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甘姜苓术汤治疗类风湿关节炎的药效物质基础及作用机制研究

甘姜苓术汤治疗类风湿关节炎的药效物质基础及作用机制研究

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作者：蒋叶坷安徽中医药大学

学位级别：硕士

目的:类风湿关节炎(rheumatoid arthritis,RA)是一种慢性炎症性关节疾病,严重影响患者生活质量并可能导致残疾。经典名方甘姜苓术汤因具有散寒除湿、通痹止痛的功效,临床常在此方基础上加减或联合用药治疗类风湿关节炎。目前,有关甘姜... 详细信息

目的:类风湿关节炎(rheumatoid arthritis,RA)是一种慢性炎症性关节疾病,严重影响患者生活质量并可能导致残疾。经典名方甘姜苓术汤因具有散寒除湿、通痹止痛的功效,临床常在此方基础上加减或联合用药治疗类风湿关节炎。目前,有关甘姜苓术汤的药效物质基础及作用机制的研究较少。本研究采用质谱技术探究甘姜苓术汤的体内外化学成分并结合网络药理学进一步阐述甘姜苓术汤治疗类风湿关节炎的作用靶点与通路,通过动物体内实验验证探讨其治疗疾病的作用机制,为经典名方甘姜苓术汤的临床应用提供科学依据。方法:1.甘姜苓术汤体内外化学成分研究本研究采用uplc-qe-ms技术对甘姜苓术汤的体外化学成分及大鼠入血原型成分进行鉴定分析,并结合中药化学数据库进行比对。首先,将SD大鼠随机分为正常组和给药组,每组6只。给药组每天灌胃36g/kg甘姜苓术汤,连续灌胃3天。末次给药后分别在15min、30min、1h、2h、4h、6h、8h、12h从大鼠眼眶中取血,制备血清样品。随后,采用uplc-qe-ms技术检测空白血清和含药血清样品,利用Xcalibur软件(Thermo Fisher Scientific)处理空白血样与给药组血样数据,扣除空白血清内源性成分,结合体外化学成分鉴定结果,比对离子峰的保留时间、质荷比及二级特征碎片离子,同时结合数据库及文献信息分析鉴定甘姜苓术汤的入血原型成分。2.甘姜苓术汤作用于类风湿关节炎的网络药理学研究根据鉴定出的入血原型成分对甘姜苓术汤进行网络药理学研究,利用Pharm Mapper、Swiss Target Prediction数据库检索入血原型成分的作用靶点,利用Gene Cards、GEO数据库查找类风湿关节炎的作用靶点,取入血原型成分的作用靶点与疾病靶点的交集靶点作为甘姜苓术汤治疗类风湿关节炎的潜在靶点,借助String数据库构建交集靶点蛋白互作网络,运用Cytoscape3.7.1软件筛选关键靶点基因,并构建成分-靶点-通路网络图,利用DAVID数据库对交集靶点进行GO功能富集和KEGG通路富集分析,利用Swiss Dock在线网站对筛选出的排名前3的关键靶点和关键成分进行分子对接验证。3.甘姜苓术汤对类风湿关节炎大鼠的干预作用建立弗氏完全佐剂诱导的关节炎(AA)大鼠模型,给予甘姜苓术汤和甲氨蝶呤,观察并记录大鼠体重、关节炎指数和足肿胀度,采用HE染色对各组大鼠踝关节进行组织病理学考察,酶联免疫吸附法检测各组大鼠血清中TNF-α、IL-1β炎症因子水平,通过RT-q PCR实验和Western-blot实验检测各组大鼠滑膜组织中与PI3K/AKT信号通路相关的基因、蛋白的表达水平。结果:1.甘姜苓术汤体内外化学成分研究运用uplc-qe-ms技术在甘姜苓术汤中共鉴定出104个化合物,包含41个黄酮类化合物、18个酚酸类化合物、16个萜类化合物、8个苯丙素类化合物、5个生物碱类化合物、3个脂肪酰类、5个氨基酸类和8个其他类化合物。通过比对甘姜苓术汤体外化学成分及大鼠空白血清中的内源性成分,在口服甘姜苓术汤的大鼠血清中共鉴定得到38个入血原型成分,其中大部分为黄酮类化合物。2.甘姜苓术汤作用于类风湿关节炎的网络药理学研究以甘姜苓术汤的38个入血原型成分为研究对象进行网络药理学分析,利用Pharm Mapper、Swiss Target Prediction数据库共获得入血原型成分靶点957个。GEO数据库中以GSE55457为数据集获得665个疾病基因,其中430个上调基因,235个下调基因,Genecards数据库获得1276个靶点,删除两个疾病数据库中的重复基因共获得1821个疾病靶点,两者取交集获得327个交集靶点。利用Cytoscape3.7.1软件筛选出PIK3R1、SRC、MAPK1等靶点可能是甘姜苓术汤治疗类风湿关节炎的关键靶点,6-姜烯酚、异甘草素、异甘草香豆素可能是发挥药效的关键成分。分子对接结果表明排名前3的核心靶点和关键成分具有较好的对接活性,KEGG通路富集分析结果表明,甘姜苓术汤可能通过影响PI3K/AKT信号通路、MAPK信号通路、Ras信号通路等发挥对类风湿关节炎的治疗作用。3.甘姜苓术汤对类风湿关节炎大鼠的干预作用甘姜苓术汤可改善AA大鼠滑膜组织增生、关节内炎性细胞浸润,降低AA大鼠血清中IL-1β、TNF-α炎症因子水平,抑制AA大鼠滑膜组织中PI3K、AKT m RNA的表达和PI3K、p-AKT蛋白的表达。结论:1.分析出的入血原型成分甘草素N、甘草酚、甘草异黄酮A、6-姜烯酚、补骨脂乙素、异甘草素、芒柄花素、鹰嘴豆芽素A等可能是甘姜苓术汤治疗类风湿关节炎的主要物质基础。2.网络药理学筛选出甘姜苓术汤治疗关节炎的多个靶点与通路,这些靶点与通路与炎症反应密切相关,揭示了甘姜苓术汤治疗类风湿关节炎的机制可能与干预炎症反应有关。3.甘姜苓术汤通过抑制PI3K/AKT信

关键词：甘姜苓术汤类风湿关节炎 uplc-qe-ms技术网络药理学 PI3K/AKT信号通路

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