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细胞与分子免疫学杂志 2007年第3期23卷 242-245页

作者：曹伟郝志勇郗雪艳孔燕马驰崔莲仙何维中国医学科学院基础医学研究所中国协和医科大学基础医学院免疫系北京100005

目的:在大肠杆菌中表达ulbp4重组蛋白,并制备其特异性的单克隆抗体(mAb),为γδT细胞对ulbp4的识别机制研究奠定基础。方法:根据GenBank中ulbp4的基因序列设计相应的引物,用RT-PCR方法从HO-8910细胞中扩增得到ulbp4片段,构建重组原核表... 详细信息

目的:在大肠杆菌中表达ulbp4重组蛋白,并制备其特异性的单克隆抗体(mAb),为γδT细胞对ulbp4的识别机制研究奠定基础。方法:根据GenBank中ulbp4的基因序列设计相应的引物,用RT-PCR方法从HO-8910细胞中扩增得到ulbp4片段,构建重组原核表达质粒pET22b(+)/ulbp4(前225aa胞外段),在Rosetta-gamiTMB(DE3)大肠杆菌中获得表达且主要位于包含体中,经纯化透析复性后,分析其对NK细胞IFN-γ细胞因子分泌的影响。以ulbp4为抗原,免疫BALB/c小鼠,取免疫小鼠脾细胞和Sp2/0骨髓瘤细胞常规融合,依次经HAT选择培养、间接ELISA法、克隆化培养、荧光免疫检测和流式细胞术以及Western blot筛选和鉴定抗ulbp4 mAb的杂交瘤细胞株。结果:构建了pET22b(+)/ulbp4(225aa)原核表达体系,并检测到重组蛋白的有效表达;纯化的重组蛋白在体外培养体系中可以刺激NK细胞IFN-γ细胞因子的分泌。此外,还获得了4株可稳定分泌抗人ulbp4 mAb的杂交瘤细胞株。结论:成功地构建并表达了具有生物活性的ulbp4,为γδT细胞的识别机制研究建立抗原制备平台,同时所制备的抗人ulbp4 mAb,为后续研究奠定了基础。

关键词： ulbp4 NKG2D IFN-γ Rosetta-gami^TMB(DE3)大肠杆菌表达生物学功能单克隆抗体

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EBV-miR-BART7-3p参与鼻咽癌免疫逃逸的初步机制探讨

EBV-miR-BART7-3p参与鼻咽癌免疫逃逸的初步机制探讨

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作者：周琳福建医科大学

学位级别：硕士

背景与目的:鼻咽癌(nasopharyngeal carcinoma,NPC)好发于中国南方地区和东南亚国家。放射治疗是早期和局部晚期鼻咽癌的主要治疗方式。近年来随着放疗技术的进步,以及联合使用化疗和分子靶向治疗等治疗,鼻咽癌的生存率显著提高。然而... 详细信息

背景与目的:鼻咽癌(nasopharyngeal carcinoma,NPC)好发于中国南方地区和东南亚国家。放射治疗是早期和局部晚期鼻咽癌的主要治疗方式。近年来随着放疗技术的进步,以及联合使用化疗和分子靶向治疗等治疗,鼻咽癌的生存率显著提高。然而仍有大约20%的鼻咽癌患者由于局部复发和远处转移而导致治疗失败。研究表明EB病毒感染与鼻咽癌的发生发展密切相关。EBV在鼻咽癌中可编码44种成熟的BARTS mi RNA,其中EBV-mi R-BART7-3p在鼻咽癌中表达上调程度最突出,说明其在鼻咽癌发生发展中可能发挥着重要的作用。已有研究表明EBV-mi R-BART7-3p可促进鼻咽癌细胞增殖、侵袭和转移。肿瘤细胞可通过多因素多机制逃避宿主免疫系统的监视攻击,进而促进肿瘤细胞侵袭、转移,也可能是肿瘤产生治疗抵抗和复发的原因。EBV-mi R-BART7-3p在鼻咽癌细胞免疫逃逸这一过程中是否发挥作用目前尚未见文献报道。本研究旨在探讨EBV-mi R-BART7-3p在鼻咽癌免疫逃逸中的作用及其机制,为鼻咽癌的诊断与治疗提供新的靶点奠定实验和理论基础。方法:首先利用Real-time PCR技术检测19例正常人鼻咽黏膜组织(NP)及23例人鼻咽癌组织EBV-mi R-BART7-3p的差异表达。然后在鼻咽癌细胞系CNE1中稳定过表达EBV-mi R-BART7-3p。Ficoll法分离健康志愿者外周血单个核细胞,并联合使用“IL-2+IL-12+IL-15+IL-18”细胞因子扩增NK细胞,利用磁珠分选系统分选和纯化NK细胞。通过ELISA法及流式细胞分析技术检测,比较EBV-mi R-BART7-3p过表达CNE1细胞及其对照组诱导NK细胞释放IFNγ和表达CD107a的能力。LDH释放法评估NK细胞对EBV-mi R-BART7-3p过表达CNE1细胞及其对照组的杀伤率。综合应用targetscan及mi Randa软件,预测EBV-mi R-BART7-3p可能作用于ulbp4 m RNA的3’UTR序列。并利用荧光素酶报告载体实验验证EBV-mi R-BART7-3p以3’UTR依赖的方式靶向作用于ulbp4。通过real-time PCR、Western blot和抗体标记流式细胞分析技术检测鼻咽癌细胞CNE1中EBV-mi R-BART7-3p过表达后靶基因m RNA和蛋白水平的表达变化,Real-time PCR检测人鼻咽癌组织和正常鼻咽组织中ulbp4 m RNA的差异表达,采用Real-time PCR和Western blot技术检测4种鼻咽癌细胞系中ulbp4表达情况,进一步验证EBV-mi R-BART7-3p对靶基因ulbp4的调控作用。通过Rescue实验进一步验证EBV-mi R-BART7-3p通过调控ulbp4的表达参与鼻咽癌免疫逃逸。结果:Real-time PCR结果显示,EBV-mi R-BART7-3p在NPC组织中的表达水平明显高于NP组织。在鼻咽癌细胞CNE1中过表达EBV-mi R-BART7-3p后,对NK细胞的杀伤敏感性降低。生物信息学分析发现ulbp4为EBV-mi R-BART7-3p的靶基因。荧光素酶报告载体实验表明,EBV-mi R-BART7-3p可以直接结合ulbp4 m RNA的3’UTR,real-time PCR及Western blot分析表明,EBV-mi R-BART7-3p可下调ulbp4 m RNA,进而使ulbp4蛋白表达下调。而且在NPC组织中ulbp4 m RNA明显高于NP组织,ulbp4在EBV阴性的鼻咽癌细胞株中表达均高于EBV阳性的鼻咽癌细胞株。在CNE1-BART7细胞中上调ulbp4表达,能够部分挽回EBV-mi R-BART7-3p过表达鼻咽癌细胞对NK细胞的杀伤敏感性。Recuse实验从另一方面证实了在鼻咽癌中ulbp4确实是EBV-mi R-BART7-3p的靶基因。结论:鼻咽癌组织中EBV-mi R-BART7-3p表达水平明显高于正常鼻咽黏膜组织,EBV-mi R-BART7-3p过表达鼻咽癌细胞对NK细胞杀伤敏感性降低。EBV-mi R-BART7-3p可通过3’UTR依赖的方式靶向作用于ulbp4,使ulbp4表达下调。鼻咽癌细胞通过上调EBV-mi R-BART7-3p来下调ulbp4的表达,进而逃避宿主免疫系统的识别,这可能是促进鼻咽癌发生发展的一个途径。这一通路可为进一步探索鼻咽癌的诊断与治疗提供潜在的靶点。

关键词： EBV-miR-BART7-3p 鼻咽癌 ulbp4 免疫逃逸

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