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西部医学 2022年第4期34卷 520-524页

作者：郭艳红吴琴宁邓权周强贵州省第二人民医院贵州贵阳550000

目的探究细胞骨架调控蛋白twinfilin-1过表达对镉诱导肾细胞重金属中毒及凋亡的影响。方法体外培养猪肾细胞LLC-PK1,随机分为对照组、模型组、模型+pc DNA空载体组、模型+twinfilin-1过表达组,以8μmol/L镉处理细胞24 h建立重金属中毒... 详细信息

目的探究细胞骨架调控蛋白twinfilin-1过表达对镉诱导肾细胞重金属中毒及凋亡的影响。方法体外培养猪肾细胞LLC-PK1,随机分为对照组、模型组、模型+pc DNA空载体组、模型+twinfilin-1过表达组,以8μmol/L镉处理细胞24 h建立重金属中毒模型。采用实时荧光PCR技术和蛋白印迹实验检测twinfilin-1的表达,CCK8实验检测细胞增殖,流式细胞术检测细胞凋亡和线粒体膜电位的变化,蛋白印迹检测凋亡相关蛋白[B淋巴细胞瘤-2(Bcl-2)、Bcl-2相关X蛋白(Bax)、半胱氨酸天冬氨酸特异性蛋白酶(Caspase3、9)]水平。结果与对照组比较,模型组twinfilin-1 mRNA及蛋白水平、细胞增殖能力、线粒体膜电位降低,细胞凋亡率、Bax/Bcl-2、cleaved cas9/cas9及cleaved cas3/cas3水平增加(Ptwinfilin-1过表达组twinfilin-1 mRNA及蛋白水平、细胞增殖能力、线粒体膜电位增加,细胞凋亡率、Bax/Bcl-2、cleaved cas9/cas9及cleaved cas3/cas3水平降低(P0.05)。结论twinfilin-1过表达可能通过下调凋亡关键因子Bax/Bcl-2水平,抑制Caspase3、9的活化,减少细胞凋亡,维持正常线粒体膜电位,从而保护镉诱导肾细胞重金属中毒。

关键词： twinfilin-1 镉肾细胞重金属中毒凋亡线粒体损伤

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肌动蛋白结合蛋白twinfilin-1在血管平滑肌细胞迁移中的作用及软脉灵对twinfilin-1的影响

肌动蛋白结合蛋白Twinfilin-1在血管平滑肌细胞迁移中的作用及软...

引用

作者：高若男福建医科大学

学位级别：硕士

目的1、观察磷脂酰肌醇3-激酶(PI3Ks)对表皮生长因子(EGF)诱导的血管平滑肌细胞(VSMCs)迁移的影响,同时观察PI3Ks对肌动蛋白结合蛋白twinfilin-1的影响及twinfilin-1对细胞骨架重塑的调节。2、观察软脉灵药物血清对血小板源性生长因子(P... 详细信息

目的1、观察磷脂酰肌醇3-激酶(PI3Ks)对表皮生长因子(EGF)诱导的血管平滑肌细胞(VSMCs)迁移的影响,同时观察PI3Ks对肌动蛋白结合蛋白twinfilin-1的影响及twinfilin-1对细胞骨架重塑的调节。2、观察软脉灵药物血清对血小板源性生长因子(PDGF)诱导的VSMCs内twinfilin-1和细胞骨架的的影响。方法第一部分组织块贴壁法培养大鼠胸主动脉平滑肌细胞,第3-5代细胞用于实验,细胞做如下方法处理:空白对照(Control组)、25ng/ml EGF(EGF组)及5μmol/L、25μmol/L、50μmol/L PI3Ks阻滞剂LY294002(LY294002低、中、高浓度组),后三组在实验时先以相应浓度LY294002预处理细胞1h,再加入同浓度EGF干预。用划痕损伤法观察细胞迁移情况,记录下EGF诱导后第0,6,12h VSMCs细胞间“裸露”区域面积,转化成相对值(%)。EGF诱导6h后,以Western blot法检测细胞内twinfilin-1的表达水平,用激光共聚焦显微镜观察细胞内twinfilin-1分布及细胞骨架微丝排列变化。第二部分灌胃法制备大鼠软脉灵药物及非药物血清,组织块贴壁法培养大鼠胸主动脉平滑肌细胞,第3-5代细胞用于实验,实验分为空白对照(Control)、PDGF(10ng/ml)、10%软脉灵药物血清+PDGF、10%非药物血清+PDGF及LY294002(50μmol/L)+PDGF五组,后三组在实验时先以相应药物预处理细胞1h,再加入同浓度PDGF干预。在干预第6h时以激光共聚焦显微镜观察细胞内twinfilin-1表达和分布情况及微丝排列变化。结果第一部分划痕后6h、12h,与Control相比,25ng/ml EGF明显促进细胞迁移(细胞间“裸露”区域的面积相对值/%,6h:EGF 73.33±2.83 vs Control 92.14±4.34;12h:EGF 44.77±4.23 vs Control 82.96±2.67,均P1)。LY294002呈浓度依赖性抑制EGF诱导的VSMCs迁移(5μmol/L、25μmol/L、50μmol/L预处理后细胞“裸露”区域面积相对值/%依次为:6h:78.93±2.52,85.86±3.16,90.27±2.78;12h:54.63±3.30,70.59±2.91,81.13±3.03;均P1vs EGF)。与Control相比,EGF诱导VSMCs内twinfilin-1表达增多,LY294002呈浓度依赖性抑制twinfilin-1表达。激光共聚焦观察到在静息状态下细胞内twinfilin-1表达较少,可见核周聚集的现象,余胞质内均匀弥散分布,细胞内肌动蛋白纤维丝少,丝状伪足不明显。EGF诱导细胞后twinfilin-1表达增多并重新分布,表现为核周聚集现象减弱,均匀弥散到整个细胞质中特别在细胞伪足伸出处定位;同时细胞内应力纤维明显增多,排列整齐有序,细胞伸出小伪足。LY294002呈浓度依赖性抑制twinfilin-1表达与重定位,核周聚集现象虽不如Control组明显但开始出现了核周聚集的趋势;同时细胞内应力纤维减少,肌动蛋白纤维丝排列杂乱无序,丝状伪足不明显。LY294002浓度越大,肌动蛋白纤维丝排列越松散无序。第二部分Control组内twinfilin-1主要聚集在核周,余胞质内少量均匀分布,细胞骨架重塑情况不明显,未见到明显的应力纤维。PDGF诱导细胞后twinfilin-1表达增多,在细胞突起和细胞伪足处可见到twinfilin-1分布;同时细胞骨架重组,胞内应力纤维明显增多,排列整齐有序,延伸至细胞伪足处。软脉灵药物血清干预细胞后,twinfilin-1表达较非药物血清组减弱,并且重定位现象受抑制,twinfilin-1未定位到细胞突起及伪足处;同时细胞骨架微丝减少,排列松散,伪足处应力纤维减少,与LY294002干预情况相似。结论1、EGF通过PI3Ks通路促进血管平滑肌细胞迁移,诱导细胞内twinfilin-1表达和重分布。2、twinfilin-1表达与重分布伴随细胞骨架肌动蛋白纤维丝结构的重塑。3、软脉灵药物血清可抑制PDGF诱导的twinfilin-1表达及重分布,抑制细胞骨架的重塑。

关键词： PI3Ks通路 twinfilin-1 细胞骨架细胞迁移软脉灵

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