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人源TDRD蛋白tudor结构域识别不同甲基化修饰PIWI蛋白的特异性研究

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人源TDRD蛋白Tudor结构域识别不同甲基化修饰PIWI蛋白的特异性研究

作者：甘冰华中师范大学

学位级别：硕士

piRNA(PIWI-interacting RNA)是庞大的非编码RNA家族的成员之一,一般与 PIWI(P-element-induced wimpy testis)蛋白特异性结合形成 piRISC(piRNA-induced silencing complex)复合物进而参与正常配子发育和繁殖的转录调控。研究表明PIWI蛋白的N端多存在精氨酸甲基化修饰,此修饰为TDRDs(tudor domain containing proteins)提供了结合位点,而TDRDs-PIWI之间的相互作用是PIWI正常发挥其生物学功能的关键前提,因此研究两者之间的互作是非常有价值的。目前关于TDRDs与PIWI蛋白之间的相互作用的研究已经越来越深入,但是仍然存在许多空白亟待弥补。前期研究发现,TDRDs含有特异的tudor功能结构域,可以识别甲基化精氨酸修饰。目前,人源TDRDs蛋白家族已鉴定13个TDRD蛋白,其中,TDRD2、TDRD3、SND1(staphylococcal nuclease domain-containing 1)这三种蛋白tudor结构域识别PIWI蛋白的特异性及分子机理已经被阐述,而其他的TDRDs蛋白识别PIWI蛋白的特异性及结构基础却知之甚少,仅有研究证明它们可能与PIWI蛋白相互作用,但是作用位点和识别机理还需要进一步研究。基于SND1等tudor结构域蛋白的结构信息和PIWI蛋白结合机制,我们猜测其余未解析出蛋白结构的TDRD蛋白可能与SND1等蛋白具有相同的结合机制,即这些TDRD蛋白的某个或者某几个tudor结构域中含有一个由芳香族氨基酸构成的芳香槽,甲基化精氨酸修饰的PIWI蛋白可以通过甲基基团与芳香族氨基酸之间的相互作用插入芳香槽中以实现二者的结合。于是,本论文首先对人源TDRDs蛋白家族成员中所有的tudor结构域氨基酸序列进行多重序列比对,发现这些tudor结构域中或多或少都具有部分与SND1中形成芳香槽有关的保守氨基酸残基。因此,综合氨基酸序列比对的结果及前人的研究,本论文选取了有一定研究基础的TDRD1、TDRD2、TDRD4、TDRD7和TDRD9五种蛋白作为研究对象,这五种蛋白中包括了三种不同保守性的tudor结构域,具有一定代表意义。我们首先根据序列比对结果针对以上五种蛋白中的tudor结构域中的保守氨基酸残基设计突变体,并通过基因重组成功构建了 29种突变体的表达载体,经表达纯化后得到了突变体和野生型的可溶性蛋白总计30种。我们利用荧光偏振分析(Fluorescence Polarization Assay,FP)检测这些可溶性蛋白与不同甲基化精氨酸修饰的PIWIL1(PIWI-like protein 1)多肽的结合情况,基于FP的实验结果筛选部分蛋白进行蛋白结晶和同源建模,并结合三方面的结果来共同分析TDRD蛋白与不同甲基化精氨酸修饰的PIWIL1多肽的结合机制。结果表明,TDRD1、TDRD1和TDRD1都更倾向于结合对称双甲基化精氨酸(SDMA)修饰的PIWIL1多肽,且结合机制与SND1类似,但是TDRD1结合能力最弱,原因可能是因为TDRD1不具备完整的芳香槽;TDRD4中仅有TDRD4显示出了较强的结合甲基化精氨酸修饰PIWIL1多肽的能力,但是它更倾向于结合不对称双甲基化精氨酸(ADMA)修饰的PIWIL1多肽,同样,TDRD9也更偏好结合ADMA修饰的PIWIL1多肽,但是两者中TDRD4的结合能力相较而言更强,TDRD4可能通过芳香槽与甲基基团的相互作用来结合ADMA修饰的PIWIL1多肽,而TDRD9的结合机制则可能与TDRD4不同,可能存在某种特别的结合机制。同时,本论文还进行了 tudor结构域蛋白与PIWI蛋白的共结晶实验,但最终我们没有获得复合物晶体。在此实验基础下,我们利用合作者制备的TDRD2的Fab抗体与TDRD2的tudor结构域进行了共结晶实验,并成功的获得并解析了TDRD2-Fab的复合物结构。此方法为我们进一步研究tudor结构域及其他蛋白的结构奠定了基础。

关键词： PIWI蛋白 TDRD蛋白 tudor结构域荧光偏振分析结晶

靶向SETDB1-tudor结构域和KLHL12的小分子抑制剂的设计、合成与构效关系研究

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靶向SETDB1-Tudor结构域和KLHL12的小分子抑制剂的设计、合成与构...

作者：毛鑫四川大学

学位级别：硕士

本人在攻读硕士学位期间,主要开展了两个课题的研究,其一,针对SETDB1-tudor结构域的小分子抑制剂的设计、合成与构效关系研究;其二,针对KLHL12的小分子抑制剂的设计、合成与构效关系研究。具体分别介绍如下:第一部分针对SETDB1-tudor结... 详细信息

本人在攻读硕士学位期间,主要开展了两个课题的研究,其一,针对SETDB1-tudor结构域的小分子抑制剂的设计、合成与构效关系研究;其二,针对KLHL12的小分子抑制剂的设计、合成与构效关系研究。具体分别介绍如下:第一部分针对SETDB1-tudor结构域的小分子抑制剂的设计、合成与构效关系研究表观遗传是指基因的核苷酸序列不发生改变的情况下,基因表达发生可遗传的变化的一种现象。表观遗传受多种调控蛋白的调控,其调控异常与癌症、神经性疾病等多种重大疾病的发生发展相关,因此,表观遗传调控蛋白被认为是治疗相关疾病的潜在靶标。近年来,针对表观遗传调控蛋白的小分子抑制剂的研发已成为研究的热点,其中抑制剂研究得最多的是组蛋白去乙酰化酶(HDAC)、乙酰化识别蛋白溴结构域(BRDs)、组蛋白甲基转移酶(EZH2)等少数几种表观遗传调控靶蛋白,目前针对这些靶标已有多个上市药物或临床试验候选药物。但针对其它大多数表观遗传调控靶蛋白的小分子抑制剂的报道还非常少。本人在攻读硕士学位期间,针对一种目前尚无高活性抑制剂的表观遗传调控蛋白,即组蛋白甲基化识别蛋白SETDB1-tudor结构域,开展了小分子抑制剂的设计、合成与构效关系研究。SETDB1是一种组蛋白赖氨酸甲基转移酶,其调控异常与结直肠癌、非小细胞肺癌、前列腺癌等多种癌症的发生发展密切相关。人SETDB1蛋白主要包含SET域、MBD结构域以及串联的三个tudor结构域(TTD)。其中,TTD的主要功能是识别同时包含H3K9单甲基化和H3K14乙酰化(H3K9me/K14ac)的位点,但其具体的生物学功能和调控机制尚不清楚。研发特异性SETDB1-TTD小分子抑制剂不仅可为探索SETDB1及TTD的生物学功能提供化学探针,还可为相关疾病的治疗提供候选药物。但目前还没有高活性和选择性SETDB1-TTD小分子抑制剂的报道。在本研究中,我们首先通过筛选自有化合物库,获得了一个苗头化合物3,5-二甲基-2-{[(3R,5R)-1-甲基-5-苯基哌啶-3-基]氨基-3,5-二氢-4H-吡咯并[3,2-d]嘧啶-4-酮(Cpd1),利用差示扫描量热法(DSF)测得其ΔTm为1.58°C,等温量热滴定法(ITC)测得其K值为4.4μM。然后我们解析了Cpd1与SETDB1-TTD的共晶结构。基于此共晶结构,我们开展了结构优化研究。首先,从晶体结构可以看出,吡咯并[3,2-d]嘧啶-4-酮的5位甲基取代阻碍了吡咯环上的氮与E386形成氢键,于是我们去除了甲基取代得到化合物B1。B1活性有较大提升(K=1.6μM)。为验证此假设,我们解析了B1与TTD的晶体结构,结果发现,B1的吡咯环的氨基(-NH)与E386的确形成了氢键。进一步,从B1-TTD复合物晶体结构可以看出,B1的哌啶5位苯基外面还有一个较大的空疏水区,为此,我们设计并合成了包含不同取代的苯基的化合物共9个(B2-B10),活性测试发现多个化合物的活性得到了提升,其中B6(包含4-苄氧基苯基)的活性大幅提升(K=0.21μM),我们又解析了B6-TTD复合物晶体结构,结果发现4-苄氧基苯基的确占据了前述的空疏水区。B6-TTD复合物晶体结构显示,哌啶环1位的周围空间较小,只能容纳甲基,为此,我们试探合成了哌啶环1位为乙基(C1)以及异丙基(C2)取代的化合物,其活性均显著下降,与晶体结构分析结果一致。此外,我们还发现吡咯并[3,2-d]嘧啶-4-酮的3位周围还有一定的空间,为此,作为尝试,我们合成了7个吡咯并[3,2-d]嘧啶-4-酮的3位有更大取代基的新分子,活性测试表明,除化合物D4外(K=0.88μM),其它活性都没有提升,反而有所下降,表明吡咯并[3,2-d]嘧啶-4-酮的3位取代基增长增大都不利于活性,而化合物D4活性得以提升的主要原因是D4含有一个烯丙基,该烯丙基的双键可能与Y268的酚羟基形成了σ*-π相互作用。总之,通过以上结构优化,我们获得了一个活性最高的化合物D4,并进一步测试了D4对其它16个含有tudor结构域的蛋白和32种溴域蛋白的活性,结果表明针对这些靶标的大部分活性都较差或没有活性,说明D4具有很好的选择性。鉴于D4(又称(R,R)-D4)为手性分子,构型为(R,R),为此,我们合成了其对应异构体(S,S)-D4。针对化合物(R,R)-D4和(S,S)-D4,我们开展了进一步的竞争性ITC实验、均相时间分辨荧光实验(HTRF)、细胞热转移实验(CETSA)、荧光漂白恢复实验(FRAP)等。实验结果表明(R,R)-D4是一种内源性底物的竞争性抑制剂且能在细胞内稳定SETDB1-TTD蛋白,并在细胞内可阻断SETDB1-TTD与内源性底物的结合。而其对映异构体(S,S)-D4在以上所有实验中均未表现出活性。综上,本部分研究中

关键词：表观遗传 tudor结构域 SETDB1 E3泛素连接酶 KLHL12 小分子抑制剂

靶向SETDB1-TTD和SETD3的小分子抑制剂的发现和生物活性研究

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靶向SETDB1-TTD和SETD3的小分子抑制剂的发现和生物活性研究

作者：郭银萍四川大学

学位级别：硕士

本人在攻读硕士学位期间,主要开展了两个课题的研究,(1)SETDB1-TTD小分子抑制剂的发现、复合物晶体结构和生物活性研究,(2)SETD3小分子抑制剂的发现和复合物晶体结构研究。分别简述如下:第一部分SETDB1-TTD小分子抑制剂的发现、复合物... 详细信息

本人在攻读硕士学位期间,主要开展了两个课题的研究,(1)SETDB1-TTD小分子抑制剂的发现、复合物晶体结构和生物活性研究,(2)SETD3小分子抑制剂的发现和复合物晶体结构研究。分别简述如下:第一部分SETDB1-TTD小分子抑制剂的发现、复合物晶体结构和生物活性研究SETDB1是一种组蛋白赖氨酸甲基转移酶,可促进某些肿瘤抑制基因的沉默,并且在肺癌、黑色素瘤、前列腺癌等多种癌症中高表达。SETDB1是一个多结构域蛋白,包括SET域、串联tudor结构域(TTD)和MBD结构域。其中,TTD的主要作用是识别H3K9甲基化和H3K14乙酰化双修饰的组蛋白序列(H3K9me/K14ac)。但其具体的生物学功能和调控机制尚未阐明。而高活性和选择性的SETDB1-TTD抑制剂,不仅可作为药物先导化合物,也可作为工具分子用于探索SETDB1和TTD域的生物学功能和调控的分子机制。但目前尚无高活性和选择性的SETDB1-TTD抑制剂报道。在本研究中,我们首先利用原核系统表达并纯化了SETDB1-TTD蛋白,然后利用差示扫描量热法(DSF)筛选了课题组自有化合物库,发现了一个苗头化合物Cpd1,其热位移(?Tm)为1.58℃,然后我们利用等温量热滴定法(ITC)对化合物Cpd1的活性进行了验证,该化合物的K值为4.4μM。进一步,我们培养了化合物Cpd1与SETDB1-TTD的复合物单晶,并解析了其晶体结构。接下来,开展了基于晶体结构的苗头化合物优化,共设计合成了29个具有全新结构的化合物。构效关系研究表明,(R,R)-D4,3-烯丙基-2-{[(3R,5R)-5-(4-(苄氧基)苯基)-1-甲基哌啶-3-基]氨基}-3,5-二氢-4H-吡咯[3,2-d]嘧啶-4-酮是活性最好的化合物,K值(ITC)为0.088±0.045μM。我们又合成了化合物(R,R)-D4的对映异构体(S,S)-D4,该对映异构体在ITC和DSF测试中均无活性。接着,我们对(R,R)-D4做了进一步的选择性、生物活性和作用机制研究。为测试其选择性,我们表达纯化了16个含有tudor结构域的蛋白和32种溴域蛋白,活性测试表明,(R,R)-D4除对少数几个蛋白有微弱的活性外,其余蛋白都没有活性,说明(R,R)-D4具有良好的选择性。通过竞争性ITC实验和均相时间分辨荧光(HTRF)实验,发现化合物(R,R)-D4是底物的竞争性抑制剂,其竞争H3K9me2/K14ac和H3K9me3/K14ac的半数抑制浓度(IC)分别为0.93μM和0.75μM。细胞内热转移实验(CETSA)中,在45℃-53℃下,10μM的(R,R)-D4均可以稳定细胞内的SETDB1-TTD蛋白。荧光漂白恢复实验中,化合物(R,R)-D4处理组的光漂白恢复半衰期显著低于对映异构体(S,S)-D4和DMSO处理组,说明化合物(R,R)-D4在细胞内也可阻断SETDB1-TTD与内源性底物的结合。接下来,我们利用RNA-seq实验探索(R,R)-D4对基因组表达的影响,发现它显著降低了MYCL基因的表达,利用RT-q PCR验证,也可得到同样的结果。有趣的是,对映异构体(S,S)-D4在所有测定中均未显示活性。综上所述,我们发现了第一个高活性和选择性的SETDB1-TTD抑制剂(R,R)-D4,可作为探索SETDB1-TTD生物学功能的工具化合物。第二部分SETD3小分子抑制剂的发现和复合物晶体结构研究SETD3是一种组氨酸甲基转移酶,可以甲基化β-actin第73位组氨酸。SETD3在骨骼肌细胞分化、DNA损伤修复、肠病毒感染人体及作为转录调节因子调控VEGF中具有关键作用,并在横纹肌肉瘤、乳腺癌、早期卵巢癌、结肠癌等多种癌症中上调。SETD3被认为是这些肿瘤的潜在治疗靶标。目前尚无SETD3的特异性小分子抑制剂报道。在本研究中,我们使用原核表达系统表达并纯化了SETD3蛋白,建立了体外甲基转移酶筛选方法,并利用该方法筛选了课题组自有化合物和商业化合物库,得到了一个苗头化合物CD373,其IC为10.56μM。在DSF和SPR测试中,CD373的?Tm为1.92℃,K值为7.1μM。接着,我们测试了CD373在METTL3、PRDM9、SETDB1等9个表观遗传调控蛋白上的活性。结果显示,CD373在测试的蛋白上均没有活性,这说明CD373具有良好的选择性。为了得到CD373和SETD3的结合模式,我们尝试培养CD373、SETD3和底物多肽的复合物晶体,并解析了其晶体结构。但是,由于晶体结构的分辨率太低,无法确定小分子是否在晶体结构中(已经过多次优化,无法获得更高分辨率的晶体。此项工作还会继续)。接下来,我们通过分子对接模拟CD373与SETD3的相互作用模式。根据对接结果,合成了27个化合物并

关键词： SETDB1 tudor结构域 SETD3 小分子抑制剂晶体结构生物活性

运动神经元生存蛋白SMN与Sm蛋白的结合作用

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医学分子生物学杂志 2009年第1期6卷 49-55页

作者：高星杰(综述) 杨洁(审阅) 天津医科大学免疫学教研室天津市300070 天津市细胞与分子免疫学重点实验室天津市300070 教育部免疫微环境与疫病重点实验室天津市300070

脊髓性肌萎缩症（spinal muscular atrophy，SMA）是一类与运动神经元存活基因（survival of motor neurons gene，SMN gene）突变有关的神经系统变性疾病，而SMN基因的转录产物即为SMN蛋白（survival of motorneurons protein，SMN protein）。SMN蛋白与多种蛋白结合后发挥作用，如SMN-Sm蛋白的相互作用在富含尿嘧啶的小核核糖核蛋白体（uridine—richsmallribonucleo—proteins，UsnRNPs）转运装配中有重要意义。SMN蛋白是通过其tudor结构域与剪接体sm蛋白的二甲基化修饰的富含精氨酸一氨基乙酸域（ar—ginineandglycine—rich，RG）结合。

关键词： SMN蛋白 Sm蛋白 snRNP tudor结构域甲基化