg11的A549细胞组(实验组)和未敲除urg11的A549细胞组(空白对照组)。采用Western blott测定β-Catenin及其下游基因cyclinD1、c-myc的蛋白表达,同时用RT-qPCR检测β-Catenin、cyclinD1和c-myc的mRNA表达。并用裸鼠成瘤模型评估urg11基因对NSCLC侵袭性生长的影响。结果①敲除urg11显著抑制Wnt/β-Catenin信号通路在NSCLC细胞中激活。Western blot蛋白质印迹分析显示β-Catenin、cyclin D1和c-myc的蛋白水平在敲除实验组中的表达显著低于对照组(DPI值分别为0.22±0.06 VS 0.77±0.21,0.61±0.09 VS 1.52±0.23,0.42±0.07 VS 0.84±0.14,Purg11显著减少异种移植肿瘤体在裸鼠体内侵袭性生长。通过裸鼠异种移植肿瘤模型动态观察了urg11对肿瘤的体内生长作用。与对照组相比,敲除urg11能显著抑制Balb/C裸鼠体内新生肿瘤的重量,第35天实验组VS对照组(0.21±0.04)g VS(0.58±0.08)g,Purg11能显著减少异种移植肿瘤的体积:第21、28、35天的新生瘤体体积,实验组VS对照组(258.33±0.24)mm^(3)VS(512.86±0.18)mm^(3),(414.59±0.17)mm^(3)VS(685.78±0.23)mm^(3),(423.21±0.36)mm^(3)VS(986.73±0.14)mm^(3),Purg11导致的EMT与NSCLC的发生和进展密切相关。

关键词：非小细胞肺癌 urg11 Wnt/β-catenin信号通路基因敲除 EMT

siRNA干扰urg11表达对骨肉瘤细胞系MG63的生物学功能和Wnt/β-catenin信号通路的影响

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国际生物医学工程杂志 2021年第6期44卷 430-435页

作者：董成功张蔚刘颖张明烟台市烟台山医院病理科 264002

目的探讨siRNA干扰urg11表达后骨肉瘤细胞系MG63的生物学功能和Wnt/β-catenin信号通路的变化。方法将体外培养的MG63细胞分为Control组(未转染)、NC-siRNA组(转染非特异性NC-siRNA)和urg11-siRNA组(转染urg11-siRNA),采用逆转录聚合酶... 详细信息

目的探讨siRNA干扰urg11表达后骨肉瘤细胞系MG63的生物学功能和Wnt/β-catenin信号通路的变化。方法将体外培养的MG63细胞分为Control组(未转染)、NC-siRNA组(转染非特异性NC-siRNA)和urg11-siRNA组(转染urg11-siRNA),采用逆转录聚合酶链式扩增(RT-PCR)检测各组细胞中urg11 mRNA的表达,分别用CCK-8法、Transwell实验和流式细胞仪检测细胞增殖、侵袭和凋亡,用Western blot法检测各组细胞中urg11蛋白以及Wnt/β-catenin信号通路中周期性调控因子D1(Cyclin D1)、原癌基因(c-Myc)、基质金属蛋白酶-2(MMP-2)和凋亡抑制基因(Survivin)的表达。结果与Control组相比,urg11-siRNA转染可使MG63细胞中urg11 mRNA和urg11、β-catenin、c-Myc、Cyclin D1、MMP-2、Survivin蛋白的表达水平降低,同时细胞增殖、侵袭能力显著减弱,细胞凋亡明显增强(均P0.05)。结论干扰urg11表达可抑制MG63细胞增殖和侵袭,并促进细胞凋亡,其作用机制可能与抑制Wnt/β-catenin信号通路的活化有关。

关键词：骨肉瘤 urg11 细胞增殖细胞侵袭细胞凋亡 Wnt/β-catenin信号通路

腺病毒介导的urg11RNAi抑制肝癌细胞生长及机制研究

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腺病毒介导的URG11RNAi抑制肝癌细胞生长及机制研究

作者：樊蕊第四军医大学

学位级别：硕士

urg11是利用抑制消减杂交及全长PCR扩增技术(RACE-PCR)克隆的一个可以被乙肝病毒X蛋白上调的新基因,编码70KD蛋白质。该蛋白含有2个VWFC结构域及一个C型凝集素结构域。VWFC结构域与细胞黏附、迁移、淋巴细胞的归巢及信号转导密切相关,而... 详细信息

urg11是利用抑制消减杂交及全长PCR扩增技术(RACE-PCR)克隆的一个可以被乙肝病毒X蛋白上调的新基因,编码70KD蛋白质。该蛋白含有2个VWFC结构域及一个C型凝集素结构域。VWFC结构域与细胞黏附、迁移、淋巴细胞的归巢及信号转导密切相关,而C型凝集素结构域参与细胞的增殖、分化。前期研究表明,urg11在肝癌等恶性肿瘤中高表达,并与肿瘤恶性程度相关。urg11还可促进肿瘤细胞增殖、分化,增强软琼脂克隆形成能力及癌细胞裸鼠体内成瘤能力,及通过上调β-桥连蛋白(β-catenin)的表达促进肿瘤细胞体外移动、黏附。另发现,它可增加细胞内游离钙离子浓度。因此,urg11是一个和肿瘤恶性生物学行为密切相关并具有重要功能的新基因,但是否可作为肝癌治疗,尤其腺病毒介导的基因治疗新靶点,有待进一步阐明。【目的】利用urg11及urg11-SiRNA腺病毒进行肝癌基因治疗实验,阐明urg11对肝癌细胞恶性生物学行为的影响,并初步探讨相应的分子机制。【方法】 1、构建urg11及urg11-SiRNA腺病毒载体;利用包装的腺病毒感染urg11高表达的人肝癌细胞系HHCC及urg11低表达的QZG细胞系,下调或上调其中urg11蛋白表达水平,利用Western blot方法进行检测;2、采用MTT法绘制感染细胞的生长曲线,流式细胞术检测感染细胞的凋亡及细胞周期分布情况;3、进行裸鼠体内成瘤实验和基因治疗实验,结合体外实验,进一步验证该基因功能;4、进行双向凝胶电泳等实验,筛选urg11促进肝癌细胞生长和转移的上下游分子。【结果】 1、urg11及urg11-SiRNA腺病毒包装及鉴定我们应用腺病毒载体购建试剂盒,成功构建并包装了urg11及urg11-SiRNA腺病毒(Ad-CMV、Ad-pi0为阴性对照),应用urg11-SiRNA腺病毒感染肝癌细胞HHCC,经Western Blot实验证实,可以有效降低urg11蛋白的表达水平,为下一步实验奠定基础。 2、腺病毒介导的urg11siRNA抑制肝癌细胞体外增殖首先应用Western Blot检测三种肝癌细胞系HHCC、SMMC7721、HepG2及人永生化肝细胞QZG中urg11蛋白表达情况,证实该蛋白在四种细胞均有不同程度表达,其中HHCC表达水平最高,而QZG表达水平最低;urg11-SiRNA腺病毒感染肝癌细胞HHCC后进行MTT实验发现,urg11蛋白表达水平下调明显抑制了肝癌细胞的生长(Purg11腺病毒感染QZG细胞可以促进细胞生长,造成细胞G1-S期阻滞并抑制凋亡(Purg11siRNA抑制肝癌细胞体内成瘤体内实验显示,用携带urg11-SiRNA的腺病毒与肝癌细胞HHCC细胞混合后注射裸鼠,可以通过下调urg11表达在一定程度上抑制HHCC细胞裸鼠体内成瘤能力;urg11-SiRNA腺病毒直接注入瘤体,可以明显减小肿瘤体积(Purg11上下游效应分子的筛选在相似条件下重复进行双向凝胶电泳实验,利用Melanie3 2-D分析软件分析,从蛋白双向电泳图谱中选取稳定差异表达的、大小集中在20kd至100kd之间的19个蛋白质斑点进行切割,经过脱银、蛋白酶消化后,进行飞行质谱检测,得到肽质量指纹图谱。经过软件分析,成功确定了6个差异表达蛋白,为钙离子调节或与肿瘤细胞运动相关的蛋白。其作用机理有待进一步深入研究。【结论】本研究成功构建并包装了urg11及urg11-SiRNA腺病毒,应用病毒进行体内体外实验,在肝癌中证实urg11促进肿瘤生长转移的功能,并进行了肝癌基因治疗的初步尝试。筛选得到一系列与肿瘤细胞生长运动相关的urg11上下游分子,为进一步研究该基因功能奠定基础。

关键词： urg11 肝癌腺病毒增殖转移肿瘤基因治疗双向凝胶电泳