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拟南芥ucps超表达体构建与缺失突变体的筛选及UCP2和UCP6在种子萌发中的功能研究

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拟南芥UCPs超表达体构建与缺失突变体的筛选及UCP2和UCP6在种子萌...

作者：陈亚迪兰州大学

学位级别：硕士

线粒体解耦联蛋白（UCP,Uncoupling proteins）通过消除线粒体内膜两侧的跨膜质子梯度,使氧化与磷酸化解耦联,降低ATP产生,转化能量为热,被称为线粒体内膜上的“质子电化学势”能量耗散途径。已有的实验证据表明,ucps参与植物对逆境的... 详细信息

线粒体解耦联蛋白（UCP,Uncoupling proteins）通过消除线粒体内膜两侧的跨膜质子梯度,使氧化与磷酸化解耦联,降低ATP产生,转化能量为热,被称为线粒体内膜上的“质子电化学势”能量耗散途径。已有的实验证据表明,ucps参与植物对逆境的适应及生长发育过程。但是,其中具体的生理以及分子机制还不明确。为了从分子及遗传角度阐述ucps在植物的生长发育和逆境响应过程中发挥的作用,我们构建了ucps基因的超表达载体和GUS标记系载体,获得了相应的超表达及标记系植株。同时,我们还购买并筛选到ucps基因的T-DNA插入缺失突变体。在此基础上,以拟南芥ucp2和ucp6为材料,野生型（Col-0）为对照,探究了其在种子萌发过程所起的作用。主要研究结果如下:1:克隆ucps基因的CDS区（UCP1:At3g54110;UCP2:At5g58970;UCP4:At4g24570;UCP6:At5g09470）。利用Gateway技术成功将其连接到超表达载体p GWB2上,并成功筛选到对应基因的超表达植株。UCP1-OE的三个株系的表达量分别升高5.24倍、1.87倍和6.47倍;UCP2-OE的三个株系的表达量分别升高2.17倍、3.92倍和4.00倍;UCP4-OE的三个株系的表达量分别升高5.65倍、2.57倍和6.57倍;UCP6-OE的三个株系的表达量分别升高4.85倍、4.65倍和4.11倍。2:克隆UCP2和UCP6的启动子区域。将克隆的片段利用Gateway技术成功连接到GUS标记系p GWB3上,并成功筛选到对应基因的GUS标记系植株。3:通过q RT-PCR对ucps的表达模式分析结果显示:UCP1在根、茎、叶、花、果实和种子中均有较高的表达量;主要在花中表达的是UCP2;UCP2和UCP6主要在幼嫩种子中表达;UCP4在叶中的表达量较高。UCP2和UCP6的GUS染色结果进一步表明UCP2在花和发育中的种子及果荚中表达量较高;UCP6除了在种子中表达之外,还在雌蕊中表达,但是其在花药中基本不表达,这与UCP2的表达模式不同。4:从ABRC网站购买T-DNA突变体,经过鉴定、筛选出ucp2（SALK＿037074,SALK＿080118和SALK＿040242）和ucp6（SALK＿111403）的纯合体:在DNA及RNA水平验证上述突变体基因已经被完全敲除。为了进一步验证UCP2对非生物胁迫的响应,我们通过q RT-PCR发现:UCP2对4?C冷胁迫比较敏感,在处理4 h时,表达量升高了1.76倍,在24 h时表达量为1.85倍。除此之外,其对甘露醇、盐及脱落酸（ABA）也有响应,暗示UCP2可能在植物对逆境的响应中有作用。5:为了验证UCP2和UCP6是否在种子萌发过程中起作用,首先将ucp2、ucp6和Col-0铺在正常培养基上进行萌发实验。与Col-0相比,ucp2和ucp6萌发延迟,其中ucp2的两个突变体（Salk＿037074和Salk＿080118）萌发趋势一样,因此以后的实验只选取Salk＿037074。ucp2和ucp6株系在盐和甘露醇胁迫条件下种子萌发延迟并受到抑制。在外源添加不同浓度ABA时,ucp2和ucp6种子萌发延迟并对ABA有浓度依赖性。0.3μM ABA处理4 d时,Col-0萌发率已经达到78.7%,但是ucp2和ucp6却分别只有15.2%和9.6%。其次ucp2和ucp6子叶绿化率也受到了影响,在0.3μM ABA处理下,Col-0子叶绿化率为80.0%,但是ucp2和ucp6已经不能转绿。但是外源添加ABA对ucp2和ucp6萌发后的发育却基本没有影响。同时外源添加不同浓度的盐和甘露醇均能不同程度的延迟ucp2和ucp6的种子萌发。6:通过外源添加甘露醇、盐、ABA和赤霉素合成抑制剂多效唑（Paclobutrazol,PAC）,对UCP2pro::GUS和UCP6pro::GUS转基因系进行GUS染色后发现,UCP2和UCP6在这些胁迫处理时表达量急剧升高,这也进一步说明UCP2和UCP6在种子萌发中可能发挥着重要作用。q RT-PCR结果显示拟南芥种子萌发中的负调节因子ABI3、ABI4和ABI5在经过ABA处理的ucp2和ucp6中表达量升高,这就说明ucp2和ucp6在萌发过程中对ABA响应或许主要是通过ABI3、ABI4和ABI5实现的。综合上述结果:我们获得了ucps的超表达植株以及GUS标记植株,T-DNA插入缺失突变体。并初步探究了UCP2和UCP6在拟南芥种子萌发中的作用,在种子萌发过程中ucp2和ucp6对ABA响应主要是上调了ABI3、ABI4和ABI5基因的表达,进而使得ucp2和ucp6在外源添加ABA时,萌发延迟。该结果为深入研究ucps在植物生

关键词：拟南芥 ucps 种子萌发 ABA

Leptin对猪成肌细胞中PGC-1α和ucps mRNA表达的影响

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农业生物技术学报 2007年第4期15卷 644-648页

作者：文旭辉罗桂芬孙世铎杨公社西北农林科技大学动物脂肪沉积与肌肉发育实验室杨凌712100 西北农林科技大学动物脂肪沉积与肌肉发育实验室

采用链酶蛋白酶消化法获得猪成肌细胞、肌细胞生成素(MyoG)和生肌决定因子(MyoD)的RT-PCR和Desmin免疫组化染色鉴定猪成肌细胞后,分别研究外源Leptin对猪成肌细胞产热相关基因过氧化体增殖活化受体gamma辅助活化因子α(PGC-1α)和解偶... 详细信息

采用链酶蛋白酶消化法获得猪成肌细胞、肌细胞生成素(MyoG)和生肌决定因子(MyoD)的RT-PCR和Desmin免疫组化染色鉴定猪成肌细胞后,分别研究外源Leptin对猪成肌细胞产热相关基因过氧化体增殖活化受体gamma辅助活化因子α(PGC-1α)和解偶联蛋白家族(ucps)mRNA表达的影响。对产热相关基因的RT-PCR检测结果表明,30和100nmol/L Leptin均可促进成肌细胞中PGC-1α mRNA表达,100 nmol/L Leptin作用效果显著高于30 nmol/L,且作用24h促进效果明显优于12h作用效果(P<0.05)。30 nmol/L Leptin可明显提高成肌细胞中UCP2 mRNA的表达,且作用24h促进效果明显优于12h处理效果(P<0.05),100 nmol/L Leptin作用效果显著低于30n mol/L Leptin作用效果,但显著高于对照组(P<0.05)。30和100 nmol/L Leptin均不影响UCP3 mRNA的表达(P<0.05)。结果提示,Leptin可能通过上调PGC-1α和UCP2转录,促进成肌细胞能量消耗。

关键词： Leptin 成肌细胞 PGC-1α ucps

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中缅树鼩ucps组织分布及系统学研究

中缅树鼩UCPs组织分布及系统学研究

作者：张逊云南师范大学

学位级别：硕士

本论文从分子水平探讨冷驯化对解偶联蛋白表达的影响,同时探讨UCP1、UCP2、UCP3在BAT、肝脏、骨骼肌和脑中的组织分布情况,以及对中缅树鼩解偶联蛋白基因的系统进化分析。本论文主要分三个部分: 1.冷驯化对中缅树鼩肝脏、BAT和骨骼肌的... 详细信息

本论文从分子水平探讨冷驯化对解偶联蛋白表达的影响,同时探讨UCP1、UCP2、UCP3在BAT、肝脏、骨骼肌和脑中的组织分布情况,以及对中缅树鼩解偶联蛋白基因的系统进化分析。本论文主要分三个部分: 1.冷驯化对中缅树鼩肝脏、BAT和骨骼肌的总RNA和总蛋白含量的影响。 2.中缅树鼩UCP1,UCP2和UCP3在肝脏、BAT、骨骼肌和脑四种组织中的分布。 3.依据UCP1对中缅树鼩进行系统发育研究及解偶联蛋白族的系统进化研究。主要结果: 1.中缅树鼩经冷驯化28后,体重、肝脏和骨骼肌相对重量均显著增加。同时,三种组织中总RNA和总蛋白相对含量也达到显著增加的水平。 2.在BAT、肝脏、骨骼肌和脑四种组织中,检测到UCP1只在BAT中表达:UCP2在除了脑以外的其它三种组织均检测到:UCP3只在骨骼肌和BAT中检测到。 ***1RT-PCR后测序得到一段465bp的序列,将该序列与GeneBank中可利用的其它物种排序,构建了系统发生树。由系统树可见,中缅树鼩的进化地位与灵长类较接近。同一类型基因中进化关系较近的物种首先聚在一起。

关键词：树鼩 ucps 解偶联蛋白系统学研究骨骼肌细胞冷驯化系统发育研究小型哺乳动物 RNA 相对重量

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作者：文旭辉西北农林科技大学

学位级别：硕士

线粒体是细胞内重要的亚细胞器,普遍存在于真核细胞中,其通过呼吸作用将糖、蛋白、脂类等生物大分子物质氧化分解,释放ATP,为机体提供能量。目前研究表明,线粒体不仅与能量代谢密切相关,而且其也是影响肉质嫩度及风味的一个重要因素没,... 详细信息

线粒体是细胞内重要的亚细胞器,普遍存在于真核细胞中,其通过呼吸作用将糖、蛋白、脂类等生物大分子物质氧化分解,释放ATP,为机体提供能量。目前研究表明,线粒体不仅与能量代谢密切相关,而且其也是影响肉质嫩度及风味的一个重要因素没,本研究以猪为实验动物,（1）利用RT-PCR方法分析线粒体相关基因PGC-1α、UCP2、UCP3、Cyt-c、CPT-Ⅰ组织差异表达特点;（2）建立了猪骨骼肌卫星细胞的分离培养体系;（3）研究外源Leptin对猪成肌细胞中PGC-1α、ucps mRNA表达的影响。得出以下结论: ***-1α基因进行组织分布研究发现:心脏、肝脏、肌肉、肺脏、肾脏、脾脏、皮下脂肪和内脏脂肪中均有的PGC-1αmRNA表达,其中心脏、肝脏、肌肉的表达丰度最高, UCP2基因在、肌肉、皮下脂肪、肾脏、脾脏、内脏脂肪中均有表达,在心脏、肺中没有检测到表达,其中肾脏表达丰度最高,在肌肉中次之,肝脏中的表达量最低。而内脏脂肪和皮下脂肪中UCP2基因mRNA表达丰度差异不显著。UCP3基因在肌肉、皮下脂肪、内脏脂肪中均有表达,在其他几个组织中均没有检测到表达,肌肉、皮下脂肪、内脏脂肪UCP3基因mRNA表达丰度差异不显著。Cyt-c基因在心脏、肝脏、肌肉、皮下脂肪、肾脏、脾脏、内脏脂肪、脾脏和肺中均有表达,其中心脏中表达最高,肝脏、肌肉表达次之。CPT-Ⅰ基因mRNA在心脏、肝脏、肌肉、皮下脂肪、肾脏、脾脏、内脏脂肪、脾脏和肺中均有表达,其中肝脏中表达最高,心脏、肾脏、脾脏镖达次之,而皮下脂肪的表达量高于肌肉（P＜0.05）。 2用链酶蛋白酶、胰酶、胶原酶分别消化骨骼肌组织块,结果表明,链酶蛋白酶消化所获得的肌卫星细胞数显著高于胰酶和胶原酶。在一定的消化时间内,胶原酶消化的效果较差,消化物中含大量的肌束,所获得肌卫星细胞数量很少。三种酶消化所得细胞活率无显著差异。用Desmin抗体及ABC染液进行间接免疫酶染色,RT-PCR方法检测MyoG和MyoD的表达,结果显示链酶蛋白酶消化所得肌卫星细胞95%呈阳性反应,培养7天后MyoG和MyoD均有表达,说明分离得到是肌卫星细胞。 3半定量RT-PCR分析结果表明,30和100 nmol/L的Leptin均可促进PGC-1a转录, 100 nmol/L Leptin处理12 h后可促进PGC-1αmRNA表达;处理24 h后,PGC-1αmRNA水平显著高于对照组（p＜0.05）。30 nmol/L处理24 h后可提高PGC-1αmRNA水平,但其促进效果明显低于100 nmol/L处理组（p＜0.05）。半定量RT-PCR分析结果表明,30 nmol/L Leptin可明显提高成肌细胞中UCP2mRNA的表达,处理12和24 h后UCP2mRNA水平显著高于对照组,且作用24 h促进效果明显优于12 h处理效果（p＜0.05）,100 nmol/L Leptin提高成肌细胞中UCP2mRNA的表达,处理12和24 h后UCP2mRNA水平显著高于对照组,但作用效果显著低于12和24 h后30 nmol/L Leptin作用效果（p＜0.05）。30和100 nmol/L Leptin在时间上和剂量上,均不影响UCP3mRNA水平表达水平（p＜0.05）。综上所述,线粒体相关基因表达存在明显的组织差异性,PGC-1a在富含线粒体的组织中表达较高,表明其与线粒体发育存在明显相关。其它基因根据组织能量需求及代谢特点不同而表达有所差异。外源添加不同浓度的Leptin显著影响PGC-1α和UCP表达,提示leptin可通过调控线粒体而影响机体能量代谢。以上结论可为动物肌肉发育和控制人类相关代谢疾病的研究提供理论参考。

关键词：猪成肌细胞 PGC-1a ucps

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关于拷贝控制与连接保护技术的讨论

广播与电视技术 2008年第5期35卷 82-82,84-87页

作者：席岩王磊姚颖颖郭沛宇国家广播电影电视总局广播科学研究院

广播电视数字化的推进以及家庭消费电子设备的更新换代也大大增加了数字内容盗版的可能,给内容提供者和网络运营商造成了巨大的经济损失。近几年,国际上提出了各种拷贝控制和连接保护技术来保护数字内容,遏止盗版。首先,本文对国内外提... 详细信息

广播电视数字化的推进以及家庭消费电子设备的更新换代也大大增加了数字内容盗版的可能,给内容提供者和网络运营商造成了巨大的经济损失。近几年,国际上提出了各种拷贝控制和连接保护技术来保护数字内容,遏止盗版。首先,本文对国内外提出的拷贝控制和连接保护技术,如针对光盘的拷贝控制技术CPPM、CPRM、DVDCSS,AACS,以及连接保护技术DTCP、HDCP和ucps等进行了讨论分析。然后,提出在现阶段可以将广播标记技术与拷贝控制技术、连接保护技术联合使用,构建一个过渡阶段使用的开放的数字内容保护系统。

关键词： DTCP HDCP CPPM CPRM DVD CSS AACS ucps

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解偶联蛋白对动物能量代谢的作用

动物营养学报 2006年第B12期18卷 310-315页

作者：仲明张宏福杨琳董枫岚王润平动物营养学国家重点实验室北京100094 华南农业大学动物科技学院广州510642

生物体内能量平衡问题始终是营养学研究的主要内容。已知影响生物体内能量平衡的因素很多,由解偶联蛋白(uncoupling proteins,ucps)调控能量诱发脂肪组织和肌肉组织的生热作用是影响机体能量平衡的重要因素之一。本文综述了近年来ucps... 详细信息

生物体内能量平衡问题始终是营养学研究的主要内容。已知影响生物体内能量平衡的因素很多,由解偶联蛋白(uncoupling proteins,ucps)调控能量诱发脂肪组织和肌肉组织的生热作用是影响机体能量平衡的重要因素之一。本文综述了近年来ucps的研究进展,着重论述了ucps产热机制及其基因表达的影响因素,为深入开展ucps能量代谢调控方面的研究奠定基础。

关键词： ucps mRNA 基因表达能量代谢

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鸡解耦联蛋白基因的研究进展

江西农业学报 2010年第10期22卷 133-134页

作者：杨艳刘华贵赵兴波北京市农林科学院畜牧兽医研究所北京100097 江西省畜牧技术推广站江西南昌330077 中国农业大学动物科技学院北京100094

鸡解耦联蛋白(ucps)是对机体能量平衡涉及的增重、静止代谢率和能量转化效率等性状起显著影响的基因家族,禽类解耦联蛋白(avUCP)是近年来在禽类发现的新UCP基因家族成员,被认为在禽类能量代谢中起着重要的作用。综述了近年来avUCP在家... 详细信息

鸡解耦联蛋白(ucps)是对机体能量平衡涉及的增重、静止代谢率和能量转化效率等性状起显著影响的基因家族,禽类解耦联蛋白(avUCP)是近年来在禽类发现的新UCP基因家族成员,被认为在禽类能量代谢中起着重要的作用。综述了近年来avUCP在家禽方面的研究现状。

关键词：解耦联蛋白基因研究进展基因家族禽类能量转化效率静止代谢率研究现状能量平衡能量代谢家族成员增重性状家禽机体 ucps

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解偶联蛋白与低氧寒冷的关系

实用糖尿病杂志 2011年第4期7卷 9-11页

作者：李云凤李冬梅呼和浩特内蒙古自治区医院内分泌科 010017

机体能量代谢是一个非常复杂的过程,线粒体在能量代谢中发挥着重要作用。解偶联蛋白（uncoupling proteins,ucps）是线粒体内膜上具有调节质子跨膜转运作用的蛋白家族,能够降低线粒体内膜上的质子梯度,使呼吸链和ATP合成解偶联,将产能... 详细信息

机体能量代谢是一个非常复杂的过程,线粒体在能量代谢中发挥着重要作用。解偶联蛋白（uncoupling proteins,ucps）是线粒体内膜上具有调节质子跨膜转运作用的蛋白家族,能够降低线粒体内膜上的质子梯度,使呼吸链和ATP合成解偶联,将产能转化为产热,提高静息代谢率。ucps在适应性产热、体重调节和新陈代谢中发挥着重要作用。

关键词：解偶联蛋白适应性产热低氧能量代谢体重调节 ATP合成线粒体 ucps

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解偶联蛋白mRNA研究进展

中国畜牧兽医 2003年第1期30卷 23-26页

作者：陈文陈代文黄艳群谭雪梅四川农业大学动物营养研究所雅安625014 河南农业大学牧医工程学院郑州450002

解偶联蛋白 (ucps)是机体组织特异表达的线粒体内膜蛋白质 ,有阻止肥胖的作用。 ucps有 5种同族体 ,UCP1在啮齿类动物调节动物体重、维持体温有重要作用。UCP2主要存在于成年大型动物和人类 ,与糖尿病有关。UCP3主要存在于骨骼肌和啮齿... 详细信息

解偶联蛋白 (ucps)是机体组织特异表达的线粒体内膜蛋白质 ,有阻止肥胖的作用。 ucps有 5种同族体 ,UCP1在啮齿类动物调节动物体重、维持体温有重要作用。UCP2主要存在于成年大型动物和人类 ,与糖尿病有关。UCP3主要存在于骨骼肌和啮齿类动物的棕色脂肪组织中 ,提供非颤抖的生热作用。UCP4是小鼠和非人类的灵长目动物大脑特有的线粒体 ucps同族体 ,可能与控制食欲有关。UCP5存在于人和小鼠的多种组织 ,在大脑和附睾特别丰富 ,受寒冷和绝食的影响。在 ucps转基因或基因敲出的实验动物可改善肥胖症。 ucps同族体受到多种因子调控。食物调节影响ucps m RNA同族体在不同组织的特异表达。高等植物线粒体 ucps同族体 PUMP、st

关键词：解偶联蛋白 mRNA 肥胖调控因子食物调节 ucps 同族体解偶联作用线粒体内膜蛋白质