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基于液质联用技术的中药黄酮类成分的体内外代谢研究以及鸭跖草化学成分的定性定量分析

作者：张霞河北医科大学

学位级别：硕士

药物进入体内后在代谢酶的作用下发生结构性的改变,产生毒性或活性代谢物。其中肝脏是药物产生代谢物的主要器官,肝微粒体温孵模型是最常用的体外代谢体系。药物的体内代谢研究较全面地阐明药物的代谢途径,为临床药物治疗和毒副作用监... 详细信息

药物进入体内后在代谢酶的作用下发生结构性的改变,产生毒性或活性代谢物。其中肝脏是药物产生代谢物的主要器官,肝微粒体温孵模型是最常用的体外代谢体系。药物的体内代谢研究较全面地阐明药物的代谢途径,为临床药物治疗和毒副作用监测奠定了基础。中药鸭跖草化学成分复杂,主要用于风热感冒、高烧不退、咽喉肿痛、水肿尿少、热淋涩痛和痈肿疔毒。但是《中国药典》2015年(一部)未收载鸭跖草的含量测定。因此,本研究旨在建立高效液相色谱-质谱联用方法分析中药大蓟中主要黄酮化合物在大鼠体内的代谢途径;鉴别漆黄素、槐角苷和甘草苷单体成分分别在大鼠体内外的代谢产物;识别鸭跖草化学成分及其多组分含量测定。第一部分中药大蓟中主要黄酮类成分的体内代谢研究目的:建立uhplc-q-tof-ms/ms法分析中药材大蓟提取物中主要黄酮类成分在大鼠体内的代谢途径。方法:大鼠灌胃给予大蓟提取物后,收集血浆、尿液和胆汁生物样品,采用液-液萃取方法进行样品前处理。首先采用uhplc-q-tof-ms/ms技术,ESI源正离子模式监测,全扫描结合多重质量亏损(MMDF)和动态背景扣除(DBS),在线采集数据,采用多种数据处理方法筛选主要黄酮类化合物(柳穿鱼叶苷、蒙花苷和柳穿鱼黄素)可能的代谢物。根据代谢物的精确分子质量、元素组成、二级质谱图、相关的生物转化规律和母药化合物的裂解规律,推断中药大蓟提取物的可能代谢物。同时,引进Clog P值重要参数,以区分同分异构体。色谱柱Poroshell 120 EC-C(2.1×100mm,2.7μm),配有SecurityGuarduhplc C预柱(Poroshell);流动相为水(0.1%甲酸)-甲醇,梯度洗脱,流速为0.3 mL/min,进样量为5μL。结果:本研究采用uhplc-q-tof-ms/ms技术识别了12种吸收组分,共鉴定了25种代谢物。实验发现水解反应是柳穿鱼叶苷和蒙花苷代谢的第一步,然后氧化和还原反应发生,但是未检测到柳穿鱼叶苷和蒙花苷的结合代谢物。实验总结了柳穿鱼黄素代谢途径,主要包括氧化、还原、水解、葡萄糖醛酸化和葡萄糖结合反应。结论:本研究首次采用uhplc-q-tof-ms/ms技术分析大蓟提取物中主要黄酮类化合物的代谢物,为大蓟进一步的药理学和药物活性研究奠定了基础。本方法简便、快速,适用于中药材的体内代谢产物的分析。第二部分漆黄素的体内外代谢研究目的:采用uhplc-q-tof-ms/ms技术分析漆黄素单体成分在大鼠体内外的代谢产物。方法:建立I相温孵体系:1.0 mg/mL肝微粒、3.3 mmol/L MgCl、1.3 mmol/Lβ-NADPH和100μmol/L漆黄素对照品溶液(甲醇占总体积的1%);建立II相温孵体系:1.0 mg/mL鼠肝微粒体、2 mmol/L UDPGA、8 mmol/L MgCl、25μg/mL丙甲菌素和100μmol/L漆黄素对照品溶液(甲醇占总体积的1%)。大鼠灌胃给予漆黄素混悬液后,分别收集血浆、尿液、胆汁和粪便生物样品,体外I相代谢样品预处理采用液-液萃取方法,而体外II相体系和体内生物样品采用甲醇沉淀蛋白的方法进行样品前处理。结果:本研究采用uhplc-q-tof-ms/ms方法共鉴定了漆黄素在大鼠肝微粒中14种代谢物,体内53种代谢物(11种I相代谢物和42种II相代谢物),其中,血中18种、尿液49种、胆汁34种和粪便34种代谢物。漆黄素的主要代谢途径为氧化、还原、葡萄糖醛酸化和硫酸盐结合反应。实验发现氧化和丢失氧原子反应是发生甲基化、氢化、硫酸化和葡萄糖醛酸化反应的基础反应。结论:本研究采用uhplc-q-tof-ms/ms方法鉴定漆黄素在大鼠体内外的代谢物,结果显示uhplc-q-tof-ms/ms是识别药物代谢物的强有力的工具,将会引导理解药物的生物转化,为药物的临床应用和药理研究奠定理论基础。第三部分槐角苷的体内外代谢研究目的:采用uhplc-q-tof-ms/ms方法分析槐角苷单体成分在大鼠体内外的代谢产物及其代谢途径。方法:分别建立I相和II相温孵体系,大鼠灌胃给予槐角苷混悬液后,分别收集血浆、尿液、胆汁和粪便生物样品。体外I相样品采用液-液萃取方法进行前处理,体外II相和体内的生物样品前处理均采用甲醇沉淀蛋白的方法。色谱柱Poroshell 120 EC-C(2.1×100 mm,2.7μm),配有SecurityGuarduhplc C预柱(Poroshell);流动相:水(0.1%甲酸)-甲醇,梯度洗脱,流速为0.3 mL/min,进样量为3μL。结果:本研究采用uhplc-q-tof-ms/ms技术,基于在线数据采集和数据加载策略,在大鼠体内共鉴定了60种代谢物(I相代谢物22种和II相代谢物38种),其中在大鼠血浆中检测到10种代谢物,在尿

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基于色谱-质谱联用技术结合代谢组学探究金银花和山银花的药效物质基础

基于色谱-质谱联用技术结合代谢组学探究金银花和山银花的药效物...

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作者：张妙婷河北医科大学

学位级别：硕士

目的:本研究建立基于GC-ms,uhplc-q-tof-ms/ms技术的代谢组学对近缘性药材金银花和山银花中的挥发油和黄酮类成分进行鉴定,筛选出差异性成分,为临床能否替代用药提供参考;通过网络药理学初步探讨差异性成分木犀草素对非小细胞肺癌的作... 详细信息

目的:本研究建立基于GC-ms,uhplc-q-tof-ms/ms技术的代谢组学对近缘性药材金银花和山银花中的挥发油和黄酮类成分进行鉴定,筛选出差异性成分,为临床能否替代用药提供参考;通过网络药理学初步探讨差异性成分木犀草素对非小细胞肺癌的作用机制,然后利用代谢组学的方法进一步研究该药物作用于肺癌A549细胞后其内源性代谢物的变化,阐明相关代谢通路,为木犀草素治疗非小细胞肺癌(NSCLC)提供数据支持。方法:首先采用GC-ms技术对水蒸气蒸馏法得到的金银花和山银花挥发油样品进行检测,将得到的原始数据用正构烷烃进行峰校正和峰对齐等预处理,然后根据物质的保留时间和m/z等参数在标准质谱数据库(NIST ms)中进行检索匹配,最后对差异性挥发油进行分析;然后采用uhplc-q-tof-ms/ms技术对超声提取的金银花和山银花样品进行检测,将所得数据经Peakview软件与自建库中的二级碎片进行比对,根据总结的不同类型黄酮类化合物的裂解规律对成分进行定性分析,原始数据经Progenesis qI软件归一化处理后,导入SIMCA-P 14.1软件进行多元数据统计分析,筛选VIP>3且Puhplc-q-tof-ms/ms技术对样本进行数据采集,将采集的原始数据用Progenesis qI软件进行归一化处理,并导入SIMCA-P 14.1软件进行多元数据统计分析得到VIP值,同时采用t-检验获得P值。筛选VIP>1且Pms库检索,共检测出40种挥发性成分,主要包括烃类、酯类、醛类、酮类、酚类、醇类以及苯胺类,其中共有成分24种,差异性挥发油16种;利用uhplc-q-tof-ms/ms技术在金银花和山银花中共鉴定出47种黄酮类化合物,经VIP和P值筛选,共获得77种差异性变量,通过与鉴定的黄酮类化合物的碎片离子匹配,最后筛选出7种差异性黄酮。采用网络药理学方法,筛选出了木犀草素作用于NSCLC的核心靶点基因,通路富集分析共得到44条相关通路。细胞存活率实验表明A549细胞存活率为50%时,木犀草素的浓度为38μg/m L。以该浓度作用细胞后,数据经多元统计分析和在线数据库匹配鉴定,共筛选鉴定到45个潜在生物标志物,结果涉及20条通路,其中最重要的途径是酪氨酸代谢,谷胱甘肽代谢以及戊糖磷酸途径。通过ROC曲线分析发现4种诊断性生物标志物D-核糖,谷胱甘肽,L-谷氨酸,3-甲氧基酪胺在预测木犀草素治疗NSCLC方面具有良好准确性。结论:本研究建立了一种基于GC-ms和uhplc-q-tof-ms/ms的代谢组学方法,对金银花和山银花中的挥发油和黄酮类成分进行了差异性成分的比较,为两种药材在临床用药方面提供了一些有效依据。采用网络药理学与细胞代谢组学两种方法分析了木犀草素治疗NSCLC的作用机制,找出了受木犀草素干扰较大的相关代谢代谢通路和诊断性生物标志物,研究结果对木犀草素治疗NSCLC提供了新思路。

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牛黄上清片的比较药代动力学及组织分布研究

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作者：马惠玲南昌大学

学位级别：硕士

牛黄上清片是中医治疗实热证的经典方剂,具有清热泻火,散风止痛的功效,临床上主要用于头痛眩晕,目赤耳鸣,咽喉肿痛,口舌生疮,牙龈肿痛,大便燥结。主要是由人工牛黄、薄荷、菊花、荆芥穗、白芷、川芎、栀子、黄连、黄柏、黄芩、大黄、连... 详细信息

牛黄上清片是中医治疗实热证的经典方剂,具有清热泻火,散风止痛的功效,临床上主要用于头痛眩晕,目赤耳鸣,咽喉肿痛,口舌生疮,牙龈肿痛,大便燥结。主要是由人工牛黄、薄荷、菊花、荆芥穗、白芷、川芎、栀子、黄连、黄柏、黄芩、大黄、连翘、赤芍、当归、地黄、桔梗、甘草、石膏以及冰片十九味中草药按照“君、臣、佐、使”原则配伍制成。其在生物体内的药代动力学及主要活性成分在体内的分布及代谢规律目前还未有文献报道,药效物质基础不明确。为此,本课题对其药代动力学进行比较研究,并分析其在生物体内的分布情况和代谢途径,为阐明牛黄上清片的作用机理和药效物质基础奠定基础。首次采用HPLC法,以Inertsil?ODS-3 column(150 mm×4.6 mm,5 um,GL Science,Japan)为色谱柱,流动相为甲醇-0.2%磷酸(80:20);流速:1.0 mL/min;检测波长:254 nm;柱温:25℃;进样体积:10μL;进样时间:20 min;内标:1,8-二羟基蒽醌。对复方制剂牛黄上清片,单味药材大黄及单体化合物大黄酸在大鼠体内的药代动力学进行研究,比较大黄酸在大鼠体内的药代动力学参数。实验结果表明,在相当剂量下牛黄上清片中大黄酸的药动学参数与大黄提取物及大黄酸单体相比,均有显著性差异(pqA:2.462 mg/L;NHSq B:1.903 mg/L;NHSqC:2.922 mg/L)远大于大黄提取物中大黄酸的Cmax(1.116 mg/L)及大黄酸对照品的Cmax(0.662mg/L),而牛黄上清片中大黄酸达到最大血药浓度的时间Tmax(NHSqA:0.236h;N HSqB:0.333 h;NHSqC:0.264 h)又比大黄提取物Tmax(0.542 h)及大黄酸对照品Tmax(0.958 h)的短。此外,牛黄上清片在大鼠体内的AUC值(NHSqA:7.105 mg/L*h;NHSqB:8.616 mg/L*h;NHSqC:8.385 mg/L*h)远大于大黄提取物的AUC(4.518 mg/L*h)和大黄酸的AUC(2.395 mg/L*h)。本课题首次采用uhplc-q-tof-ms/ms技术在正、负离子两种模式下对牛黄上清片体外提取物及主要活性成分在大鼠体内(脑、心、肝脏、肾脏、血液、尿液)的吸收分布和代谢进行研究。结合Peak View?软件分析鉴定出211个体外提取物,135个体内原型成分和154个代谢物产物。其中体外提取物中的43个是根据对照品完全鉴定,其余的依据文献和裂解规律为暂时鉴定。135个原型成分中,血浆样品中91个,脑组织中31个,心组织中50个,肝脏组织中55个,肾脏组织中52个以及尿样中93个。此外,代谢物也分布于大鼠的各个组织,其中有五个代谢产物(M50,M79,M115,M128和M154)是首次发现的目前未有文献报道的新代谢物质。实验结果表明,牛黄上清片的主要活性成分及代谢物存在于生物的各组织中,且代谢主要以Ⅱ相代谢反应(葡萄糖醛酸化、甲基化、硫酸酯化)为主。本实验比较全面的诠释了牛黄上清片的在生物体内的吸收分布及主要活性成分的代谢过程研究,阐明牛黄上清片的作用机制和药效物质基础。

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基于液质联用技术及网络药理学的二苯乙烯苷降血脂机制研究

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作者：马红云河北医科大学

学位级别：硕士

目的:建立uhplc-q-tof-ms/ms法分析二苯乙烯苷在健康大鼠和高脂血症模型大鼠体内外代谢产物及其代谢途径,为二苯乙烯苷的进一步研究提供理论基础。采用代谢组学和网络药理学的方法对二苯乙烯苷治疗高脂血症的作用靶点和作用机制进行研... 详细信息

目的:建立uhplc-q-tof-ms/ms法分析二苯乙烯苷在健康大鼠和高脂血症模型大鼠体内外代谢产物及其代谢途径,为二苯乙烯苷的进一步研究提供理论基础。采用代谢组学和网络药理学的方法对二苯乙烯苷治疗高脂血症的作用靶点和作用机制进行研究。方法:分别收集健康大鼠和高脂血症模型大鼠的新鲜粪便建立肠道菌温孵体系;收集健康大鼠和高脂血症模型大鼠分别经灌胃和尾静脉注射二苯乙烯苷后的血浆、胆汁、尿液和粪便样本。上述肠道菌温孵液和体内各生物样本均采用甲醇沉淀蛋白的方法进行前处理。利用uhplc-q-tofms/ms在线采集技术,ESI源,负离子模式,全扫描采集模式进行数据采集,将结果导入Metabolite Pilot 2.0.2软件根据母药裂解规律推断可能的代谢产物。建立基于液质联用技术的代谢组学研究和基于系统生物学理论的网络药理学研究方法,对二苯乙烯苷治疗高脂血症可能的作用机制进行阐述并探究其是否产生肝毒性。将雄性SD大鼠随机分为五组,分别为正常组,高脂血症模型组,二苯乙烯苷高剂量给药组,二苯乙烯苷中剂量给药组和二苯乙烯苷低剂量给药组,收集各组血清样本。采用液质联用法对各组样品进行数据采集,将原始数据导入Progenesis qI和SIMCA-P 14.1软件进行数据后处理,筛选不同组别间的差异代谢物并分析相关代谢通路,同时结合生化指标检测以评价二苯乙烯苷降血脂疗效及其是否产生肝毒性,并采用网络药理学方法同时检索多个数据库寻找二苯乙烯苷和高脂血症对应靶点,通过构建蛋白-蛋白相互作用网络筛选得到核心靶点。利用Metascape数据库进行GO富集分析和KEGG通路分析。结果:在健康组大鼠和高脂血症模型组大鼠中共发现47种代谢产物。在健康组大鼠中共发现代谢物43种,其中灌胃给药后39种,静注给药后18种,肠道菌温孵液中5种;在高脂血症模型组大鼠中共发现代谢物24种,其中灌胃给药后17种,静注给药后6种,肠道菌温孵液中5种。主要涉及到的代谢途径包括葡萄糖醛酸结合,硫酸结合,脱糖反应,还原反应等,结果表明二苯乙烯苷在两种不同模型下的代谢存在差异。在正常组大鼠与高脂血症模型组大鼠之间共鉴定出89种差异代谢物,在二苯乙烯苷给药组和高脂血症模型组大鼠之间共鉴定出94种差异代谢物,主要涉及甘油磷脂代谢、鞘脂代谢、初级胆汁酸的生物合成和嘌呤代谢通路的改变。共筛选出甘胆酸、L-乙酰肉碱、7β,12α-二羟基胆酸、(3α,5β,12β,17xi)-12,24-二羟基-24-氧杂胆碱-3-yl-D-吡喃葡萄糖苷和N-[(3α,5β,7β,12α)-3,7,12-三羟基-24-氧胆碱-24-yl]甘氨酸5种物质作为二苯乙烯苷治疗高脂血症的潜在生物标志物。随后采用网络药理学方法共筛选得到二苯乙烯苷治疗高脂血症相关靶点8个,经PPI网络分析后筛选得到39个核心靶点,涉及HIF-1信号通路等相关作用通路。结论:二苯乙烯苷在健康大鼠和高脂血症模型大鼠体内外代谢物的差异说明高脂血症大鼠生理状态的改变对二苯乙烯苷的体内过程产生了影响,提示我们在今后对二苯乙烯苷体内药效形式研究时应采用模型动物;不同给药形式下的代谢差异预示肠道菌群对二苯乙烯苷的代谢过程有影响值得进一步研究。通过代谢组学和网络药理学研究发现二苯乙烯苷治疗高脂血症主要涉及甘油磷脂代谢、嘌呤代谢和磷脂酰肌醇等信号通路。本研究为阐明二苯乙烯苷治疗高脂血症的作用机制提供了理论依据。

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基于代谢组学和网络药理学方法揭示松萝酸治疗非小细胞肺癌的可能机制

基于代谢组学和网络药理学方法揭示松萝酸治疗非小细胞肺癌的可能...

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作者：关帅河北医科大学

学位级别：硕士

目的:本研究建立基于代谢组学和网络药理学分析的方法,对松萝酸干预后A549细胞的内源性代谢物进行分析,并阐释相关的代谢通路,探索松萝酸抑制NSCLC的作用机制。方法:在本研究中,首先用不同浓度的松萝酸处理A549细胞,确定80%存活率时的... 详细信息

目的:本研究建立基于代谢组学和网络药理学分析的方法,对松萝酸干预后A549细胞的内源性代谢物进行分析,并阐释相关的代谢通路,探索松萝酸抑制NSCLC的作用机制。方法:在本研究中,首先用不同浓度的松萝酸处理A549细胞,确定80%存活率时的药物浓度用于进一步研究。然后利用该浓度松萝酸干预A549细胞24 h,得到分析样本。该样本使用uhplc-q-tof-ms/ms平台联合DDA和DIA技术进行数据采集。得到的数据采用软件Progenesis qI中的数据挖掘工具进行处理,并利用t检验和OPLS-DA方法进行统计分析,得到P值和VIP值。同时满足P＜0.05和VIP＞1的代谢物被视为差异代谢物。通过HMDB数据库匹配鉴定后得到潜在的生物标志物。最后利用在线平台Metabo Analyst 4.0和KEGG在线数据库分别进行通路富集分析和筛选。另外,采用网络药理学方法,利用多个数据库分别寻找到松萝酸及NSCLC核心靶点,并对其进行蛋白互作的网络构建,使用Metascape数据库对核心靶点进行通路分析,采用Cytoscape 3.7.1软件构建松萝酸治疗NSCLC的“成分-核心靶点-通路”网络模型,并对可能受到影响的相关通路进行了分析。结果:实验表明A549细胞在50μg/m L的松萝酸处理下,存活率达到80%。以该浓度处理下的细胞提取液,进样液质联用仪,数据经多元统计分析和在线数据库匹配鉴定,共筛选鉴定出了47个潜在的生物标志物,所涉及到的代谢通路主要包括能量代谢、氨基酸代谢和脂质代谢。采用网络药理学方法,筛选出了松萝酸可作用于NSCLC的核心靶点基因,涉及主要相关通路20条。代谢组学与网络药理学两种方法在作用机制方面的研究各有侧重又可互为补充,因此可对松萝酸治疗NSCLC时在分子水平和通路水平受到的影响深入研究。结论:本研究首次建立了基于代谢组学和网络药理学分析的综合方法,利用A549细胞模型,探索松萝酸在治疗NSCLC方面的可能机制。最终经松萝酸处理后的A549细胞与对照组细胞相比较,共筛选出47种差异代谢物,涉及谷胱甘肽代谢、氨基酸代谢、甘油磷脂代谢等代谢途径。因此,代谢组学和网络药理学相结合的策略有助于更加全面的解释松萝酸对NSCLC治疗的可能机制。该方法为药物作用机制的研究与阐释提供了新的思路。

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茯苓类药材中茯苓三萜类化合物的药物代谢动力学研究

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作者：钱琪河北医科大学

学位级别：硕士

茯苓类药材来源于多孔菌科真菌茯苓(Poria cocos（Schw.）Wolf)的干燥菌核。根据入药部位和功效不同,常分为茯苓皮、赤茯苓、茯苓、茯神四种。茯苓皮是茯苓菌核的外皮部分,有利水消肿之功效;赤茯苓为茯苓菌核近外表皮部淡红色部分,有行... 详细信息

茯苓类药材来源于多孔菌科真菌茯苓(Poria cocos（Schw.）Wolf)的干燥菌核。根据入药部位和功效不同,常分为茯苓皮、赤茯苓、茯苓、茯神四种。茯苓皮是茯苓菌核的外皮部分,有利水消肿之功效;赤茯苓为茯苓菌核近外表皮部淡红色部分,有行水利湿热、益心润肺之功效;茯苓为菌核中间白色部分,有利水渗湿、益脾和胃之功效;茯神为菌核中心抱有松根部分,有宁心、安神、利水之功效。随着茯苓皮、赤茯苓、茯苓、茯神入药部位由表及里,其行水利尿作用逐渐减弱而宁心安神作用增强。化学成分研究表明茯苓三萜类化合物是茯苓类药材的主要活性物质,种类多样。目前为止,茯苓不同药用部位的茯苓三萜类化合物在体内的药物代谢动力学差异尚无系统研究,因此尚不明确造成茯苓类药材功效之间差异的具体化学成分和作用机制。本研究利用uhplc-q-tof-ms/ms技术,建立一个可同时定量分析大鼠血浆中多种茯苓三萜类化合物的方法,应用于比较茯苓类药材在大鼠体内药物动力学方面的差异,并发现和鉴定茯苓皮提取液在大鼠体内的代谢物,推测可能的代谢途径。第一部分茯苓类药材中茯苓三萜类化合物的药物动力学比较目的:建立生物样品中茯苓类药材8种茯苓三萜类化合物的uhplc-q-tof-ms/ms定量测定方法,研究茯苓类药材在大鼠体内的药物动力学特征,初步探讨其药物动力学的差异。方法:1茯神、茯苓、赤茯苓、茯苓皮灌胃液的制备:将茯神、茯苓、赤茯苓、茯苓皮用90%乙醇加热回流提取,提取液过滤,减压除醇,加适量水溶解,分别制备成茯神灌胃液（相当于2.5 g/m L原药材）、茯苓灌胃液（相当于2.5 g/m L原药材）、赤茯苓灌胃液（相当于2.0 g/m L原药材）、茯苓皮灌胃液（相当于2.0 g/m L原药材）。2生物样品的采集和预处理:取24只250±30 g的雄性Sprague-Dawley大鼠,随机分为4组,按体重以生药材25 g/kg的给药量,分别灌胃给予上述4种溶液。茯神、茯苓、茯苓皮分别于给药后5 min,10 min,30 min,1 h,2 h,4 h,8 h,12 h,24 h,36 h,48 h;赤茯苓于给药后10 min,30 min,1 h,2 h,4 h,8 h,12 h,24 h,36 h,48 h,72h眼内眦静脉丛取血,采用乙腈沉蛋白的方法处理血浆样品。3样品分析条件:采用uhplc-q-tof-ms/ms技术。ACqUITY UPLC?BEH C18（2.1×100 mm,5μm）色谱柱。流动相为0.5‰甲酸-0.5 m M乙酸铵水溶液和乙腈。ESI电离,子离子扫描模式,在负离子模式下检测茯苓新酸B、去氢土莫酸、茯苓新酸A、猪苓酸C、茯苓新酸AM、去氢茯苓酸、茯苓酸、松苓新酸、常春藤皂苷元。采用高分辨的单个子离子计算峰面积,并采用内标法加权（1/x）一元线性回归定量。4药物动力学研究与分析:根据测定结果,绘制药时曲线,采用DAS3.0非房室模型计算药物动力学参数,并比较4种药材给药的药物动力学差异。结果:大鼠血浆中茯苓新酸B、去氢土莫酸、茯苓新酸A、猪苓酸C、茯苓新酸AM、去氢茯苓酸、茯苓酸、松苓新酸在测定浓度范围内线性关系良好（r≥0.9930）。批内、批间精密度的相对标准偏差（RSD）均小于10.3%,相对误差（RE）为-6.1%.7%。基质效应于91.4%12.3%范围内,平均提取回收率为72.6%02.6%。茯苓新酸AM在各组中均无吸收,茯苓新酸B、去氢土莫酸、茯苓新酸A、猪苓酸C、去氢茯苓酸、茯苓酸、松苓新酸在茯苓皮组中吸收量最大。结论:本方法快速、灵敏、专属、稳定,可以用于茯苓类药材在体内成分的测定,为研究茯苓类药材药理作用机制提供了依据。第二部分茯苓皮在大鼠体内吸收组分和代谢物的鉴定目的:采用uhplc-q-tof-ms/ms技术,结合Peakview和Metabolite Pilot数据分析软件,分析鉴定茯苓皮在大鼠血浆、胆汁和尿液中的吸收组分和代谢物,探索其活性成分在体内的代谢途径。方法:1茯苓皮灌胃液的制备:将茯苓皮用90%乙醇加热回流提取,提取液过滤,减压除醇,用水稀释至相当于2.0 g/m L的原药材。2生物样品的采集和预处理:取12只雄性Sprague-Dawley大鼠,体重250±30 g,随机分为4组,每组3只,按体重以25 g/kg的给药量灌胃给予大鼠,分别采集给药后1、2、4、8、12、24和36 h时的血浆样品,24 h的胆汁样品和72 h的尿液,分别合并所有的血浆、胆汁样品和尿样。将合并的生物样品分别用3倍量的乙酸乙酯萃取,萃取3次,每次15 min。合并乙酸乙酯层,减压干燥,残渣用甲醇溶解。3样品分析条件:采用uhplc-q-tof-ms/ms技术分析样品。色谱柱为Phenomenex Luna 3μC18（2）100A（1

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基于液质联用技术的大蓟药代动力学特征及其3种黄酮类成分的体外代谢研究

基于液质联用技术的大蓟药代动力学特征及其3种黄酮类成分的体外...

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作者：张智勇河北医科大学

学位级别：硕士

大蓟为菊科植物Cirsium japonicum DC.的干燥地上部分或根,为多年生草本植物,全国大部分地区均有分布。收载于2010版中国药典,有凉血止血,散瘀解毒消痈的功效。用于衄血,吐血,尿血,便血,崩漏,外伤出血,痈肿疮毒,是一味用药历史悠久的传... 详细信息

大蓟为菊科植物Cirsium japonicum DC.的干燥地上部分或根,为多年生草本植物,全国大部分地区均有分布。收载于2010版中国药典,有凉血止血,散瘀解毒消痈的功效。用于衄血,吐血,尿血,便血,崩漏,外伤出血,痈肿疮毒,是一味用药历史悠久的传统中药。研究表明大蓟的化学成分复杂,主要含黄酮类、长链炔醇类、挥发油类、三萜和甾体类化合物等。此外,大蓟的药理作用和临床应用广泛,研究认为黄酮类化合物是其主要的活性成分。然而,迄今为止有关中药大蓟的药代动力学研究还未见报道,其主要成分的代谢情况尚不清楚,因此,本文对大蓟主要黄酮类成分的吸收、分布、排泄以及体外代谢进行研究。建立大鼠口服大蓟提取物后血浆中7种黄酮类成分柳穿鱼叶苷、蒙花苷、柳穿鱼黄素、高车前素、香叶木素、刺槐素和芹菜素的HPLC-ms/ms检测方法,阐明相关药动学参数;建立大鼠口服大蓟提取物后柳穿鱼叶苷、蒙花苷和柳穿鱼黄素3种主要黄酮类成分在尿液、胆汁、粪便和各组织中的HPLC-ms/ms检测方法,研究其排泄规律和组织分布特征;采用uhplc-q-tof-ms/ms技术对3种主要黄酮类成分柳穿鱼叶苷、蒙花苷和柳穿鱼黄素的体外代谢进行研究。第一部分液质联用法同时测定大鼠血浆中7种黄酮类成分及其药代动力学研究目的:建立7种黄酮类成分柳穿鱼叶苷、蒙花苷、柳穿鱼黄素、高车前素、香叶木素、刺槐素和芹菜素在大鼠血浆中的HPLC-ms/ms检测方法,进行药动学研究。方法:色谱条件:反相Diamonsil C18柱(150 mm×4.6 mm,5μm),A(甲醇),B(0.1%甲酸-水)为流动相进行梯度洗脱,洗脱程序为0.0-1.5min 35%-65%A,1.5-6 min 65%A,6-8 min 95%A,流速为0.8 m L/min。质谱条件:电喷雾离子源(ESI源),源温度设为650℃。采用多反应监测模式(MRM)进行正负离子同时监测扫描。12只SD大鼠随机分为两组,给药后A组于0,2,5,10,15,25,60,90,120,180 min,B组于0,5,10,25,60,90,180,360,720,1140,1800 min眼内眦取血于肝素化离心管内,制备血浆,以磺胺甲噁唑为内标,样品处理采用甲醇沉蛋白法。结果:7种被测物质的线性关系良好(R2≧0.9954),大鼠给药后,柳穿鱼叶苷、蒙花苷、柳穿鱼黄素、高车前素、香叶木素和刺槐素的血药浓度于5 min达峰,Cmax分别为876.77±97.34 ng/m L,86.79±1.70 ng/m L,6.13±0.12 ng/m L,32.85±2.50 ng/m L,37.2±2.04 ng/m L和19.02±1.29ng/m L,且在180 min基本消除完全;芹菜素在360 min达峰,Cmax为148.26±20.63 ng/m L。芹菜素产生双峰现象,推测与肝肠循环有关。结论:本研究首次建立了一种灵敏的HPLC-ms/ms方法,同时测定了大鼠口服大蓟提取物后血浆中7种黄酮类成分的含量,并成功应用于药代动力学研究。结果表明,除芹菜素外,6种大蓟黄酮类成分在大鼠体内吸收和消除迅速。第二部分液质联用法同时测定大鼠尿液、胆汁和粪便中3种黄酮类成分及其排泄研究目的:建立大鼠口服大蓟提取物后,尿液、胆汁和粪便中3种黄酮类成分柳穿鱼叶苷、蒙花苷和柳穿鱼黄素含量的HPLC-ms/ms测定方法,并研究排泄规律。方法:色谱条件:反相Diamonsil C18柱(150mm×4.6mm,5μm),柱流动相为A(甲醇)-B(0.1%甲酸),梯度洗脱,洗脱程序如下:0.0-1.5min,35-90%A;1.5-4.5min,90-95%A;4.5-6.5min,95%A;6.6min,35%A。流速为0.8 m L/min。质谱条件:电喷雾离子源(ESI源),源温度设为650℃。采用多反应监测模式(MRM)进行正离子监测。大鼠按5 m L/kg灌胃给予大蓟提取物后,分别收集0-4,4-8,8-12,12-24,24-36,36-48 h时间段的尿液和粪便样品,胆管插管术后收集0-2,2-4,4-6,6-8,8-12,12-24,24-36 h时间段的胆汁样品,样品处理后分别测定。结果:柳穿鱼叶苷在24 h内经尿液、胆汁和粪便基本排泄完全,分别占总排泄量的94.52%、95.27%和99.14%,占给药量的0.07%、0.99%和14.96%。蒙花苷在24 h内经尿液、胆汁和粪便基本排泄完全,分别占总排泄量的97.53%、95.13%和99.66%,占给药量的0.047%,0.36%,10.50%。柳穿鱼黄素在36 h内经尿液和粪便基本排泄完全,分别占总排泄量的98.17%和99.98%,占给药量的2.21%和25.85%。柳穿鱼黄素在胆

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炭黑纳米颗粒影响大鼠/肺癌细胞代谢的非靶向代谢组学研究

引用

作者：侯露丹河北医科大学

学位级别：硕士

目的:本研究建立基于uhplc-q-tof-ms技术的非靶向代谢组学研究平台,对炭黑纳米颗粒(CBNPs)染毒后对大鼠/肺癌细胞的内源性代谢物进行分析,以寻找由CBNPs暴露引起的潜在的生物标志物,并阐释相关的代谢通路,探索其作用机制。方法:在体内... 详细信息

目的:本研究建立基于uhplc-q-tof-ms技术的非靶向代谢组学研究平台,对炭黑纳米颗粒(CBNPs)染毒后对大鼠/肺癌细胞的内源性代谢物进行分析,以寻找由CBNPs暴露引起的潜在的生物标志物,并阐释相关的代谢通路,探索其作用机制。方法:在体内研究中,首先将18只健康雄性SD大鼠随机分成3组:CBNPs染毒组,恢复组和空白对照组,其中染毒组大鼠通过口鼻暴露方式给予CBNPs。染毒结束后,采集大鼠血液,获得的血清样本。取100μL,加入3倍量乙腈,经涡旋等操作得到体内内源性物质分析样本。采用液质联用技术,在ESI源下,应用质谱全扫描同时启动信息依赖采集(IDA)进行内源性代谢物的在线数据获取。质谱原始数据首先导入qI软件中,进行峰对齐,解卷积和加合离子的筛选。在体外研究中,首先用不同浓度的CBNPs处理肺癌A549细胞,采用细胞计数试剂盒-8(CCK-8)在双波长条件下评估它对细胞的毒性。确定的IC50值可用于进一步的机制研究,即将A549细胞暴露在70μg/mL的CBNPs 48 h后,得到体外内源性物质分析样本。该样本使用uhplc-q-tof-ms/ms联合SWATH技术进行在线数据采集。得到的LC-ms原始数据采用MarkerView中的重要数据挖掘工具进行进行峰值检测,峰对齐和归一化,并采t检验进行显著性分析。同时利用PCVG过滤技术排除LC-ms峰谱中无关变量组的干扰。体内和体外获得的标准化的数据导入到SPSS Statistics 21软件中(IBM,USA)进行t检验并得到P值。与此同时,数据被导入到SIMCA-P 14.0软件中(Umetrics,Uppsala,Sweden)进行多重数据分析,采用有监督性的多重数据分析OPLS-DA得到VIP值。同时满足P1的代谢物被视为差异代谢物。通过HMDB数据库(http://***)和Metlin数据库(http://***)匹配后得到潜在的生物标志物。最后通过在线平台MetaboAnalyst 4.0(http://***)和KEGG在线数据库(http://***/kegg)分别进行通路富集分析和代谢通路的筛选。结果:经过多元统计分析,在大鼠血清中共鉴定出39个潜在生物标志物。主要干扰的代谢通路包括:激素代谢、氨基酸代谢、核苷酸代谢和脂质代谢。在肺癌细胞A549干扰实验中鉴定出了32个潜在的生物标志物,所涉及到的代谢通路主要有:能量代谢、氨基酸代谢和脂质代谢。值得注意的是体内实验表明长期接触CBNPs可能会使患不孕症风险增加。结论:在这项研究中,首次采用uhplc-Triple-tof-ms/ms结合IDA全扫描数据采集技术和新型SWATH数据采集技术开发了实用的非靶向代谢组学方法,分析了CBNPs对大鼠和肺癌细胞的代谢影响。最终找出与CBNPs暴露相关的潜在生物标志物和相关的代谢途径。这些重要途径可能是CBNPs毒性中的关键分子事件。这些研究成果为进一步解释炭黑纳米颗粒的毒性产生的生物学机制和恢复机制提供数据,也为其他纳米材料的毒性研究提供新的分析方法。

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广金钱草治疗草酸钙肾结石的代谢组学研究及其有效成分的代谢研究

引用

作者：刘瑞娜河北医科大学

学位级别：硕士

目的:寻找与广金钱草治疗草酸钙肾结石相关的潜在生物标志物及代谢通路,并对广金钱草中的有效成分夏佛塔苷在健康大鼠和草酸钙肾结石大鼠体内外的代谢物进行鉴定和比较。方法:将40只雄性SD大鼠随机分为5组(n=8):空白组、模型组、广金钱... 详细信息

目的:寻找与广金钱草治疗草酸钙肾结石相关的潜在生物标志物及代谢通路,并对广金钱草中的有效成分夏佛塔苷在健康大鼠和草酸钙肾结石大鼠体内外的代谢物进行鉴定和比较。方法:将40只雄性SD大鼠随机分为5组(n=8):空白组、模型组、广金钱草小剂量给药组、中剂量给药组和大剂量给药组。造模及治疗结束后,收集各组大鼠的尿液、血清和肾组织,在显微镜下观察尿液涂片和肾组织切片。采用uhplc-q-tof-ms/ms技术对血清样本进行数据采集,采用Progenesis qI和SIMCA-P 14.1软件进行数据处理和分析。以满足P1的条件寻找各组间的差异性化合物并对其进行鉴定。然后通过在线平台Metabo Analyst 4.0和KEGG数据库,对得到的差异代谢物进行热图分析和代谢通路分析及广金钱草治疗草酸钙肾结石的潜在生物标志物的筛选。最后,利用Cytoscape软件,构建代谢物-基因-蛋白的生物信息网络图。采用uhplc-q-tof-ms/ms技术,根据代谢物分析策略,对夏佛塔苷在两种大鼠血浆、尿液、粪便、胆汁及肠道菌群温孵样品中的代谢产物进行结构推断,并比较夏佛塔苷在两种大鼠中代谢途径的不同。另外,运用相对定量的方法,寻找夏佛塔苷在两种大鼠中代谢物含量的差异。结果:在肾结石模型组与健康组大鼠之间鉴定出了72种差异代谢物,在广金钱草给药组与肾结石模型组大鼠之间鉴定出了88种差异代谢物,涉及的代谢通路主要包括鞘脂类代谢、苯丙氨酸代谢、泛酸盐和辅酶A生物合成和花生四烯酸代谢等。筛选出4羟双氢鞘氨醇、二氢神经鞘氨醇、Cer(d18:0/16:0)、L-苯丙氨酸和泛酸5种物质,作为广金钱草治疗肾草酸钙结石的潜在生物标志物。通过构建生物信息学网络,寻找到78种关键基因及50种相关蛋白。经口服夏佛塔苷后,在健康大鼠中共发现28种代谢物,在模型大鼠中共发现30种代谢物。主要的代谢途径包括脱糖反应、氧化反应、还原反应、乙酰化反应、内水解、甲基化反应、葡萄糖醛酸结合和硫酸化反应等。通过相对定量法比较夏佛塔苷在两种大鼠体内代谢物的含量,结果表明代谢物的含量在两种大鼠中存在差异。结论:本研究采用基于uhplc-q-tof-ms/ms技术的代谢组学方法,寻找与广金钱草治疗作用相关的潜在生物标志物和代谢途径,且构建了从代谢物到基因、蛋白的全面的生物学网络。这些研究结果有助于全面了解广金钱草治疗肾结石的生物学机制。此外,根据代谢物分析策略,鉴定了夏佛塔苷在健康大鼠及草酸钙肾结石大鼠体内外的代谢产物,并且从代谢物种类及含量两个层面比较了夏佛塔苷在两种大鼠中的不同。对夏佛塔苷在肾草酸钙结石模型动物内代谢的研究,有助于了解夏佛塔苷在临床应用中的代谢过程。

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冠心静胶囊指纹图谱及体内代谢研究

引用

作者：刘鑫河北医科大学

学位级别：硕士

目的:建立冠心静胶囊uhplc指纹图谱分析方法;鉴定冠心静胶囊在大鼠体内的吸收组分及代谢产物。方法:经样品前处理与检测条件考察,确定冠心静胶囊uhplc指纹图谱分析方法:样品采用60%甲醇超声提取,色谱分离采用Phenomenex Kinetex C18(2.1... 详细信息

目的:建立冠心静胶囊uhplc指纹图谱分析方法;鉴定冠心静胶囊在大鼠体内的吸收组分及代谢产物。方法:经样品前处理与检测条件考察,确定冠心静胶囊uhplc指纹图谱分析方法:样品采用60%甲醇超声提取,色谱分离采用Phenomenex Kinetex C18(2.1×100 mm,1.7μm)色谱柱,流动相为0.1%甲酸水溶液(A)-乙腈(B),梯度洗脱,检测波长为203 nm、280 nm;uhplc-q-tof-ms/ms方法结合对照品比对鉴定指纹图谱共有峰;分析单味药材指纹图谱,进行共有峰归属;联合中药色谱指纹图谱相似度评价、主成分分析(PCA)和系统聚类分析(HCA)分析,对11批冠心静胶囊样品进行质量评价。灌胃给予大鼠冠心静胶囊,收集不同时间的血浆、胆汁、尿液与粪便样品,经预处理后,采用uhplc-q-tof-ms/ms技术对其中吸收组分和代谢物进行鉴定。应用电喷雾电离(ESI)源,正负离子全扫描模式下分别采集数据;结合保留时间及质谱信息鉴定原型成分;利用质量亏损过滤(MDF)、产物离子过滤(PIF)和中性丢失过滤(NLF)等手段,结合生物转化规律以及原型药物的裂解规律等推断代谢物的结构。结果:11批样品在203 nm、280 nm两个波长下分别发现指纹图谱共有峰27个与29个,指认出13个,分别为原儿茶醛、芍药内酯苷、芍药苷、阿魏酸、丹酚酸D、红花黄色素A、迷迭香酸、肉桂酸、丹酚酸B,丹酚酸A、人参皂苷Rb1、洋川芎内酯A、蒿本内酯。11批样品相似度均在0.98以上,综合相似度评价、PCA分析与HCA分析结果,表明11批样品质量总体上较为稳定,但也有一定差异,造成差异的成分主要来源于丹参、赤芍、川芎、苏合香4味药材,提示在生产中要更加关注这几味药材的质量。各生物样品中共鉴定冠心静胶囊原型成分28种,其中血浆中9种,胆汁中16种,尿液中11种,粪便中10种,主要为酸类及其衍生物、二萜醌类、单萜及其苷类、黄酮类、苯肽类。鉴定代谢产物116种,血浆、胆汁、尿液、粪便中各有37、52、38、25种,苯肽类与酸类及其衍生物代谢产物较多,分别为44种与30种。结论:本研究建立了冠心静胶囊的uhplc指纹图谱分析方法,并基于uhplc-q-tof-ms/ms技术,初步研究了冠心静胶囊大鼠体内代谢物情况,为冠心静胶囊的质量控制提供了可行方法,为其药代动力学研究和物质基础的阐明提供了依据。

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