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中国生物化学与分子生物学会第十二届全国会员代表大会暨2018年全国学术会议

作者： Xiao Juanjuan Wang Fei Zhao Xia Duan Qiuhong Zhu Feng Department of Biochemistry and Molecular Biology School of Basic MedicineHuazhong University of Science and Technology Department of Pathology Tongji HospitalTongji Medical CollegeHuazhong University of Science and Technology

MET overactivation is one of crucial bypass resistance mechanism in EGFR-mutant NSCLC *** the regulation mechanisms of MET are not wholly clear,it is necessary to further explore more information and then overcome to EGFRTKI ***,we found that COX2 and topk were highly expressed in the MET amplification-induced gefitinib resistance HCC827 cells(HCC827 GR).The progression-free survival(PFS) of COX2,MET and topk positive patients was shorter than that of negative ***,COX2 could modulate MET transcription through AP-1 and TXA2 as a key mediator participated in *** expression of topk had positive correlation with that of MET in EGFR-mutated NSCLC *** phosphorylated topk at Tyr74 site in vitro and ex vivo,and with positive feedback topk could phosphorylate MET at three new sites: Ser990,Ser1152 and ***,overexpression of COX2 or topk in HCC827 cells promoted gefitinib resistance,and on the contrary gene silencing of COX2 or topk in HCC828 GR cells reversed resistance to *** last,combination of FDA-approved celecoxib(the COX2 inhibitor),pantoprazole(the topk inhibitor) and gefitinib could inhibit the anchorage-independent growth ability of HCC827 GR cells and induce cell ***,our work suggests that the COX2-MET-topk signaling axis promotes gefitinib resistance and combination of the FDA-approved drugs would provide a low-cost and practical strategy to overcome gefitinib resistance.

关键词： COX2 MET topk gefitinib resistance NSCLC

来源： cnki会议评论

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移动对象环境下的topk差值聚合查询策略

计算机研究与发展 2006年第Z3期43卷 102-107页

作者：关晶王斌李柰罗旭王国仁信俊昌东北大学信息科学与工程学院沈阳110004 东北大学信息科学与工程学院沈阳110004 东北大学信息科学与工程学院沈阳110004 沈阳师范大学计算机中心沈阳110004 东北大学信息科学与工程学院沈阳110004 东北大学信息科学与工程学院沈阳110004

聚合查询(GNN)在空间数据库以及网络环境中是一个相对比较新的操作.与传统的只有一个查询结点的kNN查询相比,GNN具有多个查询结点,由于查询点的数目以及它们在数据库空间中分布的任意性,使得GNN查询比只有一个查询点的kNN查询复杂得多.... 详细信息

聚合查询(GNN)在空间数据库以及网络环境中是一个相对比较新的操作.与传统的只有一个查询结点的kNN查询相比,GNN具有多个查询结点,由于查询点的数目以及它们在数据库空间中分布的任意性,使得GNN查询比只有一个查询点的kNN查询复杂得多.提出了一种基于2个查询点的差值聚合查询,在GNN查询方法中提出的将多个查询点分布于一个MBR的算法并不适用于此类差值查询.基于单查询点的YPK-CNN,利用双曲线性质把查询空间分成几大部分,在此基础上计算出双曲线的渐近线以简化删减条件,直接删减掉不符合条件的搜索空间.实验结果显示,针对这种特定的差值聚合查询,所提出的基于双曲线渐近线过滤策略的查询算法要比基本查询算法在查询响应时间和访问结点次数方面更高效.

关键词： topk 最近邻居查询聚合查询 GRID索引结构

topk磷酸化调控索拉非尼耐药性肾癌的血管生成

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TOPK磷酸化调控索拉非尼耐药性肾癌的血管生成

作者：唐文彬厦门大学

学位级别：硕士

目的:topk磷酸化对于索拉非尼耐药肾癌血管生成的调控及机制研究。方法:通过TCGA与GTEx数据库分析topk表达与肾细胞癌患者预后的关系;采用浓度递增法构建索拉非尼耐药肾细胞癌株786-O-SR,并通过MTT法和流式细胞术验证其耐药程度;人脐静... 详细信息

目的:topk磷酸化对于索拉非尼耐药肾癌血管生成的调控及机制研究。方法:通过TCGA与GTEx数据库分析topk表达与肾细胞癌患者预后的关系;采用浓度递增法构建索拉非尼耐药肾细胞癌株786-O-SR,并通过MTT法和流式细胞术验证其耐药程度;人脐静脉内皮细胞HUVEC经索拉非尼耐药株条件培养基的处理后,通过成管实验、细胞划痕实验和Transwell实验等验证索拉非尼耐药株786-O-SR对HUVEC细胞血管形成能力、迁移能力及血管通透性的影响;通过RT-qPCR与Western Blot检测索拉非尼耐药株786-O-SR中topk的表达水平及其磷酸化水平;通过Netphos 3.1数据库预测并分析索拉非尼耐药株786-O-SR中topk的磷酸化位点,通过免疫荧光、Co-IP、LC-MS/MS、体外激酶放射自显影、特异性磷酸化抗体检测等方法验证索拉非尼耐药株786-O-SR中topk的磷酸化位点;在索拉非尼耐药株786-O-SR中构建topk的敲低和过表达细胞系,分别使用相应的条件培养基处理人脐静脉内皮细胞HUVEC,通过成管实验、细胞划痕实验和Transwell实验等验证索拉非尼耐药株786-O-SR中topk的表达水平及其磷酸化位点对人脐静脉内皮细胞HUVEC血管形成能力、迁移能力及血管通透性的影响。结果:1、topk在肾细胞癌组织中的表达高于癌旁组织,且topk高表达的肾细胞癌患者预后较差。2、索拉非尼耐药肾癌细胞的条件培养基较敏感细胞提高了血管内皮细胞HUVEC的血管形成能力、迁移能力和血管通透性。3、索拉非尼耐药肾癌细胞中topk的mRNA和总蛋白水平未发生明显变化,但topk的Y74位点磷酸化水平显著升高。4、敲低内源topk的肾癌细胞过表达野生型topk(WT)后,其条件培养基较过表达突变型topk(Y74F)细胞的条件培养基提高了血管内皮细胞HUVEC的血管形成能力、迁移能力和血管通透性。结论:1、topk在肾细胞癌中起着促癌的作用。2、索拉非尼耐药肾癌可以促进肿瘤血管的生成。3、索拉非尼耐药肾癌中,VEGFR2在Y74位点磷酸化topk从而促进肿瘤血管生成,进而导致肿瘤进展。

关键词： topk 磷酸化索拉非尼耐药肾细胞癌血管生成

topk激酶促进RAS突变肺癌转移的机制研究

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TOPK激酶促进RAS突变肺癌转移的机制研究

作者：姚硕华中科技大学

学位级别：硕士

目的:肿瘤侵袭和转移是复杂的生物学过程,上皮间质转化(EMT)是参与调控的关键环节,与癌基因异常激活密切相关。RAS突变是人类肿瘤中最常见的癌基因。根据前期的研究和相关报道,我们发现在RAS突变的肺癌细胞中,RAS异常激活与EMT密切相关... 详细信息

目的:肿瘤侵袭和转移是复杂的生物学过程,上皮间质转化(EMT)是参与调控的关键环节,与癌基因异常激活密切相关。RAS突变是人类肿瘤中最常见的癌基因。根据前期的研究和相关报道,我们发现在RAS突变的肺癌细胞中,RAS异常激活与EMT密切相关,但具体机制不明。本课题对其分子机制进行进一步研究,意在发现RAS调控转移的分子机子,为RAS突变的肺癌提供新的治疗靶点。方法:(1)用4-OHT异常激活RAS突变转化细胞系MCF10AER:HRAS V12和HKe3ER:HRAS V12后用WB、Trans-well invasion实验、划痕实验检测细胞EMT表型的变化情况。(2)在K-RAS突变的非小细胞肺癌细胞株A549和H157细胞中敲除K-RAS,用WB、Trans-well、划痕实验检测其EMT的变化情况。(3)通过Protein Kinase Array分析,寻找RAS被异常激活之后,哪些激酶分子的活性发生变化,以寻找可能的下游分子。(4)通过不同的激酶抑制剂筛选RAS介导的EMT中发挥了关键作用的蛋白激酶。(5)通过数据库分析RAS下游激酶分子topk对于非小细胞肺癌患者的肿瘤分级、复发、预后均有影响,以及寻找topk作用的底物分子。(6)Pull-down实验和免疫共沉淀实验检测topk和自噬适配蛋白P62蛋白的相互作用。(7)原核表达、纯化P62蛋白,与活化的topk进行激酶实验,检测是否存在磷酸化的关系。(8)用Netphos2.0预测P62可能被磷酸化的位点,合成相应肽段,与活化的topk进行激酶实验,检测其具体的磷酸化位点。结果:(1)RAS异常激活可以促进细胞EMT的发生,在K-RAS突变的非小细胞肺癌细胞中敲低K-RAS可以逆转EMT。(2)RAS异常激活后除了常见的ERK、MEK、AKT,MAPK的活性变化明显外,topk蛋白的活性也明显增强。(3)topk的表达水平对于非小细胞肺癌患者的分级、复发及预后均有影响。(4)topk在肺腺癌患者的蛋白表达与自噬适配蛋白P62的蛋白表达呈正相关,RAS激活后topk和P62表达增高。(5)topk可以与P62相互结合并且在S24位点磷酸化P62。结论:在RAS异常激活的非小细胞肺癌中,topk的活性增高,抑制topk可以逆转肿瘤细胞的EMT,并且topk可以于S24位点磷酸化自噬相关分子P62。topk磷酸化P62有可能参与调控RAS介导的EMT。

关键词：非小细胞肺癌 RAS突变 EMT topk P62 磷酸化

topk和TLR2在恶性淋巴瘤组织中的表达及意义

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TOPK和TLR2在恶性淋巴瘤组织中的表达及意义

作者：谭美英南华大学

学位级别：硕士

目的：检测topk与TLR2蛋白在恶性淋巴瘤及淋巴结反应性增生临床标本中的表达，探讨topk和TLR2在EBV相关淋巴瘤发生中的意义。材料与方法：利用三种淋巴瘤组织芯片检测topk、TLR2蛋白的表达和EBV的感染，合计171例。收集淋巴瘤组织蜡块11... 详细信息

目的：检测topk与TLR2蛋白在恶性淋巴瘤及淋巴结反应性增生临床标本中的表达，探讨topk和TLR2在EBV相关淋巴瘤发生中的意义。材料与方法：利用三种淋巴瘤组织芯片检测topk、TLR2蛋白的表达和EBV的感染，合计171例。收集淋巴瘤组织蜡块113例和淋巴结反应性增生组织蜡块44例，采用免疫组织化学染色方法（SP法）检测topk和TLR2蛋白在淋巴瘤及淋巴结反应性增生组织中的表达;采用原位分子杂交检测淋巴瘤组织中EBER的表达。分析topk和TLR2的表达与EBV感染及淋巴瘤临床病理参数的关系。结果：***蛋白在淋巴瘤及淋巴结反应性增生组织中的表达1.1淋巴瘤组织芯片中topk的表达及与临床病理特征的关系topk蛋白阳性着色定位于细胞质或/和细胞核中。在90例淋巴瘤组织芯片中topk蛋白的阳性表达率为64.4%（58/90），其中霍奇金、非霍奇金、B细胞、T细胞性淋巴瘤的阳性表达率分别为50.0%（5/10）、66.3%（53/80）、69.4%（50/72）和37.5%（3/8）;霍奇金与非霍奇金淋巴瘤、 B细胞与T细胞性淋巴瘤相比，差异均无显著性意义（p＞0.05）。topk蛋白阳性表达与患者性别、年龄、部位无相关性(p＞0.05)。1.2淋巴瘤及淋巴结反应性增生组织石蜡标本中topk的表达及与临床病理特征的关系在113例淋巴瘤组织石蜡标本中topk蛋白的阳性表达率为38.1%（43/113），其中B细胞、T细胞和霍奇金淋巴瘤中topk蛋白的阳性表达率分别为40.0%（24/60）、42.2%（19/45）、0%（0/8），topk蛋白在反应性增生淋巴结组织石蜡标本中的阳性表达率为18.2%（8/44）。topk蛋白在淋巴瘤和反应性增生淋巴结组织中的表达，差异有显著性意义(p＜0.05)。B细胞与T细胞性淋巴瘤比较，topk蛋白表达的差异无显著性意义(p＞0.05)。topk蛋白阳性表达与患者性别、年龄、部位无相关性(p＞0.05)。***2蛋白在淋巴瘤及淋巴结反应性增生组织中的表达2.1淋巴瘤组织芯片中TLR2蛋白的表达TLR2蛋白在38例非霍奇金淋巴瘤组织芯片中的表达均呈阴性。2.2淋巴瘤及淋巴结反应性增生组织石蜡标本中TLR2蛋白的表达及与临床病理特征的关系TLR2阳性着色定位于细胞膜或/和细胞质。在111例淋巴瘤组织中TLR2蛋白的阳性表达率为12.6%(14/111)，其中B细胞、T细胞、霍奇金淋巴瘤中TLR2蛋白的阳性表达率分别为0%（0/60）、30.2%（13/43）和12.5%（1/8），TLR2蛋白在淋巴结反应性增生组织中的阳性表达率为27.5%（11/40）。TLR2蛋白在淋巴瘤和反应性增生淋巴结组织中的表达，差异有显著性意义(p＜0.05)。霍奇金与非霍奇金淋巴瘤比较，TLR2蛋白表达的差异无显著性意义(p＞0.05)。TLR2蛋白在60例B细胞性淋巴瘤中的表达均呈阴性。TLR2蛋白阳性表达与患者性别、年龄、部位无相关性(p＞0.05)。***在淋巴瘤组织中的表达3.1淋巴瘤组织芯片中EBER的表达及与临床病理特征的关系EBER阳性着色定位于细胞核。在43例非霍奇金淋巴瘤组织芯片中EBER阳性表达率为48.8%（21/43），其中B细胞和T细胞性淋巴瘤的阳性表达率分别为47.4%（18/38），60.0%（3/5）。B细胞与T细胞性淋巴瘤相比，差异无显著性意义（p＞0.05）。淋巴瘤组织芯片中的EBER阳性表达与患者性别、年龄、部位无相关性(p＞0.05)。3.2淋巴瘤石蜡组织标本中EBER的表达及与临床病理特征的关系在111例淋巴瘤石蜡标本中EBER的阳性表达率为33.3%（37/111），其中霍奇金、非霍奇金、T细胞与B细胞淋巴瘤组织中的EBER阳性表达率分别为50%（4/8）、32.0%（33/103）、55.8%（24/43）、15.0%（9/60）。霍奇金与非霍奇金淋巴瘤组织中的EBER阳性表达率的差异无显著性意义(p＞0.05)。EBER在T细胞与B细胞性淋巴瘤组织中的阳性表达率的差异有显著性意义(p＜0.01)。EBER阳性表达与患者性别、年龄、部位无相关性(p＞0.05)。结论：1、topk蛋白在淋巴瘤组织中表达上调。2、TLR2蛋白在淋巴瘤组织中表达下调。

关键词：淋巴瘤 topk TLR2 EBER

topk参与CXCL8诱导结直肠癌细胞抵抗失巢凋亡的分子机制及临床意义研究

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TOPK参与CXCL8诱导结直肠癌细胞抵抗失巢凋亡的分子机制及临床意...

作者：肖尤川昆明医科大学

学位级别：硕士

[研究背景和目的] 肿瘤细胞脱离原发灶或转移灶进入血液系统形成循环肿瘤细胞(circulating tumor cells, CTCs)。CTCs的发现迄今已有一百多年的历史,并且一直被看作是肿瘤复发和转移的根源。进入血液循环的大多数肿瘤细胞都发生了失巢凋... 详细信息

[研究背景和目的] 肿瘤细胞脱离原发灶或转移灶进入血液系统形成循环肿瘤细胞(circulating tumor cells, CTCs)。CTCs的发现迄今已有一百多年的历史,并且一直被看作是肿瘤复发和转移的根源。进入血液循环的大多数肿瘤细胞都发生了失巢凋亡,只有少部分得以存活下来。面对极其复杂的机体环境,CTCs是通过何种方式生存下来,又是何种原因促进其获得了凋亡抵抗能力尚不完全清楚。近年来研究显示,白介素-8(interleukin-8, IL-8),又称CXCL8,不仅能够促进肿瘤细胞增殖、侵袭、迁移及肿瘤血管生成,还能激活细胞内多条生存通路,抑制细胞内凋亡信号。本研究旨在探讨CXCL8与结直肠癌细胞失巢凋亡的关系,分析CXCL8促进结直肠癌细胞抵抗失巢凋亡的分子机制,寻找并试图阻断CXCL8介导的促细胞生存信号的关键靶点,同时检测结直肠癌组织中CXCL8及其下游靶蛋白的表达情况,评价其临床意义,为建立降低结直肠癌复发、转移的新策略提供新的思路。 [研究方法] ***8促进肠癌细胞抵抗失巢凋亡的体外研究 (1)失巢凋亡模型构建：应用聚羟乙基异丁烯酸(Poly-HEMA)包被培养板阻止细胞贴壁,将肠癌细胞悬浮培养,模拟肠癌细胞的失巢状态。 (2)CXCL8的表达与肠癌失巢凋亡敏感性的研究：应用免疫荧光技术、RT-PCR和Western blot检测多种肠癌细胞系内CXCL8的表达水平。应用FITC-AnnexinV/PI双染法分选凋亡细胞,流式细胞术检测不同时间点贴壁和失巢肠癌细胞的凋亡改变,分析CXCL8与肠癌细胞失巢凋亡敏感性的相关性。 (3)CXCL8对肠癌细胞失巢凋亡的影响：以不同浓度的CXCL8分别作用于肠癌细胞系SW480、Caco2,72h后应用AnnexinV-FITC染色试剂盒及流式细胞仪检测肠癌细胞凋亡率的变化,应用噻唑蓝(MTS)实验检测CXCL8作用后失巢和贴壁肠癌细胞的增殖率,应用Western blot检测细胞内凋亡相关蛋白caspase-3和Bc12的表达,初步探讨CXCL8诱导失巢凋亡的机制。再次应用最佳浓度的CXCL8作用于肠癌细胞Lovo、HT29和HCT116,于48h后再次检测细胞凋亡改变,确定CXCL8对肠癌细胞失巢凋亡抵抗的诱导效应。 ***8诱导肠癌细胞失巢凋亡抵抗分子机制的研究 (1)Western blot检测CXCL8作用组和空白组肠癌细胞SW480和Caco2内T-AKT、P-AKT、T-ERK、P-ERK、topk表达的改变。 (2)抑制试验：在加入CXCL8前预先用AKT抑制剂MK2206和ERK1/2抑制剂U0126处理肠癌细胞,应用流式细胞仪FITC-AnnexinV/PI双染法检测肠癌细胞凋亡率,应用Western blot检测细胞内T-AKT、P-AKT、T-ERK、P-ERK和topk表达的改变。 (3)干扰试验：在CXCL8作用前,分别应用AKT siRNA、topk siRNA、 ERK siRNA敲除细胞内AKT、topk和ERK基因,应用Western blot检测相关信号蛋白表达的改变,应用流式细胞仪FITC-AnnexinV/PI双染法检测肠癌细胞凋亡率。 ***8和topk在结直肠癌组织中表达的临床意义研究 (1)免疫组织化学检测肠癌组织及其配对的正常组织内的CXCL8和topk的表达。 (2)分析CXCL8与topk表达的相关性及二者表达与肠癌临床病理的相关性。 (3)CXCL8与topk表达和肠癌患者生存的相关性。 [研究结果] 1、CXCL8促进肠癌细胞抵抗失巢凋亡的体外实验 (1)在肠癌细胞系内源性CXCL8表达水平与其失巢凋亡敏感性呈负相关,与其贴壁细胞生长凋亡无关。 (2)外源性CXCL8能够促进肠癌细胞系抵抗失巢凋亡。 (3)CXCL8激活了细胞内PI3K/AKT和ERK1/2信号通路,上调了Bcl2的表达,促进肠癌细胞抵抗失巢凋亡。 (4)topk是PI3K/AKT与ERK之间的对话参与肠癌细胞的失巢凋亡抵抗。 2、肠癌组织表达CXCL8和topk的临床研究结果 (1)CXCL8和topk在肠癌组织中的表达明显高于癌旁正常组织(x2=53.281,P=0.000;x2=372.000,P=0.000)。 (2)在肠癌组织中,CXCL8和topk的表达呈正相关(r=0.254,P=0.000)。 (3)在肠癌组织中,CXCL8表达与肠癌的分化程度、浸润深度、淋巴结转移及肝转移相关(Ptopk表达与肠癌发生部位、分化程度、浸润深度、淋巴结转移及肝转移、血清CEA水平相关(Ptopk高表达的CRC患者无瘤生存期和总生存期都短于

关键词：结直肠癌细胞 CXCL8 失巢凋亡抵抗 PI3K/AKT ERK1/2 topk

topk在Apoptin诱导肿瘤凋亡效应中的作用研究

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TOPK在Apoptin诱导肿瘤凋亡效应中的作用研究

作者：刘妮妮华中科技大学

学位级别：硕士

目的:探讨肿瘤细胞中topk对Apoptin诱导肿瘤细胞凋亡效应的影响;明确topk对Apoptin的磷酸化作用,并初步判断其磷酸化位点。方法:1.采用质粒大提的方法,制备慢病毒包装所需质粒、pcDNA3.1、pcDNA3.1-HA-topk真核表达质粒;采用原核细胞诱... 详细信息

目的:探讨肿瘤细胞中topk对Apoptin诱导肿瘤细胞凋亡效应的影响;明确topk对Apoptin的磷酸化作用,并初步判断其磷酸化位点。方法:1.采用质粒大提的方法,制备慢病毒包装所需质粒、pcDNA3.1、pcDNA3.1-HA-topk真核表达质粒;采用原核细胞诱导表达的方法,制备纯化的PTD4-apoptin(简称P4A)蛋白。2.培养多种人肿瘤细胞,Western Blot检测topk表达水平,选择topk表达水平不同的HCT116、SGC7901和HepG2细胞进行后续实验。将P4A蛋白与上述细胞孵育,采用下列方法检测肿瘤细胞对P4A的敏感性:MTT检测P4A蛋白对细胞增殖活性的影响;Western Blot检测凋亡相关蛋白c-caspase3的表达。3.在topk高表达的HCT116、SGC7901细胞中,采用慢病毒介导的sh RNA沉默技术,建立topk沉默细胞系。Western Blot检测topk表达水平鉴定沉默效果。将P4A蛋白与上述细胞孵育,通过与sh Mock组对比,研究沉默topk表达对P4A蛋白诱导HCT116、SGC7901细胞凋亡的影响。4.在topk低表达的HepG2细胞,通过脂质体转染的方法实现topk过表达。Western Blot检测topk表达水平鉴定转染效果。将P4A蛋白与上述细胞孵育,检测过表达topk对P4A蛋白诱导HepG2细胞凋亡的影响。5.采用活化的topk为激酶、纯化的P4A蛋白为底物,开展体外激酶实验,研究topk对Apoptin蛋白的磷酸化作用。利用Net Phos2.0软件分析Apoptin序列中Ser、Thr位点,筛选出分值较高者的位点,合成肽段。采用活化的topk和肽段,开展体外激酶实验,研究topk对不同肽段的磷酸化作用,初步确定Apoptin序列上topk的磷酸化修饰位点。结果:1.将慢病毒包装所需质粒转染到293T细胞中,成功获得慢病毒。提取pcDNA3.1、pc NDA3.1-HA-topk真核表达质粒;采用原核细胞诱导表达的方法,制备纯化的PTD4-apoptin(简称P4A)蛋白。*** Blot检测,topk在HCT116、SGC7901细胞呈高表达;在Hela细胞中呈中等程度表达;在MKN45、HepG2细胞中呈低表达。孵育P4A蛋白后,HCT116、SGC7901、HepG2细胞的增殖活性较未处理组相比显著下降,凋亡相关蛋白c-caspase3的表达水平也显著升高。说明P4A蛋白诱导上述细胞发生凋亡。*** Blot结果表明,在结肠癌细胞HCT116以及胃癌细胞SGC7901中topk基因沉默细胞系建立成功。孵育P4A蛋白后,MTT结果显示sh topk组细胞增殖活性要明显高于sh Mock组;两种细胞的sh topk组的c-caspase3的表达水平较sh Mock组相比都有明显的降低。说明沉默topk的表达,P4A蛋白对SGC7901、HCT116细胞的凋亡诱导效应降低。4.在topk低表达的HepG2细胞中,转染pcDNA3.1-HA-topk质粒,topk的表达水平明显升高,表明转染成功。与未孵育P4A蛋白组相比,孵育P4A蛋白组细胞的增殖活性显著降低,而其c-caspase3的表达水平显著升高,说明P4A蛋白能够诱导HepG2细胞发生凋亡。但是转染topk表达组细胞在孵育P4A蛋白后,细胞增殖抑制率以及c-caspase3的表达水平要明显高于单独孵育P4A蛋白组。说明上调topk的表达,P4A蛋白对HepG2细胞的凋亡诱导效应升高。5.体外激酶实验证明topk可以直接磷酸化P4A蛋白,可能磷酸化的位点有Ser89、Ser93、Thr8、Thr20、Thr27、Thr56、Thr108、Thr114。结论:在topk高表达的HCT116、SGC7901细胞中,沉默topk的表达,P4A蛋白的凋亡诱导效应降低;在topk低表达的HepG2细胞中,上调topk的表达,P4A蛋白的凋亡诱导效应升高。体外激酶实验证明:活化的topk可以直接磷酸化P4A,可能磷酸化的位点有Ser89、Ser93、Thr8、Thr20、Thr27、Thr56、Thr108、Thr114。

关键词： topk Apoptin 肿瘤凋亡磷酸化

topk磷酸化c-Jun促进EGFR-TKIs耐药肺癌细胞生长的分子机制研究

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TOPK磷酸化c-Jun促进EGFR-TKIs耐药肺癌细胞生长的分子机制研究

作者：李惟捷第四军医大学

学位级别：硕士

肺癌是严重威胁人类生命健康的重大疾病,也是全球癌症相关性死亡的首要原因,其中NSCLC约占85%。当前,表皮生长因子受体-酪氨酸激酶抑制剂(EGFR-TKIs)在NSCLC治疗方面获得了巨大的成功,已发展成为肺癌治疗的一线药物。尽管如此,临床中大... 详细信息

肺癌是严重威胁人类生命健康的重大疾病,也是全球癌症相关性死亡的首要原因,其中NSCLC约占85%。当前,表皮生长因子受体-酪氨酸激酶抑制剂(EGFR-TKIs)在NSCLC治疗方面获得了巨大的成功,已发展成为肺癌治疗的一线药物。尽管如此,临床中大部分EGFR突变阳性患者经过一段时间的治疗后对EGFR-TKIs产生继发性耐药,因此对EGFR-TKIs获得性耐药机制及其临床应对策略的研究成为靶向治疗领域的又一研究热点。现有研究表明,非小细胞肺癌EGFR-TKIs获得性耐药机制主要表现为细胞绕过EGFR直接通过其下游分子来激活肺癌细胞生长的信号通路。因此,越来越多的研究者开始关注EGFR信号通路的下游分子以及与肺癌生长密切相关的一些蛋白激酶,以克服EGFR-TKIs的耐药问题。topk是一种由322个氨基酸构成的丝氨酸-苏氨酸蛋白激酶,首次发现于淋巴因子激活的杀伤性T细胞。以往研究表明,topk与有丝分裂期间纺锤体的功能密切相关,topk的敲除将导致细胞胞质分裂的推迟。近年来的研究发现,topk在多种肿瘤细胞中呈强表达,与肿瘤的发生发展密切相关。topk与细胞内多个凋亡相关蛋白的活化和表达有关,参与调控细胞的凋亡。已有研究发现,稳定干涉topk表达后,可以对细胞内的一些凋亡相关蛋白以及细胞周期蛋白的表达水平产生不同程度的影响,提示topk可能在癌症耐药过程中具有重要的作用。AP-1是一个二聚体的转录因子,包含可以与DNA结合的亮氨酸拉链结构域。Jun(c-Jun,Jun B和Jun D)和Fos(Fos,Fos B,Fra-1,Fra2)亚家族是主要的AP-1蛋白。现有证据表明,AP-1在肿瘤细胞的增殖、转化等方面发挥了重要作用。c-Jun是癌基因,c-Jun活化后可以调节靶基因转录,从而参与细胞的生长、分化和凋亡等多种生理过程。c-Jun的调节与AP-1的转录活性密切相关。但c-Jun已知最主要的调节蛋白是JNK(c-Jun amino-terminal kinase,c-Jun氨基末端激酶)。JNK是丝裂原激活的蛋白激酶超家族成员,JNK接受上游信号后被激活,从而与c-Jun结合并且磷酸化2个丝氨酸/苏氨酸丛,Ser63/73和Thr91/93,进而激活c-Jun增强其转录活性。c-Jun磷酸化后转录活性增强,蛋白的半衰期显著延长。但是JNK只在各种应激状态下被激活,其中最有效的方式是导致DNA损伤的UV刺激。然而在肿瘤正常生长状态下不存在UV刺激,JNK的活化水平较低,那么寻找肺癌细胞中新的能够活化c-Jun进而调节AP-1转录活性的蛋白激酶是肺癌研究的关键。众所周知,肺癌细胞能够大量自分泌EGF,促进肿瘤细胞的生长。肿瘤细胞在EGF刺激下不能活化JNK,但可以活化topk,并呈剂量依赖性,这就使得EGFR-TKIs耐药肺癌细胞通过topk-c-Jun-AP-1通路促进肿瘤细胞生长成为可能。【目的】①确立topk在EGFR-TKIs耐药肺癌细胞生长中的重要作用;②阐明topk通过磷酸化c-Jun进而促进AP-1转录活性的具体分子机制。【方法和结果】①首先采用组织芯片技术和western blot方法分别在肺癌患者组织和肺癌细胞系中检测了topk的表达情况。结果发现在EGFR-TKIs耐药的肺癌患者和肺癌细胞株中都存在topk高表达现象。接下来采用慢病毒干涉技术建立了A549 sh MOCK和A549 sh topk稳转细胞系,进一步利用CCK8技术和软琼脂克隆形成实验观察干涉topk表达对A549 sh MOCK和A549 sh topk细胞生长以及对吉非替尼敏感性的影响。结果发现在EGFR-TKIs耐药的A549细胞中下调topk的表达可以明显抑制它的增殖和克隆形成能力,并且显著提高它对于吉非替尼的敏感性。而在吉非替尼敏感的肺癌细胞株H358中提高topk的表达后,该细胞对吉非替尼的敏感性下降。②采用western blot方法检测了EGFR-TKIs耐药肺癌细胞A549和敏感肺癌细胞H358中topk及相关底物的蛋白表达水平,结果发现,topk活化水平与c-Jun磷酸化表达水平呈正相关。进一步采用同源建模预测发现topk可以和c-Jun相互结合。③通过哺乳动物双杂交系统证明了topk与c-Jun存在相互作用。采用免疫共沉淀方法分别在外源性表达topk和c-Jun的HEK293细胞和内源性表达的A549细胞中证实了topk与c-Jun存在相互作用。进一步利用体外激酶技术发现topk对c-Jun全长蛋白具有磷酸化作用。并且通过点突变分析证明topk磷酸化c-Jun的氨基酸位点为Ser63和Ser73。且利用一系列western blot实验证实了topk对c-Jun的磷酸化作用。④采用AP-1 luciferase报告质粒技术

关键词： topk 肺癌 EGFR-TKIs耐药 c-Jun AP-1

3-去氧苏木查尔酮通过topk抑制皮肤癌的机制研究

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3-去氧苏木查尔酮通过TOPK抑制皮肤癌的机制研究

作者：付晓荣郑州大学

学位级别：硕士

皮肤癌是全球常见癌症之一,美国2010年皮肤癌的确诊人数超过200万。皮肤癌在中国的发病率较低,但由于臭氧层的破坏等环境因素的影响,皮肤癌在我国的发病率逐年上升。目前我国公共卫生系统尚未建立有效预防皮肤癌的体系,中国未来将面临... 详细信息

皮肤癌是全球常见癌症之一,美国2010年皮肤癌的确诊人数超过200万。皮肤癌在中国的发病率较低,但由于臭氧层的破坏等环境因素的影响,皮肤癌在我国的发病率逐年上升。目前我国公共卫生系统尚未建立有效预防皮肤癌的体系,中国未来将面临巨大的健康挑战。治疗皮肤癌的方案有手术治疗、放疗、化疗及靶向药物等。靶向MAPK家族的BRAF和MEK抑制剂是晚期皮肤癌的重要靶向药物,但是由此而生的耐药问题使得开发新的靶点及靶向药物越发急切。topk为MAPKK家族的激酶,能够诱导皮肤癌的发生发展,为新兴的抗癌靶点。3-去氧苏木查尔酮（3-DSC）是中国药用植物苏木的提取物,我们的前期研究发现该化合物靶向topk抑制结肠癌的发生发展,但该化合物在皮肤癌中作用尚不明确。本文主要研究3-DSC预防紫外线造成的皮肤损伤及抑制皮肤癌的作用机制,为皮肤癌的靶向药物研发提供新的思路。给予3-DSC处理组和对照组SKH1无毛小鼠急性紫外线照射,小鼠背部局部皮肤经3-DSC处理后可预防紫外照射引起的皮肤增厚,降低p-topk及其相关信号通路蛋白的表达量。3-DSC 可以抑制皮肤癌细胞（SK-MEL-2、SK-MEL-28、A375 和 A431）的增殖,并通过调控细胞周期,诱导细胞周期阻滞在G2/M期。同时在蛋白印迹实验中G2/M期相关蛋白质cyclinB1的表达量下调,在蛋白水平印证了 G2/M期阻滞。3-DSC可以诱导皮肤癌细胞的凋亡并上调凋亡标志蛋白质cleaved caspase-3和cleaved caspase-7的表达量。3-DSC可通过下调topk信号转导通路蛋白质磷酸化水平进而抑制皮肤癌细胞生长增殖及SK-MEL-2细胞异种移植瘤（cell derived xenograft,CDX）的进展。因此,本文阐明了苏木提取物3-DSC可通过抑制topk激酶活性,进而在体内外水平抑制皮肤癌的发生发展。该研究将为3-DSC以及其他topk抑制剂在皮肤癌的临床预防及治疗提供理论依据。方法1.激酶实验:用MBP底物检测2.5、5、10、20μM梯度的3-DSC对topk激酶活性的影响及其降低激酶活性的浓度。2.蛋白下拉实验:根据计算机模拟结合实验预测的topk与3-DSC之间的结合位点,构建topk突变质粒,并在293T细胞中过表达,收集细胞裂解液,用细胞裂解液分别和亲和配体珠子及3-DSC-亲和配体珠子孵育并洗脱,利用其物理结构结合,验证3-DSC与topk的结合位点。3.蛋白印迹实验:检测皮肤及其癌细胞系的topk表达量4.细胞毒性和生长增殖实验:利用酶标仪结合噻唑蓝以及二甲基亚砜试剂检测不同浓度梯度3-DSC处理皮肤正常细胞或皮肤癌细胞后,570 nm的吸光度值,检测3-DSC对正常皮肤细胞的毒性以及对皮肤癌细胞的增殖抑制作用。5.软琼脂集落形成实验:检测3-DSC对皮肤癌细胞系克隆形成的抑制作用。6.细胞周期实验:利用碘化丙啶（PI）染料对细胞DNA的染色并使用流式细胞仪检测细胞在G1期（1N）、S期（1N-2N）、G2/M期（2N）的分布情况,从而探究3-DSC对皮肤癌细胞生长周期的调控作用。7.细胞凋亡实验:利用Annexin V与细胞膜内侧含负电磷脂的特异性结合符合早期凋亡特性,及PI染料对活细胞不透膜的特性,并利用细胞流式仪,检测3-DSC对皮肤癌细胞凋亡的影响及活细胞、早期凋亡、晚期凋亡和坏死细胞的比例。***敲低实验:用shRNA的方法转染质粒收集shtopk的病毒,并感染选定高表达皮肤癌细胞系,经嘌呤霉素筛选获得敲低topk的皮肤癌细胞,利用细胞增值实验及软琼脂集落形成实验检测topk敲低组细胞与对照组相比对3-DSC的敏感性差异。9.对细胞信号转导通路topk/ERK/RSK/c-Jun的检测:对皮肤癌细胞系（SK-MEL-2、SK-MEL-28、A375和A431）应用 3-DSC（0、5、10、20μM）后,用蛋白印迹实验探究不同浓度的3-DSC对topk磷酸化及其下游信号通路的影响10.急性紫外线照射实验:模拟太阳紫外线照射,检测3-DSC对紫外线处理后的小鼠皮肤厚度及topk信号转导通路蛋白表达水平的影响。11.小鼠体内细胞异种移植（CDX）模型实验:通过对构建的皮肤癌细胞系SK-MEL-2细胞异种移植小鼠模型腹腔注射3-DSC,检测其在小鼠体内对皮肤癌生长的抑制情况。结果1.激酶实验中3-DSC（2.5-20 μM）可以抑制topk激酶底物的磷酸化,表明3-DSC可抑制topk激酶的磷酸化。2.下拉实验中,3-DSC可以与未突变topk结合,表明3-DSC可以靶向topk。3-DSC与Thr42和Asn172位点突变topk几乎不结合,表明3-DSC与topk激酶的结合位点为Thr42和Asn172。3.蛋白印迹实验中,SK

关键词：皮肤癌 topk 3-DSC 靶向治疗