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阿尔兹海默症相关蛋白U1-70K的LC domain的液-液相分离与聚集研究

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作者：龚瑞北京化工大学

学位级别：硕士

Aβ和tau的聚集是阿尔兹海默症(AD)的病理标识之一。以Aβ为靶点开发的药物在临床阶段的失败以及可溶性tau蛋白转变为神经纤维缠结的病理机制的不明确使得人们开始寻找新的潜在致病靶点,以期开发有效的治疗药物。蛋白质液-液相分离(LLPS... 详细信息

Aβ和tau的聚集是阿尔兹海默症(AD)的病理标识之一。以Aβ为靶点开发的药物在临床阶段的失败以及可溶性tau蛋白转变为神经纤维缠结的病理机制的不明确使得人们开始寻找新的潜在致病靶点,以期开发有效的治疗药物。蛋白质液-液相分离(LLPS)促进了许多无膜细胞器的形成,并且与由蛋白聚集所造成的神经退行性疾病相关。有研究表明U1-70K在AD病人脑中聚集,位于其C端的低复杂度区域是其聚集的核心。因此,研究U1-70K的聚集机制和LLPS的能力以及两者的关系为AD的病理学研究和新药开发提供了思路。本研究用基因工程的方法构建了分别载有LC1和LC2的重组质粒pET-28a-LC1-EGFP、pET-28a-LC2、pGEX-6P-1-LC1 和 pGEX-6P-1-LC2,使用大肠杆菌表达并用合适的纯化方法得到EGFP-LC1、EGFP-LC2、GST-LC2和LC2蛋白。ThT荧光动力学测试发现GST-LC2和LC2在体外会聚集,通过TEM表征观察到EGFP-LC1、GST-LC2和LC2形成的聚集体呈现梭状。浊度实验和共聚焦显微镜表征发现LC1和LC2在体外会经历LLPS形成液滴,并且LC1比LC2的LLPS能力更强。荧光漂白恢复(FRAP)实验验证了两个片段通过LLPS形成的是液滴而不是水凝胶或聚集体。在LC1和LC2的LLPS体系中加入氨基酸Arg、Asp或Ala,LLPS的浊度和形成的液滴形貌均发生了变化。初步说明LC1的LLPS的推动力是静电相互作用力,LC2的LLPS的推动力包括静电相互作用力和疏水作用力。本研究通过共聚焦显微镜观察到LC1、LC2和LC在N2a细胞中会经历LLPS形成液滴,且LC1和LC会形成不规则聚集体。FRAP实验证明LC1和LC能从液滴状态转变为聚集状态,这在一定程度上说明U1-70K在AD脑中聚集的过程,也表明U1-70K的LLPS与AD的发病机制存在潜在关系。

关键词：阿尔兹海默症 U1-70K 低复杂度区域液-液相分离聚集

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固有无序蛋白的液-液相分离和聚集的机制研究

固有无序蛋白的液-液相分离和聚集的机制研究

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作者：何凡奇北京化工大学

学位级别：硕士

目前越来越多的研究报道表明固有无序蛋白(IDPs)的液-液相分离(LLPS)与包括神经退行性疾病和癌症在内的多种疾病密切相关。了解LLPS和聚集的机制以及两者之间的关系,能为了解疾病和寻找治疗方法提供新的途径。本论文主要着力于IDPs的无... 详细信息

目前越来越多的研究报道表明固有无序蛋白(IDPs)的液-液相分离(LLPS)与包括神经退行性疾病和癌症在内的多种疾病密切相关。了解LLPS和聚集的机制以及两者之间的关系,能为了解疾病和寻找治疗方法提供新的途径。本论文主要着力于IDPs的无序序列在体外的LLPS和聚集机制的研究。针对朊病毒样区域(PLD)和低复杂度序列(LCD)两种不同的类型的无序序列,选择了 RBM14蛋白和U1-70K蛋白中的无序区域作为研究对象,并分别提出了它们在体外自主装的机制。研究发现含有Y[G/N/A/S]AQ或者[S/G]YG重复特征序列的RBM14的PLD序列R(284-572)有强烈的聚集倾向,在无拥挤剂的环境中能够自发进行LLPS。其聚集体中很有可能富含β-折叠结构。其中驱动相分离和聚集的主要作用力可能是疏水作用和共轭-共轭相互作用,其中酪氨酸提供的酚羟基可能是聚集的主要驱动力来源。对于蛋白U1-70K,本研究发现了由交叉正负电荷重复的序列诱导形成LLPS的新模式。其中LC1的氨基酸组成较为单一,LLPS的主要驱动力是静电相互作用;LC2含有的氨基酸种类较多,LLPS的主要驱动力除静电相互作用之外,还有疏水作用和与环境中阴离子的相互作用。序列中的碱性残基提供的阳离子在LLPS过程贡献了很多的作用。对U1-70K的LC的LLPS行为和机制的研究结果将为进一步研究其与阿尔兹海默症之间的关系提供重要依据。

关键词：固有无序蛋白(IDPs) 液-液相分离(LLPS) 聚集 RBM14 U1-70K

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神经退行性疾病相关蛋白相分离和聚集的调控机制

神经退行性疾病相关蛋白相分离和聚集的调控机制

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第十一届全国化学生物学学术会议

作者：薛松龚瑞何凡奇罗施中北京化工大学生命科学与技术学院

蛋白质的液-液相分离(Liquid-Liquid Phase Separation),简称相分离(或相变),作为一种蛋白质的组装形式在多种无膜细胞器(如核仁,PML小体等)的动态组装和维持中起着关键的作用,同时最近的研究表明固有无序蛋白的相分离与包括神经退行性... 详细信息

蛋白质的液-液相分离(Liquid-Liquid Phase Separation),简称相分离(或相变),作为一种蛋白质的组装形式在多种无膜细胞器(如核仁,PML小体等)的动态组装和维持中起着关键的作用,同时最近的研究表明固有无序蛋白的相分离与包括神经退行性疾病和癌症在内的多种疾病密切相关。因此了解蛋白质相分离的调控机制以及和聚集之间的关系,能为了解疾病的发生机制和寻找治疗方法提供新的途径。本课题组长期从事神经退行性疾病相关蛋白的结构与功能研究。针对U1-70K通过C端无序区域(LC domain)相互作用聚集在在AD病人脑中,本研究主要着力于U1-70K无序序列相分离的分子机制和聚集调控的研究。采用基因工程的方法构建了含有U1-70K无序序列的融合蛋白,通过相关生化实验表明U1-70K的LC区域存在有相分离过程,并验证了其相分离的主要推动力是静电相互作用力,并提出了一种全新的促进蛋白相分离的正负电荷交替的静电作用模式。进一步通过细胞实验验证了LC在N2a细胞中通过相分离形成液滴,并最终从液滴状态转变为聚集状态,从而说明U1-70K在AD脑中聚集的过程,也表明U1-70K的相分离与AD的发病机制存在潜在关系。因此,研究U1-70K的聚集机制和相分离的调控以及两者的关系为AD的病理学研究和新药开发提供了新的思路。

关键词：相分离 U1-70K LC domain 静电相互作用聚集

来源： cnki会议评论

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