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昆明医科大学学报 2020年第6期41卷 39-45页

作者：张培培崔佳丽周艺佳刘红斌柯瑾昆明卫生职业学院药学院云南昆明650600 云南白药集团药物安全性评价中心云南昆明650111 云南中医药大学中药学院云南昆明650500

目的建立uplc-q exactive-ms快速检测食蟹猴血浆中黄藤素的方法。方法采用Ulti Mate 3000系列高效液相色谱仪和q exactive四极杆-静电场轨道阱高分辨质谱系统检测。猴含药血浆采用乙腈沉淀蛋白,盐酸小檗碱为内标,蛋白沉淀后用乙腈稀释... 详细信息

目的建立uplc-q exactive-ms快速检测食蟹猴血浆中黄藤素的方法。方法采用Ulti Mate 3000系列高效液相色谱仪和q exactive四极杆-静电场轨道阱高分辨质谱系统检测。猴含药血浆采用乙腈沉淀蛋白,盐酸小檗碱为内标,蛋白沉淀后用乙腈稀释并测定,色谱柱为Hypersil GOLD Dim C18 column (100 mm×2.1 mm,1.9μm),乙腈-0.1%甲酸水为流动相,梯度洗脱,流速0.3m L/min,柱温30℃,电喷雾正离子化(ESI+),选择性离子扫描模式(t-SIM):黄藤素,[M-Cl]+,m/z 352.15433;内标盐酸小檗碱,[M-Cl]+,m/z 336.123 03。分辨率70000,自动增益控制(AGC)和离子注入时间(IT)分别设为5e4和200 ms;isolation window设为4.0 m/z。喷雾气为氮气,碰撞气为高纯氮气。结果黄藤素在105.0~8 200μg/L (进样样品溶液浓度为0.262 5~20.50μg/L)浓度范围内线性关系良好(线性方程为Y=0.001 188 51C-0.000 042 206 6,r=0.999 6,权重1/C2),最低定量限为105.0μg/L,日内与日间精密度均小于4.06%,目标物和内标基质效应因子为91.71~97.74%(n=5),未处理血浆样品于室温放置约1 d、-20℃放置1 d/10 d/35 d、-20℃放置35 d后室温冻融2次稳定性良好。结论建立的LC-ms分析检测方法线性范围宽、分析时间短、准确度好、灵敏度高、特异性强,适于黄藤素药代及毒代动力学分析检测。

关键词：黄藤素 uplc-q exactive-ms 快速测定

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基于转录组测序的经典名方大建中汤改善大鼠脾阳虚证的作用机制研究

基于转录组测序的经典名方大建中汤改善大鼠脾阳虚证的作用机制研...

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作者：赵容成都中医药大学

学位级别：硕士

经典名方大建中汤出自张仲景所著《金匮要略》,以花椒为君药,有温中补虚及降逆止痛的功效,但目前临床使用较少,中文文献发表的医案所记载主治病症包括胃炎、脾阳虚、胰腺癌、鞘膜积液、肠梗阻、阳痿、腹痛等,缺乏高效的适应症及明确的... 详细信息

经典名方大建中汤出自张仲景所著《金匮要略》,以花椒为君药,有温中补虚及降逆止痛的功效,但目前临床使用较少,中文文献发表的医案所记载主治病症包括胃炎、脾阳虚、胰腺癌、鞘膜积液、肠梗阻、阳痿、腹痛等,缺乏高效的适应症及明确的适应患者,且其功效机理和物质基础也并不明确,限制了大建中汤的临床应用和经典名方制剂开发。目的:首先通过古籍文献研究对大建中汤的临床适应症进行分析,选择合适的临床定位和适应患者,为随后的药效及机理研究奠定基础;然后建立脾阳虚证动物模型,对大建中汤改善脾阳虚证的药效进行评价;随后利用转录组测序(RNA-seq)、实时荧光定量聚合酶链式反应(q RT-PCR)、蛋白质印迹法(Western Blotting)等方法对其发挥药效的作用机制进行研究;最后通过超高效液相色谱联用q exactive高分辨质谱仪(uplc-q exactive-ms)鉴别大建中汤的主要成分,为将来研究其物质基础作初步探讨。最终为开发经典名方制剂的前期研究提供参考并奠定大建中汤制剂的研究基础。方法:1.大建中汤的文献研究:基于我国大建中汤相关古籍记载,对该方的功效和临床应用进行系统考证,确定大建中汤合适的临床定位。2.大建中汤温中补虚功效研究:建立脾阳虚证大鼠模型,通过体重、肛温、进食量、运动能力等宏观表征指标,脏器指数以及病理学观察,系统评价大建中汤改善脾阳虚证的药效。3.大建中汤改善脾阳虚证机制研究:采用RNA-seq,系统挖掘造模前后以及大建中汤治疗前后的差异表达基因(DEG),进行生物学信息评价,探讨改善脾阳虚证的机理,同时采用q RT-PCR对测序结果的可靠性进行佐证,并采用蛋白印迹法对关键通路进行验证。4.大建中汤主要成分研究:采用uplc-q exactive-ms技术对大建中汤中的主要成分进行指认,为将来下一步物质基础的研究奠定基础。结果:1.通过研究分析大建中汤的古籍文献发现,大建中汤主治病症,以“诸虚不足”为频次最高,而后有“气逆”和“心胸中大寒痛”,方中花椒、干姜大辛大热,归脾、胃、肾经,饴糖温补中虚,人参补脾益气,相互配合重建中脏,故本论文主要研究该方温补中阳的作用机理。2.大建中汤明显改善了脾阳虚证大鼠体重、肛温、进食量、运动能力、脏器指数等下降的症状;并有效改善了消化道的胃、回肠、结肠的病理改变,各组改善效果的差异提示,大建中汤中、低剂量组对脾阳虚证病理改变有一定改善作用,高剂量组和阳性组改善效果最好。3.通过RNA-seq筛选得到DEG,并筛选空白组—模型组—治疗组的发展趋势为先下调然后上调以及先上调再下调的基因集,并将此基因集进行生信分析,蛋白互作(PPI)分析得到表现出重要作用的20个基因:Cxcr5,Bcl6,Cxcr7,Il21r,Gpr174,Sell,Cd79a,Cxcr4,Ikzfl,Cxcl13,Gzmb,Pou2afl,Cd27,Btk,Ptgs2,Cd72,Ikzf3,Ccl9,Pdyn,Idol;通过Gene Ontology(GO)注释,得到B细胞受体信号通路、淋巴细胞活化、免疫应答的调节及白细胞活化的正向调节等显著富集的与免疫相关的生物功能;经Kyoto Encyclopedia of Genesand Genomes(KEGG)注释,得到B细胞受体信号通路、肠道免疫网络、NF-κB信号通路等显著富集的免疫相关通路。并通过q RT-PCR定量分析验证了RNA-seq结果具有可靠性。另外采用Western Blotting方法对最关键的通路——B细胞受体信号通路上表达的差异基因(PKCβ、BCR、BTK)进行验证分析,表达量变化趋势与测序结果一致,提示B细胞受体信号通路可能是大建中汤改善脾阳虚证的关键机制。4.通过uplc-q exactive-ms对大建中汤主要成分进行了初步探讨,共认定出19个成分,主要有固醇类、酚类、生物碱类、黄酮类等成分。结论:经文献研究确定“诸虚不足”为大建中汤治疗频次最高的症状,故本论文通过复合法建立脾阳虚证大鼠模型,通过宏观表征评价和HE染色病理学评价研究大建中汤的温中补虚功效,发现大建中汤对脾阳虚证有明显改善作用,其作用机制与调节免疫及B细胞受体信号通路密切相关,19个uplc-q exactive-ms鉴别出来的成分是可能的物质基础。

关键词：大建中汤花椒脾阳虚证 B细胞受体信号通路 RNA-seq qRT-PCR Western Blotting uplc-q exactive-ms DEG

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