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An Integrated Study for the Utilization of Anthraquinone Compounds Extract“Heshouwu”In vivo and their Comparative Metabolism in Liver Microsomes Using uplc-ESI-Q-TOF/ms^(n)

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World Journal of Traditional Chinese Medicine 2018年第1期4卷 21-27页

作者： Sha Chen Hong-Yu Ma Zhe Deng Jun Zhang Jin-Tang Cheng Chang Chen An Liu Key Laboratory of Beijing for Identification and Safety Evaluation of Chinese Medicine Institute of Chinese Materia MedicaChina Academy of Chinese Medical Sciences

Objective: Anthraquinone(AQ), a major bioactive component of the traditional Chinese medicine He ShouW u, has widespread applications in industry and medicine. The objective of the current study is to explore the differences in the bioavailability of anthraquinones in vivo and the metabolism in liver microsomes. Materials and Methods: In vivo, we used a reliable uplc?ESI?Qq Q?ms/ms method to measure seven AQ compounds in the jugular vein plasma of rats following oral administration of He Shou Wu. Furthermore, in order to quantify the bioavailability of AQs in vivo and to further understand the metabolism of these compounds, we compared the in vitro metabolism of AQ in different species with respect to metabolic profiles, the enzymes involved, and catalytic efficiency using liver microsomes from human(HLM), mouse(MLM), rat(RLM), and beagle dog(DLM). Results: We identified two metabolic pathways, including the hydroxylation and glucuronidation of AQ, in the liver microsomes of humans and other species using uplc?ESI?Q?TOF. We found that substitutions on the AQ ring were crucial to the activity and regioselectivity of its hydroxylation. In general, hydroxylation activity decreased greatly with β?COOH(rhein) and enhanced dramatically with β?OH(emodin). We also found that glucuronidation of the compound emodin?8?O?β?D?glucoside acts as the main isoform in AQ hydroxylation in HLM and DLM. Total microsomal intrinsic clearance values for AQ were greatest in mouse microsomes, followed by those in dog, human, and rat microsomes. Conclusion: The absorption of different anthrquinone compounds varied based on the compound structure, the metabolism types and products of anthraquinones in liver microsomes were different in different species. These findings provide vital information for a deeper unuunderstanding of the metabolism of AQs.

关键词： Anthraquinones liver microsomes uplc-qqq-ms/ms uplc-Q-TOF/ms

uplc-ms/ms超痕量分析美洛西林及舒巴坦中基因毒性杂质方法研究

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UPLC-MS/MS超痕量分析美洛西林及舒巴坦中基因毒性杂质方法研究

作者：陈苑秋暨南大学

学位级别：硕士

目的:使用超高效液相色谱与三重四级杆质谱联用技术(uplc-qqq-ms/ms),针对美洛西林原料中的酰氯基因毒性杂质及舒巴坦原料中的两个溴代基因毒性杂质,分别建立灵敏度高、特异性强且准确度高的超痕量分析方法。方法:(1)使用基于规则模型... 详细信息

目的:使用超高效液相色谱与三重四级杆质谱联用技术(uplc-qqq-ms/ms),针对美洛西林原料中的酰氯基因毒性杂质及舒巴坦原料中的两个溴代基因毒性杂质,分别建立灵敏度高、特异性强且准确度高的超痕量分析方法。方法:(1)使用基于规则模型和统计模型的计算机评估系统(Tox Tree及VEGA)对美洛西林及舒巴坦原料中含基因毒性警示结构的化合物进行致突变及致癌性预测,确定需要重点研究的基因毒性杂质及控制限度;(2)根据美洛西林中酰氯基因毒性杂质的特性,制定衍生化路线,制备衍生产物对照品,并使用LC-HRms/ms、NMR、IR等技术进行结构及纯度确定;(3)应用Qb D理念及BBD方法分别建立及优化uplc-qqq-ms/ms酰氯及溴代基因毒性杂质痕量分析方法;(4)证明所开发的方法灵敏、可靠。结果:(1)计算机评估软件预测合成美洛西林时使用到的重要原料1-氯甲酰基-3-甲磺酰基-2-咪唑烷酮,及舒巴坦杂质C和杂质D开环后形成的化合物具有致癌性及致突变性;(2)通过优化美洛西林酰氯杂质的衍生化条件,确定酰氯杂质与衍生剂甲醇在35℃下反应45min为最佳反应条件;(3)建立美洛西林酰氯基因毒性杂质的检测方法,选择C18色谱柱(2.1×100mm,2.6μm),柱温:30℃,样品盘温度:8℃,流动相A:0.1%甲酸-水,流动相B:乙腈,流速:0.2ml/min,进样量:20μl,使用ESI+模式,碰撞能:23V,鞘气流速:23arb,喷雾温度:100℃,检测离子对:223.0 m/z→79.0 m/z;(4)建立舒巴坦溴代基因毒性杂质的检测方法,选择C18色谱柱(4.6×250mm,5μm),样品盘温度:8℃,流动相A:0.1%甲酸-水,流动相B:乙腈,流速:1.0ml/min,进样量:20μl,使用ESI-模式,碰撞能:24V,鞘气流速:50arb,喷雾温度:216℃,SBT-C检测离子对:309.9 m/z→78.9 m/z,SBT-D检测离子对:277.9 m/z→136.9 m/z;(5)对上述方法进行考察,美洛西林酰氯基因毒性杂质的检测限和定量限分别为14ppb、20ppb,舒巴坦溴代基因毒性杂质的检测限和定量限分别为5ppb、25ppb,各项指标表明建立的方法灵敏且准确可靠。结论:本课题建立的对美洛西林中酰氯基因毒性杂质及舒巴坦中溴代基因毒性杂质痕量分析方法,灵敏度高、特异性强且准确度高,能够为美洛西林及舒巴坦原料中基因毒性杂质含量的控制提供技术支持,以及为其检测标准的制定提供有价值的参考。

关键词：美洛西林舒巴坦基因毒性杂质 uplc-qqq-ms/ms (Q)SAR QbD BBD

不同部位和不同产地加工方法的知母质量评价研究

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中草药 2021年第22期52卷 6990-6997页

作者：赵小勤黄晓婧罗霄高鹏许莉成都市药品检验研究院国家药监局中药材质量监测评价重点实验室四川成都610045

目的采用uplc-qqq-ms/ms法同时测定不同部位和不同产地加工方法知母Anemarrhenae Rhizoma中9个成分的含量,并比较其差异。方法采用Waters ACQUITY uplc BEH C18色谱柱(100 mm×2.1 mm,1.7μm),流动相为0.01%甲酸溶液(A)-乙腈(B),梯度洗... 详细信息

目的采用uplc-qqq-ms/ms法同时测定不同部位和不同产地加工方法知母Anemarrhenae Rhizoma中9个成分的含量,并比较其差异。方法采用Waters ACQUITY uplc BEH C18色谱柱(100 mm×2.1 mm,1.7μm),流动相为0.01%甲酸溶液(A)-乙腈(B),梯度洗脱,体积流量0.4 mL/min,进样量2μL,柱温30℃;质谱采用电喷雾离子源、负离子模式(ESI-),多反应监测(multiple reaction monitoring,MRM)。结果知母中新芒果苷、芒果苷、异芒果苷、知母皂苷AⅡ、知母皂苷AⅢ、知母皂苷BⅡ、知母皂苷BⅢ、知母皂苷E1、知母皂苷Ⅰ 9个成分在各自范围内呈良好的线性关系,加样回收率97.23%~100.76%。知母的5个不同部位中知母须根中芒果苷、异芒果苷的含量最高;知母肉中知母皂苷E1、知母皂苷BⅡ、知母皂苷Ⅰ含量最高;知母头与知母片、知母肉成分差异较小。比较知母的不同产地加工方法,趁鲜切片新芒果苷和知母皂苷BⅡ的含量较高,润切片芒果苷和知母皂苷AⅢ的含量较高。结论知母须根具有一定的开发利用价值,知母肉具有其存在的合理性;知母产地加工,可不切去知母头,以减少工序,提高知母根茎的综合利用率;趁鲜切片可加速干燥,降低饮片霉变风险。

关键词：知母 uplc-qqq-ms/ms 新芒果苷芒果苷异芒果苷知母皂苷AⅡ 知母皂苷AⅢ 知母皂苷BⅡ 知母皂苷BⅢ 知母皂苷E1 知母皂苷Ⅰ

苦参不同组织中生物碱类成分的LC-ms分析

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中草药 2023年第8期54卷 2388-2397页

作者：张晓雪杜宇张泽坤王雯静张蓓蓓张明亮海丽娜王阳葛祥宇史社坡北京中医药大学中药学院中药现代研究中心北京100029 北京振东光明药物研究院有限公司北京100085

目的通过对苦参Sophora flavescens不同组织样品中生物碱类成分的LC-ms分析,探讨苦参中生物碱类成分的质谱裂解规律及其在不同样品中的异同。方法首先利用uplc-Q-Exactive-Orbitrapms对5年生苦参根中的生物碱类成分进行全面的鉴定分... 详细信息

目的通过对苦参Sophora flavescens不同组织样品中生物碱类成分的LC-ms分析,探讨苦参中生物碱类成分的质谱裂解规律及其在不同样品中的异同。方法首先利用uplc-Q-Exactive-Orbitrapms对5年生苦参根中的生物碱类成分进行全面的鉴定分析。再利用uplc-qqq-ms/ms技术,对苦参无菌幼苗不同组织部位(根、茎、叶)、苦参愈伤组织中的生物碱类成分进行定量分析,比较各样品中生物碱类成分的异同。结果从5年生苦参根中共鉴定出47个生物碱类成分;利用uplc-qqq-ms/ms对其中17个主要的生物碱类成分进行了定量分析,发现不同苦参样品中生物碱类成分差异明显,其中苦参无菌幼苗各组织部位中生物碱的含量相对较高。结论建立了一种苦参生物碱类成分快速定性定量分析方法,从5年生苦参根中快速鉴定出47种生物碱;通过对苦参不同组织样品中17个生物碱类成分的定量分析,为后续利用比较转录组测序技术,挖掘并鉴定苦参中生物碱类成分生物合成关键酶的研究奠定基础。

关键词：苦参生物碱定性定量分析 uplc-Q-Exactive-Orbitrap ms uplc-qqq-ms/ms

柚果实不同成熟期主要营养功能成分的变化规律

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柚果实不同成熟期主要营养功能成分的变化规律

作者：张念西南大学

学位级别：硕士

柚类作为柑橘重要的品种之一,营养丰富且口感佳,富含芳香挥发物、黄酮类化合物、酚酸、香豆素、类柠檬苦素和生物碱等功能成分,具有降血脂、降血糖、抗氧化、抗菌、抗炎和抗癌等生物活性。这些生物活性物质,在柚类不同部位、不同成熟期... 详细信息

柚类作为柑橘重要的品种之一,营养丰富且口感佳,富含芳香挥发物、黄酮类化合物、酚酸、香豆素、类柠檬苦素和生物碱等功能成分,具有降血脂、降血糖、抗氧化、抗菌、抗炎和抗癌等生物活性。这些生物活性物质,在柚类不同部位、不同成熟期其组成有着很大的差异。因此,系统研究柚果不同成熟期、不同部位中主要营养功能成分的变化,对开展柚子资源化加工及相关功能成分食品的开发利用有着重要意义。本研究选取了西南地区常见6种柚果(东风早柚、长寿沙田柚、琯溪蜜柚、丰都红心柚、梁平柚、龙安柚),对其不同成熟期、不同部位中主要营养功能成分进行分析检测,比较了不同成熟期不同部位中理化指标和功能成分的组成和差异,旨在为柚果中营养功能成分的研究提供数据支持和科学依据,主要研究内容如下:(1)对6种柚果不同成熟期的基本理化品质进行了分析和检测,并重点比较了不同成熟期果汁中主要功能成分(Vc、类黄酮、酚酸、香豆素、类柠檬苦素)的组成和差异。结果表明:柚果实的单果重、横径和纵径、出汁率、可食率和可溶性固形物随着成熟期的延长而增加,而果皮厚度和可滴定酸含量显著下降;随着成熟期的延长,6种柚果的Vc含量均呈现先升高后降低的趋势;柚果汁中类黄酮以柚皮苷为主,呈现降低的趋势;酚酸以阿魏酸(肉桂酸型)为主,呈现降低的趋势;柚果汁香豆素含量较低,以6’,7’-二羟基香柠檬亭和橙皮内酯水合物为主,在不同品种中变化规律有较大差异;类柠檬苦素随着成熟期呈现先上升后下降的趋势,其中柠檬苦素在9月达到最高值;番茄红素只在丰都红心柚和龙安柚有检出,且随着成熟期延长呈现上升的趋势,均在11月左右含量达到最高。(2)基于uplc-Qq Q-ms/ms方法对6种柚果不同成熟期不同部位(外皮层、内皮层和果肉)中87种功能成分(包括43种类黄酮、8种酚酸、27种香豆素、3种类柠檬苦素和6种生物碱)进行靶向筛查和定量分析。结果表明,累计检出75种功能成分。同一成熟期,6种柚果中不同部位功能成分的种类数大部分呈现以下规律:外皮层>内皮层>果肉。柚皮苷、野漆树苷、维采宁-2等17种类黄酮、香草酸和咖啡酸等两种酚酸、柠檬苦素、辛弗林和酪胺等两种生物碱在不同成熟阶段不同部位中均有检出。通过统计、聚类分析对主要26种功能成分的含量进行比较:柚果类黄酮以柚皮苷、维采宁-2和野漆树苷最为丰富,含量呈现内皮层>外皮层>果肉的规律;外皮层和果肉中香草酸和阿魏酸含量较高,内皮层中对羟基苯甲酸含量较高;6’,7’-环氧香柠檬亭、6’,7’-二羟基香柠檬亭、橙皮内酯水合物和橙皮内酯等香豆素含量较高;类柠檬苦素以柠檬苦素和诺米林为主。随着成熟期的延长,果肉中柚皮苷呈现下降的趋势,与果汁的变化规律吻合,而在外皮层和内皮层中呈现先升高后下降的趋势;野漆树苷和维采宁-2在三个部位均呈现下降的趋势;柠檬苦素和诺米林在果肉中也呈现先升高后降低的趋势;6’,7’-环氧香柠檬亭、6’,7’-二羟基香柠檬亭、橙皮内酯水合物、橙皮内酯、蛇床子素等香豆素呈现下降的趋势。酚酸的变化规律较为复杂:如香草酸在东风早柚、梁平柚、丰都红心柚、龙安柚果肉中呈现先上升后下降的趋势,而在琯溪蜜柚、长寿沙田柚果肉中呈现下降的趋势;p-香豆酸在长寿沙田柚、梁平柚呈现先升后降的趋势,在东风早柚、琯溪蜜柚、丰都红心柚、龙安柚呈现下降的趋势。采用聚类分析对柚中26种功能成分进行分析,结果表明,8月和9月代谢积累相近,10月和11月代谢积累相近,6月时功能成分含量与其他成熟阶段差异大。(3)采用HS-SPME-GC-ms对6种柚果不同成熟期外皮层中的挥发性物质进行分析检测,累计检测出萜烯类、醛类、醇类、酮类、酯类等54种物质。利用PCA、OPLS-DA等化学计量方法进行模型的构建与验证,结合单变量分析法T检验和变量重要性投影指标(VIP值),选择VIP>1、P值<0.05为标准,筛选柚果外皮层不同成熟期的差异代谢物。结果表明,6种柚果不同成熟期外皮层中的挥发性物质主要以柠檬烯、月桂烯、β-蒎烯和α-蒎烯为重要的差异代谢物。

关键词：柚功能成分挥发性成分不同成熟期 uplc-qqq-ms/ms

不同等级和储藏时间白茶主要化学品质成分分析

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不同等级和储藏时间白茶主要化学品质成分分析

作者：丁玎安徽农业大学

学位级别：硕士

白茶是我国特有的茶叶种类,是六大茶类之一,主产于福建省。白茶在加工过程中不炒不揉,形成的独特品质深受国内外消费者的喜爱。长期以来,研究者关注的重点是白茶药用价值和健康功效,有关其化学品质方面缺乏系统的研究。本研究以福鼎和... 详细信息

白茶是我国特有的茶叶种类,是六大茶类之一,主产于福建省。白茶在加工过程中不炒不揉,形成的独特品质深受国内外消费者的喜爱。长期以来,研究者关注的重点是白茶药用价值和健康功效,有关其化学品质方面缺乏系统的研究。本研究以福鼎和政和地区共25个白茶样为试验材料,利用高效液相色谱(HPLC)技术,对相同生产厂家、同一年份的不同等级白茶以及相同生产厂家、同一等级的不同储藏时间白茶中水浸出物、多酚类、生物碱类和氨基酸的变化规律进行分析;采用同时蒸馏萃取法提取、气相色谱-质谱联用技术(GC-ms)分析不同等级和不同储藏时间白茶中挥发性成分;利用超高效液相色谱—三重四级杆串联质谱(uplc-qqq-ms/ms)技术对白茶中主要化学成分进行定性鉴定和验证,分析原料等级和储藏时间对白茶化学品质的影响。研究结果对于指导企业进行标准化生产加工、科学饮茶具有重要的指导意义,结果如下:(1)不同等级白茶主要化学成分存在差异。随等级降低,白茶中水浸出物含量、儿茶素总量、酯型儿茶素含量和三种生物碱含量均逐渐降低,非酯型儿茶素含量先升高后降低,在各等级福鼎白茶中,贡眉茶氨酸含量显著高于其他等级,政和白茶中,白牡丹茶氨酸含量显著高于其他等级,氨基酸总量均以贡眉含量最高。各等级白茶GC-ms分析结果表明,不同等级白茶中共鉴定出51种挥发性物质,其中白牡丹中醇类、醛类、酯类、酸类以及挥发性物质总量最高。醇类和醛类是白茶的主体香气成分,其中以芳樟醇及其氧化物和2-己烯醛为主要香气组分。(2)白茶在储藏过程中,主要化学成分发生了变化。随储藏时间增加,水浸出物和儿茶素含量整体呈降低趋势,而没食子酸含量和生物碱类含量均显著升高,氨基酸总量整体呈降低趋势,但部分氨基酸含量在短期储藏过程中有所增加,尤其是蛋氨酸含量。在不同储藏时间寿眉中共检测出56种挥发性物质,主体香气成分仍以醇类和醛类为主。随着储藏时间的延长,除酸类成分外,各类成分含量均有所降低,陈20年白茶中棕榈酸、三甲基硅酯棕榈酸、雪松醇、刺柏烯和大根香叶烯D等含量较高。(3)定性分析了白茶中主要化学成分。利用uplc-ms/ms技术对白茶中主要化学成分进行了定性分析,共得到29个峰,鉴定出22种化合物。当年生产的白毫银针内含物丰富。储藏20年白茶中可可碱含量显著增加。

关键词：白茶等级储藏时间化学成分 GC-ms uplc-qqq-ms/ms

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金柑果实次生代谢产物的检测及差异研究

金柑果实次生代谢产物的检测及差异研究

作者：郭鹏妹西南大学

学位级别：硕士

柑橘(Citrus),作为中国消费量最高、种植面积最广、产量最大的水果,包括枸橼、柚、宽皮柑橘、橙、枳等品种。中国是全世界柑橘的重要产地,有着4000多年的栽培历史,主要产地包括广西、湖南、湖北、江西、广东、四川、重庆、福建、浙江、... 详细信息

柑橘(Citrus),作为中国消费量最高、种植面积最广、产量最大的水果,包括枸橼、柚、宽皮柑橘、橙、枳等品种。中国是全世界柑橘的重要产地,有着4000多年的栽培历史,主要产地包括广西、湖南、湖北、江西、广东、四川、重庆、福建、浙江、云南和贵州11个省市区。金柑(Fortunella),属于芸香科(Rutaceae)柑橘亚科(Aurantioideae)柑橘族(Citreae)柑橘亚族(Citrinae)真正柑橘类植物(True Citrus Fruit Trees),是我国的特产果树之一,果实皮肉同食,味道鲜美,营养丰富,气味芬芳,受到人们的广泛喜爱,包括罗浮(*** Swingle)、山金柑(*** Swingle)、罗纹(*** Swingle)和金弹(*** Swingle)等品种。除糖、酸、维生素等营养物质外,金柑果实也富含类黄酮、类柠檬苦素、生物碱、香豆素等次生代谢产物,这些次生代谢产物在抗氧化、抗衰老、抗癌、消炎、抗菌和杀虫等方面具有显著作用。因此,全面、系统地分析金柑果实中的次生代谢产物具有重要意义。本文主要基于超高效液相色谱串联三重四级杆质谱(uplc-Qq Q-ms/ms)平台建立了一种新方法,用于快速靶向筛查和定量分析柑橘中的类黄酮、酚酸、类柠檬苦素、生物碱和香豆素,并准确测定了16种金柑果实中66种次生代谢产物的含量,此外,基于超高效液相色谱串联四极杆-飞行时间质谱(uplc-QTOF-ms/ms)平台对16种金柑果实中的次生代谢产物进行非靶向代谢组学研究。具体的研究内容如下:1.基于uplc-Qq Q-ms/ms建立了一种高效,快速的检测方法,可在15 min内筛查和定量金柑果实中31种类黄酮、8种酚酸、3种类柠檬苦素、5种生物碱和19种香豆素。对洗脱梯度、流动相等液相条件和前体离子、产物离子等质谱参数进行优化,该方法可在15 min内成功定量66种次生代谢产物,包括12组同分异构体。经方法学验证得知该方法具有良好的线性关系,灵敏度,准确度和精密度:66种物质的线性相关系数均大于0.99;添加水平为10.0μg·L时,回收率在71.45%至118.02%内,添加水平为50.0μg·L时,回收率在73.26%至115.75%内;日间的相对标准偏差(RSD)小于5.86%,日内RSD小于5.60%;除章鱼胺的检出限(LOD)为9.57μg·L以及定量限(LOQ)为21.85μg·L外,其他物质的LOD在1.25 ng·L和3.66μg·L之间,LOQ在4.18 ng·L和12.50μg·L之间。此外,本章节还对次生代谢产物的前处理条件进行了优化,以66种次生代谢产物的总含量为标准,通过优化提取剂体积和提取次数获得最佳条件:5.0 g待测样品,提取剂甲醇的体积为15.0 m L,提取时间为30 min,次数为2次。综上,本研究建立的检测方法效率高,选择性好,灵敏度高,分析时间短,分析物种类和数量多,可成功用于金柑果实中次级代谢产物的靶向筛选和定量。2.基于建立的uplc-Qq Q-ms/ms方法,对16种金柑果实中的66种次生代谢产物进行靶向筛查和定量分析,通过统计、聚类分析等方法对16种金柑果实中31种类黄酮、8种酚酸、3种类柠檬苦素、5种生物碱、19种香豆素的含量进行多角度分析比较和研究。统计分析结果表明,在测定的31种类黄酮中,大部分金柑果实中的黄酮占类黄酮总量的比例最高,黄烷酮次之,其中,牡荆素鼠李糖苷、金合欢素和维采宁-2为16种金柑果实中含量较高的类黄酮。在测定的8种酚酸中,金豆中的阿魏酸含量最高,金柑杂种中绿原酸含量最高,其他金柑中芥子酸最高。金柑果实中类柠檬苦素含量大小均为柠檬苦素>诺米林>黄柏酮。本研究首次对不同金柑果实中的生物碱和香豆素进行了定量分析,酪胺、N-甲基酪胺、甜菜碱、章鱼胺、大麦芽碱、滨蒿内酯、橙皮内酯水合物、异橙皮内酯等在所有金柑果实中均有检出,金豆和野生金豆中的香豆素含量显著高于其他金柑,所有金柑果实中的生物碱均以N-甲基酪胺和酪胺为主。采用聚类分析对金柑果实中66种次生代谢产物的进行分析,结果表明,金柑属的金弹、罗浮和罗纹代谢积累模式相近,山金柑和属间杂种之间差异较大。3.代谢组学是一种通过分析外部刺激后生物体系内代谢产物的全面变化,从而对生物体的生理和病理状态进行研究的方法。本章节为寻找不同种类金柑果实的差异代谢物,基于uplc-QTOF-ms/ms对16种金柑果实进行非靶向的代谢组学研究。结果如下:通过uplc-QTOF-ms/ms平台采集16种金柑果实甲醇提取物的数据,采用质量控制(QC)样品穿插进样用于评价系统的稳定性。正、负离子模式下RSD≤30%的峰个数占所有峰的91.09%和83.32%,采用主成

关键词：金柑 uplc-qqq-ms/ms uplc-QTOF-ms/ms 次生代谢产物

杜仲内生真菌的分离、筛选及促生菌株Y232活性解析

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杜仲内生真菌的分离、筛选及促生菌株Y232活性解析

作者：李欣悦东北林业大学

学位级别：硕士

杜仲(Eucommia ulmoides Oliv.),为杜仲科杜仲属植物,分布于陕西、甘肃、河南等省区,具有药用、食用价值,同时也具有极高的工业价值,是中国特有多用途树种。但杜仲栽培困难、产量低,并且最具药用价值的树皮很难再生,制约了杜仲的产业化... 详细信息

杜仲(Eucommia ulmoides Oliv.),为杜仲科杜仲属植物,分布于陕西、甘肃、河南等省区,具有药用、食用价值,同时也具有极高的工业价值,是中国特有多用途树种。但杜仲栽培困难、产量低,并且最具药用价值的树皮很难再生,制约了杜仲的产业化发展。多年来,杜仲种植一直依赖于化肥,以期获得尽可能高的单位面积产量,但过量使用化肥导致土壤盐碱化、重金属积累、水体富营养化和硝酸盐积累。目前药用植物增产与改善品质的重要趋势在于减少化肥使用,并且探索环境友好型生物菌剂。使用以植物促生真菌为原料制成的生物肥料替代化肥是一种可行的策略,其具有安全、有效、环保等优点。目前,杜仲的内生真菌资源尚未被充分开发。本研究旨在分离鉴定杜仲内生真菌的基础上,筛选出具有强促生活性的功能菌株,对其促生功能进行深入研究,为开发高效生物菌剂提供科学依据。具体研究结果如下:对杜仲叶、皮、茎、枝中的内生真菌进行分离纯化得到了37株杜仲内生真菌。其中叶中分离得到14株,皮中分离得到10株,茎中分离得到3株,枝中分离得到10株。通过对分离菌株进行形态观察及使用光学显微镜观察其孢子形态,并结合r DNA-ITS基因序列与进化树分析,表明37株菌分布于8个种属,分别为镰刀菌属(Fusarium sp.)、拟茎点霉属(Phomopsis sp.)、木霉属(Trichoderma sp.)、链格孢属(Alternaria sp.)、曲霉属(Aspergillus sp.)、弯孢菌属(Curvularia sp.)、烟管菌属(Bjerkandera sp.)和附球菌属(Epicoccum sp.)。对分离得到的杜仲内生真菌进行固氮、溶磷、产氨、产吲哚乙酸(IAA)、产水解酶(淀粉酶、蛋白酶、果胶酶)、抑制病原细菌和病原真菌生长等体外促生活性筛选。结果表明,9株内生真菌具有固氮活性,3株内生真菌具有溶磷活性,10株内生真菌可以产氨,7株内生真菌可以产IAA;7株内生真菌具有产淀粉酶活性,6株内生真菌具有产蛋白酶活性,8株内生真菌具有产果胶酶活性;37株内生真菌中,有15株内生真菌具有对粪肠球菌、白色念珠菌、腐皮镰孢菌、向日葵核盘菌等病原菌具有抑菌效果。通过对体外促生活性的综合分析,Y232是杜仲内生真菌中具有强促生活性的功能菌株。为了明确Y232菌株发挥促生活性的物质基础,采用uplc-qqq-ms/ms对促生菌Y232发酵液萃取物的内源植物激素进行提取鉴定与分析检测。结果表明,Y232能够分泌玉米素(ZT)、吲哚乙酸(IAA)、水杨酸(SA),含量分别为0.14μg/m L、0.88μg/m L、0.53μg/m L。同时对Y232菌株非核糖体肽类合成酶(NRPS)和聚酮类合成酶(PKS)的基因片段进行PCR扩增,结果在Y232中成功扩增出NRPS与PKS的基因片段,表明Y232代谢产物中非核糖体肽类与聚酮类抗生素可能是其发挥抑菌效果的主要成分,初步明确了Y232菌株发挥抑菌作用的分子基础。为进一步验证Y232的促生活性,采用盆栽实验方法,以杜仲和玉米为实验材料,利用浓度为1×10～6CFU/m L Y232菌悬液分别处理杜仲种子、两年生盆栽杜仲、玉米种子、玉米盆栽苗,评价其对于植物生长发育及品质的影响。结果表明,经Y232菌悬液处理过的杜仲种子,14天后其出苗率、芽长、根长、幼苗的鲜重与干重与对照相比均有显著提高(Puplc-qqq-ms/ms检

关键词：杜仲植物内生真菌内源激素 uplc-qqq-ms/ms 药材品质