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Efficient assembly of a large fragment of monkeypox virus genome as a qPCR template using dual-selection based transformation-associated recombination

引用

Virologica Sinica 2022年第3期37卷 341-347页

作者： Lei Yang Lingqian Tian Leshan Li Qiuhong Liu Xiang Guo Yuan Zhou Rongjuan Pei Xinwen Chen Yun Wang State Key Laboratory of Virology Wuhan Institute of VirologyCenter for Biosafety Mega-ScienceChinese Academy of SciencesWuhan430071China University of Chinese Academy of Sciences Beijing100049China

transformation-associated recombination(TAR)has been widely used to assemble large DNA *** of the significant obstacles hindering assembly efficiency is the presence of error-prone DNA repair pathways in yeast,which results in vector backbone recircularization or illegitimate recombination *** increase TAR assembly efficiency,we prepared a dual-selective TAR vector,pGFCS,by adding a PADH1-URA3 cassette to a previously described yeast-bacteria shuttle vector,p GF,harboring a PHIS3–HIS3 cassette as a positive selection *** new cassette works as a negative selection marker to ensure that yeast harboring a recircularized vector cannot propagate in the presence of 5-fluoroorotic *** prevent pGFCS bearing ura3 from recombining with endogenous ura3-52 in the yeast genome,a highly transformable Saccharomyces cerevisiae strain,VL6-48B,was prepared by chromosomal substitution of ura3-52 with a transgene conferring resistance to blasticidin.A55-kb genomic fragment of monkeypox virus encompassing primary detection targets for quantitative PCR was assembled by TAR using pGFCS in *** pGFCS-mediated TAR assembly showed a zero rate of vector recircularization and an average correct assembly yield of 79%indicating that the dual-selection strategy provides an efficient approach to optimizing TAR assembly.

关键词： Monkeypox virus transformation-associated recombination (TAR) TAR assembly

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