检索结果-南通市图书馆

医学研究生学报 2022年第7期35卷 687-693页

作者：刘明霞马锦征苏超杨洁魏民新天津医科大学基础医学院生物化学与分子生物学系天津300070 香港大学深圳医院心血管外科/心血管医学中心深圳518053

目的经皮冠状动脉介入治疗冠心病有较好的近期疗效,但患者长期预后却受血管再狭窄的制约,血管平滑肌细胞(VSMC)的表型转化是导致血管狭窄的主要原因。文章通过构建敲低tudor-sn稳定株,检测tudor-sn基因对大鼠血管平滑肌细胞A7R5增殖、... 详细信息

目的经皮冠状动脉介入治疗冠心病有较好的近期疗效,但患者长期预后却受血管再狭窄的制约,血管平滑肌细胞(VSMC)的表型转化是导致血管狭窄的主要原因。文章通过构建敲低tudor-sn稳定株,检测tudor-sn基因对大鼠血管平滑肌细胞A7R5增殖、迁移、凋亡的影响,为研究血管平滑肌细胞表型转化和血管再狭窄发病机制提供细胞模型。方法通过制备敲低tudor-sn基因的重组慢病毒,感染A7R5细胞,加入嘌呤霉素药物筛选出低表达tudor-sn基因的稳定株;使用Western blot检测tudor-sn敲低效果;在表型实验中,将A7R5细胞分为pLKO-Vector对照组和sh-tudor-sn实验组,利用CCK-8实验、免疫荧光实验、细胞划痕实验和流式细胞术分别检测对照组和实验组A7R5细胞的增殖、迁移和凋亡的变化;使用PDGF诱导pLKO-Vector对照组和sh-tudor-sn实验组细胞表型转化,检测tudor-sn蛋白表达。结果成功构建了敲低tudor-sn的shRNAs的重组慢病毒稳定株;表型实验结果显示,敲低tudor-sn后,实验组从第3天起细胞增殖能力明显低于对照组,实验组迁移面积(1.6、1.7μm^(2))与对照组(2.7μm^(2))相比明显下降(Ptudor-sn蛋白表达增加(Ptudor-sn蛋白表达有所增加(Ptudor-sn血管平滑肌细胞增殖及迁移能力降低,凋亡水平增加,并且敲低tudor-sn降低了PDGF诱导的VSMC表型转化,表明tudor-sn蛋白参与并促进了VSMC表型转化。

关键词： tudor-sn 血管平滑肌细胞表型转化细胞增殖细胞迁移细胞凋亡

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针对人tudor-sn蛋白T103位点的应激磷酸化抗体制备及分析

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中国生物工程杂志 2014年第6期34卷 55-60页

作者：高星杰张毅苏超付雪史雪彬尹洁何津岩王鑫廷姚智杨洁天津医科大学基础医学研究中心天津300070 天津医科大学药学院天津300070 天津医科大学基础医学院天津300070

目的:针对人tudor-sn蛋白T103位点(103位苏氨酸,Thr103)制备兔源多克隆磷酸化抗体,并进行应激磷酸化的时相分析。方法:首先人工合成含磷酸化T103(pT103)位点的多肽,4次免疫新西兰大白兔后获取抗血清;然后以AKTA蛋白纯化系统进行纯化,并... 详细信息

目的:针对人tudor-sn蛋白T103位点(103位苏氨酸,Thr103)制备兔源多克隆磷酸化抗体,并进行应激磷酸化的时相分析。方法:首先人工合成含磷酸化T103(pT103)位点的多肽,4次免疫新西兰大白兔后获取抗血清;然后以AKTA蛋白纯化系统进行纯化,并利用Western blotting和细胞免疫荧光实验对纯化后的抗pT103抗体进行鉴定;最后以In-cell Western法进行tudor-sn蛋白的应激磷酸化/去磷酸化时相性分析。结果:(1)确定并合成磷酸化多肽"TIENKpTPQGRC",收集约75 ml兔源抗血清,纯化后获取2.08 mg/ml抗pT103抗体;(2)当HeLa细胞受到氧化应激时,以pT103抗体检测的磷酸化信号增强,可在胞浆中检测到颗粒状信号,与内源性tudor-sn应激颗粒存在共定位关系;(3)在氧化应激及应激去除后恢复过程中,T103位点的磷酸化水平呈现一定的波动性时相。结论:成功制备针对tudor-sn蛋白T103位点的兔源多克隆抗pT103抗体,有助于从磷酸化修饰角度进行tudor-sn在细胞应激方面的机制探讨。

关键词： tudor-sn 磷酸化抗体应激颗粒

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tudor-sn蛋白的表达调控及参与蛋白翻译调控的机制初探

Tudor-SN蛋白的表达调控及参与蛋白翻译调控的机制初探

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作者：赵亚丽天津医科大学

学位级别：硕士

目的:真核生物的基因表达调控普遍存在于自然界中,是非常复杂的过程,可以发生在DNA水平、转录水平、蛋白质翻译水平等多种不同层次,而基因在不同水平上的表达调控,可能对机体的生物学功能产生不同影响。本课题组前期研究发现成年小鼠的... 详细信息

目的:真核生物的基因表达调控普遍存在于自然界中,是非常复杂的过程,可以发生在DNA水平、转录水平、蛋白质翻译水平等多种不同层次,而基因在不同水平上的表达调控,可能对机体的生物学功能产生不同影响。本课题组前期研究发现成年小鼠的心肌组织中tudor-sn蛋白的表达水平远低于1天小鼠心肌组织中tudor-sn蛋白的表达水平,然而其mRNA的表达水平并没有明显的变化,即心肌成熟过程中tudor-sn蛋白的表达调控发生在转录后的翻译水平,但关于其具体调控机制还不清楚。本课题旨在探讨心肌细胞中tudor-sn蛋白的表达调控机制。此外,研究过程中,课题组发现tudor-sn的5’UTR区含有5’TOP序列,是一个新发现的TOP基因,有可能参与蛋白翻译调控,因此本课题接下来又对tudor-sn蛋白参与蛋白翻译调控的机制做初步探讨。希望通过本部分研究,明确心肌细胞中tudor-sn蛋白的表达调控机制,并为研究tudor-sn蛋白通过参与蛋白翻译调控进而影响心脏功能以及参与肿瘤的发生发展提供新的思路。方法:本课题主要分为三个部分:第一部分,利用基因重组技术构建tudor-sn UTR区域的荧光素酶质粒;利用脂质体转染、双荧光素酶等实验技术检测构建的tudor-sn UTR区域的荧光素酶重组质粒所表达的荧光素酶的活性。第二部分,利用DBTSS数据库分析tudor-sn的转录起始位点,并分析其5’UTR区域是否含有5’TOP序列;利用信号通路抑制剂、蛋白质免疫印迹、Real-Time PCR、密度梯度离心及多聚核糖体曲线分析等技术研究tudor-sn的表达调控机制。第三部分,分析实验室tudor-sn蛋白pull-down mRNA数据,并利用DBTSS数据库对tudor-sn蛋白结合的翻译相关mRNA的5’UTR序列进行分析;利用脂质体转染、蛋白质免疫印迹、Real-Time PCR等技术检测过表达tudor-sn后翻译相关蛋白的表达情况;利用质谱(MS)、蛋白质免疫共沉淀(Co IP)、GST融合蛋白钓取(GST pull-down)技术对可以与tudor-sn蛋白结合的翻译起始复合物相关蛋白进行检测和分析。结果:第一部分,(1)成功构建了tudor-sn UTR区域的荧光素酶表达质粒;(2)双荧光素酶实验显示pGL3-5’UTR重组质粒的荧光素酶活性最高,即tudor-sn的5’UTR区可更高效率地促进荧光素酶的表达。第二部分,(1)tudor-sn的5’UTR区含有5’TOP序列,并且其翻译水平的表达主要受PI3K/AKT/mTOR信号通路的调控,因此,tudor-sn是一个TOP基因;(2)当使用PI3K/AKT/mTOR信号通路的抑制剂后,与正常组相比,实验组的多聚核糖体曲线更趋于平缓即多聚核糖体发生解聚,这说明PI3K/AKT/mTOR信号通路被抑制时会降低tudor-sn的翻译效率。第三部分,(1)tudor-sn蛋白可与许多翻译相关蛋白的mRNA结合,并且这些翻译相关蛋白mRNA的5’UTR区均含有5’TOP序列;(2)过表达tudor-sn后,会促进与tudor-sn蛋白结合的一些翻译相关基因的蛋白表达。(3)质谱结果分析及蛋白质免疫共沉淀(Co IP)实验证明了tudor-sn蛋白可以与翻译相关蛋白结合,另外GST融合蛋白钓取(GST pull-down)实验也说明了tudor-sn蛋白是通过其sn片段与eIF4F复合体中的蛋白结合。结论:1)tudor-sn的5’UTR区含有5’TOP序列,可以增强基因的表达活性,且翻译水平的表达受PI3K/AKT/mTOR信号通路调控,因此,tudor-sn是一个TOP基因。2)tudor-sn蛋白与许多翻译相关基因的mRNA结合,并且参与这些翻译相关基因的蛋白表达调控。3)tudor-sn蛋白参与e IF4F翻译起始复合体的形成,其中sn结构域是介导其形成的主要功能片段。

关键词： tudor-sn 5’UTR PI3K/AKT/mTOR信号通路 TOP基因翻译蛋白

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