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中国人兽共患病学报 2008年第2期24卷 120-124页

作者：王晓楠雷黎赵志荣朱绍春刘淼沈际佳安徽医科大学病原生物学教研室合肥230032

目的获得日本血吸虫tsunagi蛋白基因的cDNA序列,克隆、表达和纯化原核蛋白并初步鉴定。方法应用简并引物PCR和5’端、3’端锚定PCR,扩增得到日本血吸虫tsunagi基因的完整开放阅读框(Open reading frame,ORF)。将该基因亚克隆入原核表达... 详细信息

目的获得日本血吸虫tsunagi蛋白基因的cDNA序列,克隆、表达和纯化原核蛋白并初步鉴定。方法应用简并引物PCR和5’端、3’端锚定PCR,扩增得到日本血吸虫tsunagi基因的完整开放阅读框(Open reading frame,ORF)。将该基因亚克隆入原核表达载体pET28a(+),诱导表达并纯化融合蛋白。用纯化后的蛋白免疫小鼠,制备该蛋白的多克隆抗体,分别用ELISA和Western Blotting对表达蛋白进行初步鉴定。结果获得日本血吸虫tsunagi蛋白基因的完整ORF,序列全长为531bp,编码177个氨基酸。构建的重组质粒pET28a-Sjtsunagi在大肠杆菌中获得了可溶性表达;以重组蛋白免疫小鼠获得效价为1∶51 200的多克隆抗体,Western Blotting证实抗体可特异性识别目的蛋白。结论成功获得日本血吸虫Tsu-nagi蛋白编码基因的全长ORF,在大肠杆菌中克隆表达了tsunagi基因,并制备了特异性多克隆抗体,为进一步研究其在日本血吸虫生殖生物学中的功能奠定了基础。

关键词：日本血吸虫 tsunagi 克隆基因表达多克隆抗体

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日本血吸虫性相关tsunagi基因的克隆、表达及初步鉴定

日本血吸虫性相关Tsunagi基因的克隆、表达及初步鉴定

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作者：王晓楠安徽医科大学

学位级别：硕士

血吸虫病是一种分布广泛、危害严重的人兽共患寄生虫病。血吸虫致病主要是由于性成熟雌虫所产虫卵在人畜肝脏大量沉积形成的虫卵肉芽肿和纤维化,而沉积在肠壁的虫卵排出体外是该病流行传播的重要途径。另一方面,血吸虫雌雄合抱是雌虫生... 详细信息

血吸虫病是一种分布广泛、危害严重的人兽共患寄生虫病。血吸虫致病主要是由于性成熟雌虫所产虫卵在人畜肝脏大量沉积形成的虫卵肉芽肿和纤维化,而沉积在肠壁的虫卵排出体外是该病流行传播的重要途径。另一方面,血吸虫雌雄合抱是雌虫生殖系统正常发育和产卵的前提条件,雌虫的发育成熟又是雄虫依赖性的。因此,控制血吸虫性别分化、性成熟及雌虫产卵成为防治血吸虫病的重要策略。Mago nashi基因在模式生物如果蝇和秀丽隐杆线虫中是调节雌雄同体性别决定基因即决定生殖细胞雄性化作用的基因,该基因的蛋白产物与tsunagi(或Y14)蛋白结合成复合物共同行使功能。已有实验报道这两种蛋白在进化过程中均高度保守表达。本课题组在前期工作中已经用RNAi方法研究了日本血吸虫Mago nashi基因(登录号BM735619)干扰后血吸虫的表型变化,发现部分实验组雄虫睾丸小叶中的精母细胞表现出泛雄性化表型。但是日本血吸虫tsunagi基因至今未有报导,本文旨在获得日本血吸虫tsunagi基因序列并对该基因的功能进行初步鉴定。根据遗传密码的简并性,本文利用黑腹果蝇和秀丽隐杆线虫tsunagi蛋白高度保守的60个氨基酸序列,使用blastp,blockmarker,CodeHop等网络工具及数据库设计一对简并引物,从日本血吸虫成虫cDNA中扩增出了一段长180bp的PCR产物,测序后经blastx检索GenBank,发现这段基因的氨基酸序列与黑腹果蝇和秀丽隐杆线虫tsunagi蛋白的氨基酸序列高度同源。然后利用5’端和3’端锚定PCR方法分别从日本血吸虫童虫cDNA文库中扩增出日本血吸虫tsunagi蛋白基因上、下游的未知序列。再根据锚定PCR产物序列设计一对特异性引物,并在引物5’端分别引入BamⅠ和XhoⅠ酶切位点,从日本血吸虫童虫cDNA文库和日本血吸虫成虫cDNA中均扩增出了日本血吸虫tsunagi基因的开放阅读框(Open reading frame, ORF)。经基因测序分析后该cDNA长度为531bp,编码177个氨基酸,蛋白的理论分子量为20.078 KD,等电点为6.195。Sjtsunagi基因同源性比对后发现其编码的氨基酸序列与其它物种的tsunagi蛋白有很高的相似性:与黑腹果蝇tsunagi蛋白的氨基酸序列有55.9%的同源性和67.2%的相似性;与秀丽隐杆线虫tsunagi蛋白的氨基酸序列有40.6%的同源性和51.4%的相似性。蛋白功能分析预测该蛋白含有一个保守的RNA识别模序,理论上是RNA结合蛋白。将获得的日本血吸虫tsunagi基因的完整ORF亚克隆入原核表达载体pET28a(+)中,构建的重组质粒pET28a-Sjtsunagi在大肠杆菌中获得了可溶性表达。用纯化后的融合蛋白免疫小鼠,经ELISA鉴定获得的多克隆抗体效价为1: 51200,免疫印迹证实抗体可特异性识别目的蛋白。为了观察天然tsunagi蛋白在日本血吸虫体内的定位,我们首先制备了日本血吸虫成虫HE染色切片,掌握了日本血吸虫成虫在光学显微镜下的形态特点后,用间接免疫荧光法观察到日本血吸虫tsunagi蛋白仅在雌虫卵巢的卵母细胞内高表达。利用免疫印迹观察Sjtsunagi蛋白在虫卵、雌虫、雄虫和混合成虫等不同阶段的表达水平,结果发现该蛋白也仅在雌虫阶段表达,提示tsunagi蛋白可能是血吸虫的性别相关基因。利用Pull-down和免疫共沉淀实验,证实了日本血吸虫tsunagi和Mago nashi蛋白的相互作用关系。本论文率先开展了血吸虫tsunagi基因的研究,首次获得编码tsunagi蛋白的基因,成功将tsunagi基因在大肠杆菌中进行表达并获得了特异性的多克隆抗体;免疫荧光观察到天然tsunagi蛋白在雌虫的卵母细胞内高表达;免疫印迹发现该蛋白仅在雌虫阶段表达;Pull-down和免疫共沉淀实验证实tsunagi与Mago nashi蛋白的相互作用,提示这两种保守表达的蛋白在日本血吸虫中可能与模式生物一样也是性别发育相关基因。

关键词：日本血吸虫 tsunagi 克隆基因表达多克隆抗体

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日本血吸虫tsunagi样蛋白编码基因功能的鉴定

日本血吸虫Tsunagi样蛋白编码基因功能的鉴定

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作者：张鹏安徽医科大学

学位级别：硕士

血吸虫病是严重危害人民身体健康,阻碍社会经济发展的重大传染病。日本血吸虫致病主要是由于虫卵在肝脏大量沉积形成的虫卵肉芽肿及其纤维化。控制血吸虫性别分化、性成熟及雌虫产卵成为防治血吸虫病的重要策略之一。为了解日本血吸虫Ts... 详细信息

血吸虫病是严重危害人民身体健康,阻碍社会经济发展的重大传染病。日本血吸虫致病主要是由于虫卵在肝脏大量沉积形成的虫卵肉芽肿及其纤维化。控制血吸虫性别分化、性成熟及雌虫产卵成为防治血吸虫病的重要策略之一。为了解日本血吸虫tsunagi蛋白的功能,我们用RNAi技术下调tsunagi基因的转录水平,再观察干扰作用后虫体的发育(尤其是生殖系统发育)是否与正常虫体之间存在差异。按照双链RNA(dsRNA)体外合成试剂盒要求,我们从日本血吸虫童虫cDNA文库中扩增出tsunagi基因,将其片段正、反义链连接上T7启动子,然后把连接有T7启动子的目的基因的正、反义链进行PCR扩增。将PCR产物转录成单链RNA(ssRNA)并将其纯化,最后把一对ssRNA混合合成dsRNA。阴性对照组我们采用试剂盒中提供的基因。在BTX电穿孔仪上,设定参数为125V电压、20ms脉冲时值、1次脉冲次数,将dsRNA电穿孔转染入机械制备的日本血吸虫童虫体内,体外培养于电转后第1, 3, 5天收集童虫,按TRIzol方法同时提取童虫的总RNA及总蛋白。经实时荧光定量PCR及Western blotting分别检测tsunagi基因和蛋白表达水平变化。结果发现tsunagi基因的转录水平实验组分别于电穿孔后第1, 3, 5天较阴性对照组下降16%,57%,75%。该基因的蛋白水平在第1, 3, 5天较阴性对照组下降15%,38%,52%。实验结果证明dsRNA可以特异性的抑制日本血吸虫靶基因以及蛋白的表达且效果明显。经dsRNA电转的童虫注射入小鼠体内,6周后取出虫体通过一系列处理制成标本,在激光共聚焦显微镜下观察虫体内部各器官形态特征及测量虫体体长、体宽、睾丸长、睾丸宽、睾丸面积、卵巢长、卵巢宽、卵巢面积。结果发现Sjtsunagi dsRNA组中8条中3～4条雄虫睾丸内有大量精子出现,而雌虫中卵巢,卵黄腺中却没有明显特征变化;测得各项指标经SPSS 13.0统计软件分析阴性对照组与Sjtsunagi dsRNA组的体宽、睾丸长、睾丸宽、睾丸面积、卵巢长、卵巢宽、卵巢面积均有显著性差异。由此结果我们得出tsunagi基因在日本血吸虫中是生殖相关基因,在生殖系统器官的正常发育起一定作用。

关键词：日本血吸虫 dsRNA RNAi tsunagi

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