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Induction,selection and antibacterial activity of the antibacterial peptides from lepidopteran insect cultured cell lines

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生物学前沿:英文版 2008年第2期3卷 203-206页

作者： Rong PENG Zhong YANG Kaiyu LIU Hanchao YAO Hong YANG Yanfang CUI Huazhu HONG College of Life Science Central China Normal UniversityWuhan 430079China College of Bioengineering East China University of Science and TechnologyShanghai 200237China College of Chemistry Central China Normal UniversityWuhan 430079China

We induced 3 cell lines that were in vitro cultured from Lepidoptera with heat inactivated Escherichia coliDH_(5α) to stimulate the antibacterial peptide followed by antibacterial activity assay,induction dynamic research and tricine sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis(tricine sds-page)*** antibacterial activity of the induced BTI-Tn-5B1 cell line was the highest,and the antibacterial activity increased gradually to the highest level in 16 hours after stimulation.A new antibacterial peptide with a molecular weight of about 8000 Da was preferentially induced in Trichoplusia ni BTI-Tn-5B1 cells in 16 hours after *** activity assays indicated that it had inhibition against Staphylococcus aureus,Escherichia coli K_(12)D_(31) and Salmonella *** has especially strong inhibition against Gram-negative bacteria such as Escherichia coli K_(12)D_(31) and Salmonella derby.

关键词： antibacterial peptide BTI-Tn-5B1 cell line tricine sds-page antibacterial activity

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人Ⅲ型胶原蛋白肽在嗜热链球菌中的高效表达及发酵优化

人Ⅲ型胶原蛋白肽在嗜热链球菌中的高效表达及发酵优化

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作者：张波哈尔滨工业大学

学位级别：硕士

胶原蛋白(collagens)是一类细胞外基质蛋白,是结缔组织的主要蛋白成份,在维护各种组织的结构完整性方面,扮演着重要的角色。胶原蛋白富含多种氨基酸,具有多种独特的结构,有着特异的组织分布,与一些器官的功能有直接的关联,更关系到生物... 详细信息

胶原蛋白(collagens)是一类细胞外基质蛋白,是结缔组织的主要蛋白成份,在维护各种组织的结构完整性方面,扮演着重要的角色。胶原蛋白富含多种氨基酸,具有多种独特的结构,有着特异的组织分布,与一些器官的功能有直接的关联,更关系到生物体的衰老。由于人源胶原蛋白的生产与使用存在着伦理与道德的问题。所以本论文根据人III型胶原蛋白三肽功能区序列和合成生物学标准部件设计原则,通过基因工程的方法对嗜热链球菌进行改造,使其高产人III型胶原蛋白肽,从而避免了伦理与道德的问题。本论文通过密码子优化的方法人工设计、优化并合成了542bp的人III型胶原蛋白α1链基因序列(col III),包括了4个酶切位点、组氨酸标签及信号肽序列。将该基因片段连同nis I抗性片段插入线性载体p SB1C3中,构成连接质粒(p SB1C3-col III-nis I)。将连接质粒转入大肠杆菌进行扩增,提取质粒进行双酶切,得到目标片段。将目标片段插入载体p MG36e中,构成重组质粒(p MG36e-col III-nis I)。制备嗜热链球菌感受态,通过电击的方法将质粒转入嗜热链球菌感受态细胞,构建嗜热链球菌工程菌。提取工程菌质粒进行酶切鉴定、PCR产物测序与sds-page蛋白电泳鉴定。本论文培养工程菌进行tricine sds-page电泳检测分析,从中筛选出蛋白质表达量最高且重组质粒稳定性最好的菌株。筛选最优细胞破碎法对工程菌进行细胞破碎处理,将破碎后冷冻离心的胞外蛋白、胞内蛋白和包涵体蛋白进行tricine sds-page电泳检测、Western Blot检测,确认目标胶原蛋白肽表达于胞内与包涵体。大量表达目的胶原蛋白肽并过镍柱纯化,得到高纯度的目标胶原蛋白肽。本论文制备空菌与工程菌的生长曲线,确认工程菌的生长不因基因改造而发生变化。制备菌液OD600下的分光光度值与蛋白质浓度的关系曲线,发现其具有正相关性。根据经济原则与高效原则,优化培养基碳源与氮源、培养温度、红霉素浓度、温度、接菌量,分析得出最佳培养基配比与培养条件。培养基中的碳源和氮源的最佳比例为1%的葡萄糖,2%的蛋白胨和1%的酵母提取物。将菌液按0.4%的接菌量接种于含有2.5mg/m L的红霉素浓度的ELL培养基中,42℃培养,至OD600下的分光光度值为1.5左右,目标胶原肽的表达量最高,约占胞内总蛋白的21.97%。

关键词：胶原蛋白肽蛋白表达嗜热链球菌 tricine sds-page Western Blot

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以脂多糖诱导昆虫离体细胞产生抗菌肽及其抗菌活性的研究

以脂多糖诱导昆虫离体细胞产生抗菌肽及其抗菌活性的研究

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作者：叶雯华中师范大学

学位级别：硕士

抗菌肽是近年来发现的广泛存在于自然界的一类具有抗菌活性的分子,它们在宿主先天性免疫和适应性免疫中起着重要作用。多数抗菌肽具有分子小、带正电、两亲性、抗菌谱广等共同特点。在诱导和非诱导的情况下,昆虫能产生各种类型的抗菌肽... 详细信息

抗菌肽是近年来发现的广泛存在于自然界的一类具有抗菌活性的分子,它们在宿主先天性免疫和适应性免疫中起着重要作用。多数抗菌肽具有分子小、带正电、两亲性、抗菌谱广等共同特点。在诱导和非诱导的情况下,昆虫能产生各种类型的抗菌肽。抗菌肽的大量表达是昆虫受外物入侵或受伤后的特异性免疫反应,参与机体对入侵病原微生物的免疫应答反应,在昆虫的免疫防疫系统中占有重要的地位。抗菌肽对细菌、真菌、病毒和原虫都具有作用,甚至对癌细胞也具有杀伤作用。由于离体细胞在分子水平研究基因性质的优越性,越来越多的研究者尝试用离体培养的昆虫细胞来研究昆虫抗菌肽的诱导和表达。实验已证明用脂多糖、昆布多糖、鞭毛蛋白以及热灭活的大肠杆菌等物质诱导果蝇、棕尾别麻蝇、墨西哥棉铃象、白纹伊蚊、粉纹夜蛾等昆虫的细胞系表达了抗菌肽。本实验尝试用10mg/ml大肠杆菌细胞壁的脂多糖组分、色氨酸、热灭活的酵母菌和热灭活的小麦赤霉病菌等四种诱导源诱导粉纹夜蛾、白纹伊蚊、草地贪夜蛾、斜纹夜蛾、菜青虫、小菜蛾等六种离体培养的昆虫细胞,发现诱导后在细胞的上清中产生了抗菌活性物质。诱导细胞的上清液经三氯乙酸沉淀提取诱导蛋白,采用琼脂糖孔穴扩散法和比浊法测定了这些细胞的诱导上清对多种细菌和真菌的抗菌活性。比较了不同诱导时间和诱导浓度对产生抗菌活性物质的影响。结果如下: (1)实验证明,LPS是一种较为有效的诱导源,可诱导多种细胞产生抗菌活性物质。 (2)使用LPS诱导细胞,581、C7-10、SF-9、SL四种细胞经诱导后均能产生抗菌活性物质,Px和Pr-49两种细胞的诱导上清则未检测到抗菌活性。其中581细胞经诱导后产生的抗菌活性物质的活力最强。 (3)对581、C7-10、SF-9、SL细胞测定诱导物浓度与细胞上清液抗茵肽活力的关系,结果发现不同浓度的LPS诱导细胞产生的抗菌肽活性不同,不同细胞的最佳诱导浓度也不完全一致。其中581、SF-9、SL细胞的最佳诱导浓度是10mg/ml,C7-10细胞的最佳诱导浓度是10mg/ml;当诱导浓度达到1mg/ml时,细胞会出现破裂死亡。 (4)选取581、C7-10、SF-9三种细胞测定诱导时间与细胞产生的抗菌活性物质的活力关系,研究发现诱导时间不同,细胞上清液的抗菌活性不同。诱导4-8h后细胞上清液开始出现抑菌活性,随着时间延长,抗菌活力逐渐上升,581、SF-9

关键词：脂多糖真菌诱导昆虫离体细胞抗菌肽抗菌谱 tricine sds-page

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