检索结果-南通市图书馆

作者：刘炀南华大学

学位级别：硕士

目的:构建实验性糖尿病合并梅毒兔模型,动态观察肝肾功能改变,检测其心、肺、肝、肾组织在发病过程中的病理及生理变化及硫氧还蛋白相互作用蛋白(thioredoxin-interacting protein,txnip)在肾脏的表达情况,为深入研究txnip在肾损伤中的... 详细信息

目的:构建实验性糖尿病合并梅毒兔模型,动态观察肝肾功能改变,检测其心、肺、肝、肾组织在发病过程中的病理及生理变化及硫氧还蛋白相互作用蛋白(thioredoxin-interacting protein,txnip)在肾脏的表达情况,为深入研究txnip在肾损伤中的分子机制及糖尿病合并梅毒治疗思路提供实验依据。方法:1、动物模型的建立:29只新西兰雄兔,进行适应性喂养一周,随机分成4组,正常对照组(C组)5只,常规饲养;单独糖尿病组(DM组)8只,采用耳缘静脉一次性注射100mg/kg四氧嘧啶诱导;单独梅毒组(Tp组)8只,采用睾丸接种梅毒螺旋体(Treponema Pallidum,TP)法;糖尿病合并梅毒组(H组)8只,采用四氧嘧啶诱导糖尿病再接种梅毒螺旋体致其感染合并模型。以空腹血糖>16.0mmol/l作为糖尿病造模成功的标准;TP镀银染色阳性且TPPA阳性作为梅毒造模成功标准。2、生化指标的测定:模型稳定后每两周抽一次耳缘静脉血,观察兔血清中空腹血糖(FBG)、空腹胰岛素(INS)、血清白蛋白(ALB)、谷丙转氨酶(ALT)尿素氮(BUN)、肌酐(Cr)水平随病程发展的变化情况。3、病理学检查:留取兔心、肺、肝、肾脏标本做病理切片,HE染色及肾组织免疫组化,观察各组织病理变化及硫氧还蛋白相互作用蛋白(txnip)在肾脏的表达情况。结果:1、通过注射四氧嘧啶成功构建了糖尿病兔模型,以空腹血糖持续>16.0mmol/l作为糖尿病造模成功的标准;成功复苏TP Nichols菌株,并成功感染实验兔,构建梅毒兔模型,以TP镀银染色阳性且TPPA阳性作为梅毒造模成功标准;同时通过先注射四氧嘧啶致糖尿病再接种TP感染梅毒的方法成功构建了糖尿病合并梅毒兔模型,以空腹血糖持续>16.0mmol/l且TP镀银染色、TPPA阳性作为造模成功标准。2、随实验时间的推移,DM组、H组血糖明显升高,胰岛素逐渐降低,但DM组与H组比较(P>0.05)无统计学意义。自第8周起,H组兔随实验时间增长BUN、Cr及ALT明显升高,而ALB明显降低,与单独疾病组相比(Ptxnip在肾脏表达量增加,且合并组表达上升更明显(Ptxnip高表达有关。

关键词：糖尿病梅毒兔模型组织损伤 txnip

ceRNA网络分析预测糖尿病足溃疡发生的关键靶点

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ceRNA网络分析预测糖尿病足溃疡发生的关键靶点

作者：侯文潭山东大学

学位级别：硕士

目的:糖尿病足溃疡(Diabetic footulcer,DFU)是糖尿病常见且最严重的并发症之一,具有高发病率、高致残率、高致死率以及高复发率等临床特征,严重影响糖尿病患者肢体健康,同时对社会产生极大的医疗负担,阐明DFU的病理发生机制有望为揭示... 详细信息

目的:糖尿病足溃疡(Diabetic footulcer,DFU)是糖尿病常见且最严重的并发症之一,具有高发病率、高致残率、高致死率以及高复发率等临床特征,严重影响糖尿病患者肢体健康,同时对社会产生极大的医疗负担,阐明DFU的病理发生机制有望为揭示其潜在发病原因,制定临床干预策略提供基础,因此积极探究DFU的病理变化机制是糖尿病研究领域的热点。既往研究表明DFU的病理生理机制是复杂且多因素的,主要包括神经病变、血管病变、创伤合并感染和异常的足部生物力学等。环状RNA(circular RNA,circRNA)通过竞争性地吸附微RNA(microRNA,miRNA)来调节信使RNA基因(messenger RNA,mRNA)表达,构成竞争性内源 RNA(competing endogenous RNA,ceRNA)作用网络,参与诸多疾病的病理变化过程,然而有关ceRNA网络是否参与DFU的发生发展过程的文献鲜有报道,同时ceRNA网络中的关键靶点亦需进一步阐明。因此本文致力于构建DFU的circRNA-miRNA-mRNA网络,识别预测ceRNA网络中的关键靶点,结合临床队列验证分析其临床意义。材料与方法:基于美国国立生物信息中心(National Center for Biotechnology Information,NCBI)的基因表达综合数据库(Gene Expression Omnibus,GEO)下载circRNA 数据集 GSE114248、miRNA 数据集 GSE84971 以及 mRNA 数据集 GSE134431和GSE80178,通过R语言“limma”包分别对circRNA、miRNA和mRNA的表达谱进行差异分析,筛选出差异表达基因,采用circBank数据库预测与差异表达circRNAs相结合的miRNAs,同时将差异miRNAs与预测miRNAs做交集处理;同时采用miRtarbase数据库预测与重叠miRNAs相结合的mRNAs,对差异mRNAs及预测的mRNAs取交集,保留与差异表达circRNAs和miRNAs两者均结合的miRNAs和mRNAs,构建circRNA-miRNA-mRNA网络并使用Cytoscape软件可视化,随后利用String数据库挖掘ceRNA网络中mRNAs分子的相互作用关系,构建蛋白质互作网络图(protein-protein interaction,PPI),采用京都基因与基因组百科全书(kyoto encyclopedia of genes and genomes,KEGG)和基因本体论(gene ontology,GO)分析对mRNAs进行通路和功能分析,并采用四种拓扑结构分析算法分析PPI中的拓扑属性关系,筛选关键基因,并构建基于关键基因的ceRNA网络。此外针对确定的关键基因,分别收集正常志愿者(健康人组)、未合并糖尿病足溃疡的糖尿病患者(non-DFU组)以及糖尿病足溃疡患者(DFU组)肘静脉血标本、基线及临床资料,利用实时荧光定量PCR技术(real-time fluorescent quantitative PCR,qRT-PCR)验证关键基因在健康人组与non-DFU组、DFU组血清之间的相对表达量,同时采用logistics回归分析DFU的危险因素,并采用受试者工作曲线(receiver operator characteristic curve,ROC)分析关键基因表达量对DFU发生的预测价值。结果:通过差异分析联合靶向预测筛选出候选1 1个circRNAs、12个miRNAs以及17个mRNAs,并成功构建DFU相关的circRNA-miRNA-mRNA网络,对17个mRNAs进行GO分析发现mRNAs基因主要富集在核因子κB转录因子活性、氧化还原酶活性、细胞—细胞粘附连接等功能。而KEGG分析则显示mRNAs涉及丝裂原激活的蛋白激酶信号通路、Wnt信号通路、Hedgehog信号通路等。通过分析基于mRNAs构建PPI的拓扑属性获取关键基因并取交集,得出早期反应基因3(immediate early response 3,IER3)、硫氧还蛋白相互作用蛋白(Thioredoxin interacting protein,txnip)、BCL-2/腺病毒 E1B 19-kDa 相互作用蛋 3(BCL2/adenovirus EIB 19 kDa protein-interacting protein 3,BNIP3)为PPI网络的关键靶点,结合ceRNA网络分析获得3个circRNA-miRNA-关键基因网络图,分别是:txnip 是 circ0000907-miR-34a-5p、circ0092299-miR-302d-3p、circ00 1

关键词：糖尿病足溃疡生物信息学方法 ceRNA txnip 诊断

环状RNA circECE1通过稳定c-Myc来调节糖代谢进而影响骨肉瘤的生长

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环状RNA circECE1通过稳定c-Myc来调节糖代谢进而影响骨肉瘤的生长

作者：姚腾浙江大学

学位级别：硕士

背景:骨肉瘤是最常见的恶性骨肿瘤之一,预后较差。研究表明环状RNA（circ RNA）参与骨肉瘤的进展,但参与骨肉瘤进展的机制仍需进一步的探究。在这里,我们报道了一种环状RNA-CircECE1,一种源自人类ECE1基因的环状RNA,在骨肉瘤的能量代谢... 详细信息

背景:骨肉瘤是最常见的恶性骨肿瘤之一,预后较差。研究表明环状RNA（circ RNA）参与骨肉瘤的进展,但参与骨肉瘤进展的机制仍需进一步的探究。在这里,我们报道了一种环状RNA-CircECE1,一种源自人类ECE1基因的环状RNA,在骨肉瘤的能量代谢中起关键作用。方法:我们通过进行RNA免疫沉淀芯片序列分析找到CircECE1,通过过表达或敲低CircECE1在骨肉瘤细胞中的表达量来验证CircECE1在骨肉瘤中的功能。通过RNA免疫沉淀和蛋白免疫沉淀来验证CircECE1对蛋白c-Myc的调控以及circ ECE1和SPOP之间的竞争结合关系,从而验证CircECE1通过c-Myc/txnip轴调节骨肉瘤的糖代谢。结果:我们发现CircECE1在肿瘤组织和骨肉瘤细胞143B和U2OS中高度表达,并且发现CircECE1在体外和体内抑制肿瘤的增殖和转移能力。此外,CircECE1在体内和体外显著促进肿瘤细胞的葡萄糖代谢。从机制上看,CircECE1与c-Myc相互作用以抑制SPOP介导的c-Myc泛素化和降解。而c-Myc又可以抑制硫氧还蛋白结合蛋白（txnip）的转录,从而激活糖酵解途径。结论:CircECE1通过c-Myc/txnip轴调节瓦伯格效应。CircECE1介导的信号转导在骨肉瘤进展和能量代谢中起着重要作用。这些发现可能为骨肉瘤的分子治疗带来新的靶标。

关键词：骨肉瘤环状RNA CircECE1 c-Myc 糖代谢 txnip

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美脲双胍降糖作用及机制研究

美脲双胍降糖作用及机制研究

作者：曾鸿芳重庆医科大学

学位级别：硕士

研究背景2型糖尿病（T2DM）是最常见的糖尿病类型,增加胰岛素的产生、提高免疫力和减少血糖含量是治疗糖尿病的关键目标。尽管现在临床上使用的降糖药物种类繁多,但由于它们的副作用和治疗效果有限,其实用性受到了限制。因此,新型降糖... 详细信息

研究背景2型糖尿病（T2DM）是最常见的糖尿病类型,增加胰岛素的产生、提高免疫力和减少血糖含量是治疗糖尿病的关键目标。尽管现在临床上使用的降糖药物种类繁多,但由于它们的副作用和治疗效果有限,其实用性受到了限制。因此,新型降糖药物的开发一直是医药界研究的热点。美脲双胍（GM）是格列美脲与二甲双胍以1:1摩尔比合成的非共价键加合物共晶体,是重庆医科大学药学院研发拥有自主知识产权的候选药物。本课题的研究目的是明确美脲双胍的降糖作用,并初步探讨其作用机制。研究方法1.美脲双胍降糖作用研究1.1.选用db/db小鼠为实验动物模型,进行体内药效学实验研究:1.1.1.检测美脲双胍对db/db小鼠体重、摄食量及血糖等的影响;1.1.2.采用生化法检测美脲双胍对db/db小鼠血脂四项及糖化血红蛋白的影响;1.1.3.采用HE染色检测美脲双胍对db/db小鼠胰腺及肝脏组织病变的影响;1.1.4.采用RT-qPCR检测美脲双胍对db/db小鼠胰腺组织中胰岛素mRNA的影响;1.1.5.采用免疫组化和ELISA检测美脲双胍对db/db小鼠胰腺组织中胰岛素分泌的影响。2.美脲双胍降糖作用机制研究2.1.在大鼠胰岛瘤INS-1细胞及小鼠胰岛瘤MIN-6细胞上构建高糖损伤模型模拟体内高糖环境:2.1.1采用MTT检测不同浓度葡萄糖对INS-1及MIN-6细胞活力的影响;2.1.2采用RT-qPCR检测不同浓度葡萄糖对INS-1及MIN-6细胞Bax mRNA的影响;2.1.3采用Western blotting检测不同浓度葡萄糖对INS-1及MIN-6细胞cleaved-caspase 3、caspase 3、Bax及bcl-2蛋白的影响。2.2.在高糖损伤模型基础上,初步探讨美脲双胍体外降糖作用机制:2.2.1.采用ELISA检测美脲双胍在高糖环境下对INS-1及MIN-6细胞胰岛素分泌的影响;2.2.2.采用RT-qPCR检测美脲双胍在高糖环境下对INS-1及MIN-6细胞胰岛素及txnip mRNA的影响;2.2.3.采用Western blotting检测美脲双胍在高糖环境下对INS-1及MIN-6细胞AMPK、p-AMPK、txnip、p-STAT3、STAT3及MaFA蛋白的影响,并检测加入AMPK激动剂与抑制剂后美脲双胍在高糖环境下对INS-1及MIN-6细胞AMPK、p-AMPK、txnip蛋白的影响。2.3.美脲双胍体内降糖作用机制验证:2.3.1.采用RT-qPCR检测美脲双胍对db/db小鼠胰腺及肝脏组织中txnip mRNA的影响;2.3.2.采用Western blotting检测美脲双胍对db/db小鼠胰腺及肝脏组织中AMPK、p-AMPK、txnip、p-STAT3、STAT3及MaFA（仅在胰腺中表达,因此肝脏中不检测）蛋白的影响。研究结果1.美脲双胍具有良好的降糖作用1.1.美脲双胍可以显著降低db/db小鼠血糖及糖化血红蛋白水平,并且在第4周显著降低db/db小鼠摄食量及体重;***检测结果表明,美脲双胍可以改善db/db小鼠肝脏组织病理学形态变化;1.3.免疫组化与ELISA结果表明,美脲双胍可以显著增加db/db小鼠胰腺组织中胰岛素分泌;***-qPCR结果表明,美脲双胍可以显著增加db/db小鼠胰腺组织中胰岛素mRNA水平。2.美脲双胍通过激活AMPK/txnip/MaFA信号通路发挥降糖作用***、RT-qPCR和Western blotting结果表明,当葡萄糖浓度为33.33 mmol/L时,可以成功构建高糖损伤模型进行后续实验研究;***-qPCR、ELISA和Western blotting结果表明,在高糖环境下,美脲双胍可以显著增加INS-1及MIN-6细胞胰岛素分泌;***-qPCR和Western blotting结果表明,在高糖环境下,美脲双胍显著上调INS-1及MIN-6细胞p-AMPK、p-STAT3和MaFA蛋白表达,下调txnip蛋白与mRNA表达;加入AMPK激动剂及抑制剂处理后美脲双胍在INS-1细胞中上调p-AMPK与下调txnip程度与AMPK激动剂基本一致,并且可以逆转AMPK抑制剂对txnip的上调作用;***-qPCR和Western blotting结果表明,美脲双胍显著上调db/db小鼠胰腺及肝脏组织中p-AMPK和p-STAT3蛋白的表达,显著上调db/db小鼠胰腺中MaFA蛋白的表达,显著下调db/db小鼠胰腺及肝脏组织中txnip蛋白与mRNA表达。研究结论美脲双胍可有效降低db/db小鼠血糖及糖化血红蛋白水平,改善其肝脏组织病理学病变,其机制可能与激活AMPK/txnip/MaFA信号通路,进而增加胰岛素分泌水平有关。

关键词： 2型糖尿病共晶 AMPK txnip

miR-20a对AA大鼠模型滑膜细胞中NLRP3炎症小体的调控作用及其机制的研究

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miR-20a对AA大鼠模型滑膜细胞中NLRP3炎症小体的调控作用及其机制...

作者：沈文文安徽医科大学

学位级别：硕士

类风湿性关节炎(Rheumatoid arthritis,RA)是一种发病机制未明的,以滑膜炎症和关节结构破坏为特征的异质性、系统性、自身免疫性疾病。研究表明成纤维样滑膜细胞(FLS)在RA的发生发展中起着至关重要的作用,FLS异常增殖和侵袭,并形成血管... 详细信息

类风湿性关节炎(Rheumatoid arthritis,RA)是一种发病机制未明的,以滑膜炎症和关节结构破坏为特征的异质性、系统性、自身免疫性疾病。研究表明成纤维样滑膜细胞(FLS)在RA的发生发展中起着至关重要的作用,FLS异常增殖和侵袭,并形成血管翳,最终导致了关节和软骨的破坏。IL-1β被认为是重要的致FLS活化的炎症因子。NLRP3为模式识别受体NOD样受体(NLR)家族中一员,其构成的NLRP3炎症小体能够活化Caspase-1,促进IL-1β的成熟和释放。硫氧还蛋白相互作用蛋白(txnip)作为一种氧化还原调节器,在ROS激活NLRP3炎症小体的途径中扮演重要角色,但具体调控机制未明。近年来的研究显示microRNAs参与基因转录后水平调控,广泛参与到细胞增殖、分化、凋亡等一系列重要的生物学进程,并且在炎症的发生发展中起到调控作用。miR-20a属于MicroRNA17～92家族,其在RA中异常表达,且在巨噬细胞介导的炎症反应中发挥调节作用。mi R-20a是否对NLRP3介导的IL-1β释放具有调控作用,目前尚未见文献报道。本研究观察NLRP3、txnip以及miR-20a在AA大鼠模型FLS中的表达变化,并深入探讨NLRP3炎症小体对炎症因子IL-1β、MMP-1、TIMP-1的释放以及mi R-20a对NLRP3炎症小体活化的影响及其作用的分子机制,以寻求干预RA的新的作用靶点。主要研究内容概括如下:1.大鼠aa模型的建立实验选择佐剂性关节炎(adjuvantarthritis,aa)模型,因aa病理特征与ra相似,所以aa模型作为动物研究对象,fls作为细胞研究对象。采用弗氏完全佐剂构建aa大鼠模型,分别通过测量大鼠继发性足肿胀、多发性关节炎指数、脾及胸腺指数以及关节组织病理学染色来确认大鼠aa模型成功建立。结果显示:模型组大鼠继发侧足肿胀、多发性关节炎指数、脾及胸腺指数均明显高于正常组,关节组织病理学染色显示:模型组滑膜明显增生,滑膜衬里层细胞增加至3-5层甚至更多,且伴有大量炎症细胞浸润和血管翳生成等现象。结果提示:aa模型成功建立。***3炎症小体在aa大鼠滑膜细胞中对炎症因子释放的影响及其作用机制采用酶联免疫吸附试验(elisa)检测aa大鼠血清中il-1β和细胞上清培养液中il-1β、mmp-1、timp-1的变化,并使用10ng/ml的il-1β刺激fls,观察不同时间组fls增殖情况,探讨炎症因子il-1β在aa发生发展中的作用,结果显示:aa大鼠血清中il-1β的分泌明显增加;在培养的模型组fls上清培养液中,同样检测到分泌增加的il-1β、mmp-1、timp-1,并且炎症因子刺激实验证明,il-1β能够促进fls的增殖,与aa的发病进程密切相关。nlrp3炎症小体的活化能够促进il-1β的成熟和释放。为探讨nlrp3炎症小体在ra中扮演的角色,蛋白印迹(westernblot)法分析大鼠滑膜组织和fls中nlrp3蛋白的表达变化,qrt-pcr分析大鼠fls中nlrp3/asc/casp-1mrna的表达,并通过脂质体lipofectaminetm2000瞬时转染nlrp3-sirna,在fls中沉默nlrp3,qrt-pcr和westernblot检测nlrp3/asc/casp-1mrna和蛋白的表达,elisa检测炎症因子il-1β、mmp-1、timp-1的表达,观察其对nlrp3炎症小体表达和炎症因子il-1β、mmp-1、timp-1释放的影响。结果表明:nlrp3在aa大鼠滑膜组织中的表达明显升高,在提取的fls中,同样检测到蛋白水平和mrna水平异常表达的nlrp3/asc/casp-1;小干扰rna沉默nlrp3,能够下调nlrp3/asc/casp-1的表达,并且抑制炎症因子il-1β、mmp-1、timp-1的分泌。提示:aa大鼠nlrp3炎症小体高表达,并且和炎症因子il-1β、mmp-1、timp-1的释放密切关联。***对nlrp3的表达及炎症因子释放的影响为了探讨txnip是否对nlrp3的表达具有调控作用以及其和炎症因子异常表达的联系,采用westernblot法分析aa模型大鼠滑膜组织和fls中txnip的表达水平,qrt-pcr法检测fls中txnipmrna的表达情况,并采用小干扰rna技术,通过脂质体lipofectaminetm2000瞬时转染txnip-sirna,qrt-pcr和westernblot检测nlrp3/asc/casp-1mrna和蛋白的表达,elisa检测炎症因子il-1β、mmp-1、timp-1的表达,观察其对nlrp3炎症小体表达和炎症因子il-1β、mmp-1、timp-1释放的影响。结果表明:txni

关键词： miR-20a txnip NLRP3炎症小体 IL-1β、MMP-1、TIMP-1 RA

O-GlcNAc修饰调控牛卵泡颗粒细胞和体外成熟卵母细胞葡萄糖代谢的机制研究

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O-GlcNAc修饰调控牛卵泡颗粒细胞和体外成熟卵母细胞葡萄糖代谢的...

作者：王腾飞中国农业科学院

学位级别：硕士

O-β-N-乙酰葡糖胺(O-linked beta-N-acetylglucosamine,O-Glc NAc)修饰是一种重要的蛋白质翻译后修饰,在调节卵母细胞减数分裂成熟、早期胚胎发育等方面发挥重要作用。本文从作为感受微环境营养状态的O-Glc NAc修饰层面分别研究了O-Glc... 详细信息

O-β-N-乙酰葡糖胺(O-linked beta-N-acetylglucosamine,O-Glc NAc)修饰是一种重要的蛋白质翻译后修饰,在调节卵母细胞减数分裂成熟、早期胚胎发育等方面发挥重要作用。本文从作为感受微环境营养状态的O-Glc NAc修饰层面分别研究了O-Glc NAc修饰水平变化对牛卵泡颗粒细胞增殖和卵母细胞体外成熟的影响,并进一步探究了O-Glc NAc修饰在葡萄糖摄取关键因子txnip调控牛体外成熟卵母细胞葡萄糖代谢中的作用。研究结果如下:试验一:研究了O-Glc NAc修饰水平变化对牛卵泡颗粒细胞增殖的影响。结果显示,采用BADGP处理颗粒细胞后,O-Glc NAc修饰、OGT和OGA蛋白表达均降低,而PUGNAc处理的颗粒细胞O-Glc NAc修饰和OGA蛋白表达升高,OGT蛋白表达降低;O-Glc NAc修饰水平的改变降低了颗粒细胞的活力和增殖相关基因CDC42、PCNA m RNA的表达,发生凋亡的颗粒细胞数增多,促凋亡基因BAX和Caspase-3 m RNA表达以及BAX/BCL-2的比值显著上调;同时,O-Glc NAc修饰水平改变降低了己糖激酶和丙酮酸激酶的活性、丙酮酸和乳酸含量、线粒体膜电位以及ATP水平;进一步研究发现,PUGNAc处理组颗粒细胞txnip表达显著下调。结果表明,O-Glc NAc修饰循环改变减少了牛颗粒细胞的葡萄糖摄取,诱导颗粒细胞损伤。试验二:研究了O-Glc NAc修饰水平变化对牛卵母细胞体外成熟的影响。结果显示,OGT和O-Glc NAc蛋白共定位于牛体外成熟卵母细胞的细胞质和细胞核中,而OGA和O-Glc NAc蛋白共定位于卵母细胞的细胞质中,且相对集中在皮质区;与对照组相比,BADGP处理组和PUGNAc处理组卵母细胞第一极体排出率(52.8%&60.9%vs.70.8%)和体外受精囊胚发育率(9.6%&10.0%vs.23.5%)均显著降低;进一步研究发现,BADGP处理组卵母细胞O-Glc NAc修饰和OGT蛋白表达下调,GFAT m RNA的表达上调,而在PUGNAc处理组,卵母细胞的O-Glc NAc修饰水平升高,OGT和OGA蛋白以及GFAT m RNA的表达均降低;此外,O-Glc NAc修饰水平改变显著上调了卵母细胞txnip的表达。结果表明,O-Glc NAc修饰水平改变降低牛卵母细胞体外成熟及发育能力,影响了OGT、OGA、GFPT以及txnip的表达。试验三:研究了O-Glc NAc修饰对txnip调控牛卵母细胞体外成熟的影响。结果显示,txnip抑制剂Aza处理组卵母细胞第一极体排出率和葡萄糖摄取能力升高,糖酵解和磷酸戊糖代谢活性增强,表现为胞内谷胱甘肽水平、磷酸果糖激酶和葡萄糖-6-磷酸脱氢酶活性升高,乳酸生成、ATP和NADPH水平增多,卵母细胞谷氨酰胺:6-磷酸果糖氨基转移酶活性减弱,O-Glc NAc修饰水平、OGT和txnip蛋白表达均下调;而糖基化底物Glc N抑制了Aza对牛卵母细胞体外成熟的促进作用以及对葡萄糖代谢的影响,包括减少卵母细胞的葡萄糖摄取、抑制磷酸果糖激酶和葡萄糖-6-磷酸脱氢酶活性、降低乳酸、谷胱甘肽及NADPH的生成等;此外,Glc N能够上调Aza诱导的卵母细胞O-Glc NAc修饰水平下降,并且这一过程依赖于OGT的作用。

关键词：牛颗粒细胞卵母细胞 O-GlcNAc修饰 txnip

重金属镉调控PERK诱导SH-SY5Y细胞焦亡的作用机制研究

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重金属镉调控PERK诱导SH-SY5Y细胞焦亡的作用机制研究

作者：李志辉武汉科技大学

学位级别：硕士

背景:镉(Cadmium,Cd)是人类和动物可能接触的毒性最大的重金属之一,是神经退行性疾病等神经系统疾病的重要风险因素。所以,研究Cd诱导神经细胞损伤的机制是预防和治疗神经系统疾病的重要策略。细胞焦亡是新发现的一种主要由炎症小体介... 详细信息

背景:镉(Cadmium,Cd)是人类和动物可能接触的毒性最大的重金属之一,是神经退行性疾病等神经系统疾病的重要风险因素。所以,研究Cd诱导神经细胞损伤的机制是预防和治疗神经系统疾病的重要策略。细胞焦亡是新发现的一种主要由炎症小体介导的程序性细胞死亡形式,它会诱导强烈的炎症反应和细胞死亡。NLRP3(NOD-like receptor protein3)炎症小体已被证明可以激活半胱天冬酶-1(Caspase-1)引起细胞焦亡。txnip可以与NLRP3炎症小体相互结合从而促进它的激活。Cd进入细胞之后,发挥毒性作用的主要靶细胞器之一就是内质网(Endoplasmic reticulum,ER)。PERK作为内质网上的跨膜蛋白,能感受内质网传递的应激相关信息,并且可以促进txnip的表达。所以,我们推测Cd可能通过内质网上的PERK蛋白调控txnip的表达,激活NLRP3炎症小体,进而诱导神经细胞的焦亡,造成细胞的毒性损伤。活性氧(ROS)的产生是镉毒性的重要机制,它也是Cd激活内质网应激的早期诱发因素。N-乙酰半胱氨酸(N-acetylcysteine,NAC)作为一种常见的活性氧清除剂,是否可以通过抑制ROS进而调节内质网应激并抑制SH-SY5Y细胞的焦亡,还未见相关报道。因此,深入研究Cd引起神经细胞焦亡的具体分子机制以及NAC对细胞焦亡的缓解作用对于Cd暴露引起的炎症相关的神经系统疾病的防治具有潜在的应用价值。目的:本研究旨在探究镉能否引起神经细胞焦亡以及内质网应激在此过程中的作用。并探讨NAC对Cd诱导的神经细胞焦亡的保护作用。方法:用可传代的神经母细胞瘤细胞SH-SY5Y细胞建立体外模型,首先,采用CCK-8,流式细胞术等实验方法检测细胞活力和细胞焦亡情况确定CdCl处理浓度。之后,将细胞分成对照组和CdCl处理组,运用细胞活性氧检测,蛋白免疫印迹、荧光定量PCR等实验技术检测细胞内ROS水平,以及PERK、txnip、NLRP3、Caspase-1、IL-1β和IL-18的变化情况。随后,将实验分为四组:对照组,CdCl组,GSK2606414组和GSK2606414+CdCl组,运用上述方法检测细胞活力,细胞焦亡和相关分子变化情况。最后,将实验分成四组:对照组,CdCl组,NAC组和NAC+CdCl组,检测细胞活力,细胞内ROS水平,细胞焦亡和相关分子的变化情况。结果:***处理SH-SY5Y细胞后,细胞明显受到损伤,表现为细胞活力下降,数目减少。流式细胞术结果表明Caspase-1和PI双阳的细胞比例随着CdCl处理浓度的增加而增加。CdCl处理导致细胞内ROS水平升高。蛋白免疫印迹和实时荧光定量分析发现CdCl处理导致PERK磷酸化增加,NLRP3表达升高,caspase-1,IL-1β,IL-18水平升高。2.使用PERK抑制剂GSK2606414预处理SH-SY5Y细胞后,与CdCl组相比,GSK2606414+CdCl组的细胞活力增加,Caspase-1和PI双阳的细胞比例降低,txnip表达水平下降,NLRP3活化减少,caspase-1,IL-1β,IL-18水平降低。3.与CdCl单独处理组相比,NAC+CdCl组细胞活力增加,ROS的产生减少,Caspase-1和PI双阳的细胞比例降低;细胞PERK磷酸化减少,txnip表达降低,NLRP3炎症小体活化减少,caspase-1,IL-1β,IL-18水平降低。结论:镉暴露可通过PERK/txnip/NLRP3途径诱导SH-SY5Y细胞发生焦亡。且使用NAC可以明显改善镉暴露诱导的细胞焦亡。

关键词：镉 PERK txnip NLRP3炎症小体细胞焦亡

姜黄素对纳米SiO2刺激A549细胞氧化损伤影响的研究

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姜黄素对纳米SiO2刺激A549细胞氧化损伤影响的研究

作者：孙明竞华北理工大学

学位级别：硕士

目的通过检测不同分组细胞内核因子E2相关因子2(Nuclear factor erythroid-2p45-related factor 2,Nrf2)、硫氧还蛋白(Thioredoxin 1,Trx1)、硫氧还蛋白相互作用蛋白(Thioredoxin interacting protein,txnip)基因及蛋白的表达,以及各组细胞内总超氧化物歧化酶(Total super oxide dismutase,T-SOD)、丙二醛(Malondialdehyde,MDA)、谷胱甘肽(Glutathione,GSH)含量的变化,探讨姜黄素对纳米SiO致A549细胞氧化损伤的影响及可能的作用机制。方法首先以不同浓度的纳米SiO刺激A549细胞12h,光学显微镜下观察各组细胞的形态变化,并采用CCK-8试剂盒检测各组细胞的存活率进而筛选出合适的纳米SiO刺激浓度用于后续实验;以上述实验筛选出的合适浓度的纳米SiO处理A549细胞12h构建细胞氧化应激模型。实验分为正常对照组、溶剂对照组、纳米SiO组及姜黄素低、中、高剂量组。除正常对照组不做处理外,其余各组均以含不同处理成分的培养基培养A549细胞12h;T-SOD、MDA、GSH试剂盒检测各组细胞内氧化应激水平及细胞氧化损伤的变化,推测姜黄素对纳米SiO致A549细胞氧化损伤的影响;实时荧光定量PCR和蛋白免疫印迹法(Western Blot)检测不同处理组细胞内Nrf2、Trx1、txnip的mRNA和蛋白表达,分析其基因和蛋白表达的变化情况,探讨姜黄素对纳米SiO致A549细胞氧化损伤可能的作用机制。结果1光学显微镜下可见正常细胞贴壁良好,呈梭形,随着纳米SiO刺激浓度的增加,培养基中悬浮细胞依次增多,细胞皱缩程度也依次加重;CCK-8检测结果示:A549细胞的活性随纳米SiO刺激浓度增加呈下降趋势;除了10μg/ml纳米SiO组细胞存活率无明显变化(P>0.05)外,其余各组存活率下降均具有统计学意义(Ptxnip蛋白的表达减少(Ptxnip蛋白的表达随姜黄素浓度的升高而减少(Ptxnip的mRNA表达明显下降,变化具有统计学意义(Ptxnip的mRNA表达表现为下降趋势,但在姜黄素中、高剂量组基因表达的变化才显著(P<0.05)。结论1纳米SiO具有细胞毒性,可使细胞产生氧化应激损伤,导致细胞凋亡,且细胞毒性呈浓度依赖性。2姜黄素可以上调Nrf2/ARE信号通路,增加或减少抗氧化应激相关基因及蛋白的表达,提高细胞氧化应激水平,减轻纳米SiO导致的A549细胞氧化损伤,发挥细胞保护作用。为临床防治职业或普通人群由纳米SiO导致的呼吸系统疾病提供参考。

关键词：姜黄素纳米二氧化硅 Nrf2/ARE信号通路 Trx1 txnip 氧化应激 A549细胞

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NK细胞抗肿瘤应答的调控机制研究

NK细胞抗肿瘤应答的调控机制研究

作者：吴海斯中国科学院大学(中国科学院深圳先进技术研究院)

学位级别：硕士

自然杀伤细胞(Natural Killer Cell,NK),因其杀伤肿瘤细胞或者病毒感染的细胞无需预先致敏而得名,是人体免疫监视的第一道防线。细胞氧化还原水平在人类疾病中起着关键作用,在不同程度上参与肿瘤的发生发展过程。目前尚不清楚肿瘤细胞... 详细信息

自然杀伤细胞(Natural Killer Cell,NK),因其杀伤肿瘤细胞或者病毒感染的细胞无需预先致敏而得名,是人体免疫监视的第一道防线。细胞氧化还原水平在人类疾病中起着关键作用,在不同程度上参与肿瘤的发生发展过程。目前尚不清楚肿瘤细胞的一些特征分子,尤其是氧化还原水平对NK细胞抗肿瘤免疫应答的影响。因此,本研究旨在揭示肿瘤细胞的氧化还原水平对NK细胞抗肿瘤应答的影响和机制。硫氧还蛋白互作用蛋白(Thioredoxin-Interacting Protein,txnip),是细胞内的一种重要的氧化还原调节分子,通过与硫氧还蛋白(Thioredoxin Protein,Trx)的结合而抑制Trx的抗氧化作用,使细胞处于氧化应激状态。txnip在多种癌症组织和细胞系存在不同程度上表达下降,在提高txnip的表达后,癌细胞的增殖会受到影响,甚至诱导癌细胞凋亡。因此,txnip被认为开发用于许多人类疾病药物的有吸引力的靶标。txnip在肿瘤细胞中与氧化还原失衡紧密相关,在NK细胞中与抗肿瘤活性下降相关,但是它介导肿瘤细胞高氧化水平对NK细胞抗肿瘤应答的影响研究甚少。因此,通过氧化还原调节分子txnip研究肿瘤细胞的氧化还原水平对NK细胞抗肿瘤的免疫应答的影响及其机制具有重要意义。鉴于txnip基因在正常组织表达,而在多种肿瘤组织低表达,以及小鼠T淋巴瘤细胞系RMAS是NK细胞敏感的靶细胞。因此,在本研究中我们选择在RMAS细胞过表达txnip基因,发现过表达txnip并不影响RMAS细胞增殖和凋亡,且提高了NK细胞对RMAS细胞的杀伤,表明肿瘤细胞过表达txnip提高了肿瘤细胞的NK细胞杀伤敏感性。txnip具有调节氧化还原功能,因此我们检测了过表达txnip的RMAS细胞内活性氧簇(Reactive oxygen species,ROS)水平,结果实验组的ROS水平比对照组显著高,表明升高肿瘤细胞的ROS可提高肿瘤细胞的NK细胞杀伤敏感性。细胞杀伤是NK细胞抗肿瘤主要途径。因此,在过表达txnip提高了肿瘤细胞的NK细胞敏感性的前提下,我们通过在免疫功能正常小鼠和NK细胞清除小鼠建立肿瘤模型,研究在生理条件下肿瘤细胞过表达txnip对NK细胞抗肿瘤功能影响。结果表明,在免疫功能正常小鼠模型中,实验组肿瘤生长速度比对照组慢;在NK细胞清除小鼠模型中,实验组和对照组肿瘤生长速度无差异。这些体内数据表明了在肿瘤细胞中过表达txnip,以依赖于NK细胞存在的方式抑制肿瘤生长。综上所述,提高肿瘤细胞txnip水平,提高了肿瘤细胞的NK细胞杀伤敏感性,并以依赖于NK细胞存在的方式抑制肿瘤发生发展。此研究提示我们,肿瘤细胞内的氧化还原调节分子---txnip,可能成为调控NK细胞抗肿瘤应答的一个潜在靶标。

关键词： NK细胞氧化还原 txnip 抗肿瘤

m6A去甲基化酶FTO在LPS诱导的急性肺损伤中的作用及机制研究

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m6A去甲基化酶FTO在LPS诱导的急性肺损伤中的作用及机制研究

作者：苏伟华中科技大学

学位级别：硕士

目的:急性肺损伤(Acute lung injury,ALI)是由多种致病因素引起的急性弥漫性炎症性肺损伤,可进一步发展形成急性呼吸窘迫综合征(Acute Respiratory Distress Syndrome,ARDS),ALI/ARDS已成为威胁全人类的重大公共卫生问题。N6-甲基腺嘌呤... 详细信息

目的:急性肺损伤(Acute lung injury,ALI)是由多种致病因素引起的急性弥漫性炎症性肺损伤,可进一步发展形成急性呼吸窘迫综合征(Acute Respiratory Distress Syndrome,ARDS),ALI/ARDS已成为威胁全人类的重大公共卫生问题。N6-甲基腺嘌呤(N6-methyladenosine,mA)修饰是真核生物中普遍存在的RNA表观遗传修饰。已有研究表明mA修饰与急性肺损伤的发生发展密切相关,但其作用及机制仍未明确。本研究旨在探讨mA去甲基化酶FTO在脂多糖(Lipopolysaccharide,LPS)诱导的急性肺损伤中的作用及机制。方法:经气管插管注射LPS建立ALI小鼠模型,使用LPS刺激A549细胞建立ALI体外模型。使用Dot Blot检测LPS诱导的急性肺损伤中mA水平变化。使用Western Blot、q RT-PCR和免疫组织化学染色检测调控mA水平的3种甲基转移酶及2种去甲基化酶的表达变化。构建肺上皮FTO敲除小鼠,评估FTO对ALI小鼠肺泡结构、组织水肿及肺部炎症的影响。构建FTO敲低/过表达的A549稳转细胞系,评估FTO对A549细胞损伤和死亡的影响。基于生物信息学寻找FTO调控ALI的潜在机制。通过细胞实验检测txnip抑制剂SRI-37330对细胞焦亡通路的影响。结果:LPS诱导的ALI中,去甲基化酶FTO表达下调诱导mA RNA修饰水平上调。肺上皮FTO敲除可显著减轻ALI模型小鼠肺泡结构损伤、组织水肿及炎性细胞浸润,从而降低肺部炎症水平,改善存活率。FTO敲低可减轻LPS诱导的A549细胞的损伤和死亡;FTO过表达可加重LPS诱导的A549细胞的损伤和死亡。FTO可影响txnip表达,从而调控细胞焦亡相关蛋白表达,且txnip抑制剂SRI-37330可逆转FTO过表达所诱导的A549细胞焦亡相关蛋白的表达上调。结论:mA去甲基化酶FTO通过txnip/NLRP3通路介导细胞焦亡,调控LPS诱导的急性肺损伤。

关键词：急性肺损伤急性呼吸窘迫综合征细胞焦亡 m6A修饰 FTO txnip