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途径工程及tn5转座子介导突变提高大肠杆菌丙酮酸生产

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生物工程学报 2017年第12期33卷 1913-1922页

作者：史晓荣刘俊彭彦峰李林王文科王钦宏山西师范大学生命科学学院山西临汾041004 中国科学院天津工业生物技术研究所中国科学院系统微生物工程重点实验室天津300308

为了开发丙酮酸高产菌株,以大肠杆菌MG1655为出发菌株,通过基因敲除阻断副产物途径构建了产丙酮酸大肠杆菌工程菌KLPP。进一步利用p UT Mini-tn5载体进行转座子随机突变,构建了含有7 197个单克隆的突变体文库。使用基于丙酮酸的二硝基... 详细信息

为了开发丙酮酸高产菌株,以大肠杆菌MG1655为出发菌株,通过基因敲除阻断副产物途径构建了产丙酮酸大肠杆菌工程菌KLPP。进一步利用p UT Mini-tn5载体进行转座子随机突变,构建了含有7 197个单克隆的突变体文库。使用基于丙酮酸的二硝基苯肼显色法,建立了96孔板-酶标仪快速筛选方法,经过两轮的筛选,成功筛选到了6个突变体菌株,比KLPP丙酮酸产量提高了38%、31%、19%、28%、44%和14%。利用全基因组重测序确定了其转座子插入的位置,进而确定了可能影响丙酮酸产量的基因位点,为后续菌株改造工作奠定了基础。

关键词：大肠杆菌丙酮酸 tn5转座子基因组途径工程高通量筛选

广藿香青枯病菌tn5转座子插入突变体的构建

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中国中药杂志 2019年第1期44卷 77-81页

作者：王亚琴张宇瑶贺红李颛邓志成金华黎广卫广州中医药大学中药学院广东广州510006

该研究以从感染了青枯病的广藿香植株中分离的青枯菌菌株PRS-84为供试菌株,利用电击转化法,对青枯菌进行tn5转座子插入突变,在含卡那霉素的培养基上筛选抗性克隆。对抗性克隆进行卡那霉素抗性基因的PCR鉴定,并利用反向PCR技术获得转化子... 详细信息

该研究以从感染了青枯病的广藿香植株中分离的青枯菌菌株PRS-84为供试菌株,利用电击转化法,对青枯菌进行tn5转座子插入突变,在含卡那霉素的培养基上筛选抗性克隆。对抗性克隆进行卡那霉素抗性基因的PCR鉴定,并利用反向PCR技术获得转化子tn5转座子插入位点的侧翼序列并进行序列测定与分析。结果表明,青枯菌感受态细胞经电击转化后,获得了抗性克隆。经PCR扩增,抗性克隆在预计的约700 bp处出现特异性条带。反向PCR扩增获得了转化子tn5转座子插入位点的侧翼序列,经序列测定及同源性分析,初步推测3个突变体的tn5转座子插入位点基因分别为typ A基因、rec O基因和gid A基因。该研究建立了广藿香青枯病菌tn5转座子插入突变体系,获得了青枯菌tn5转座子插入突变体,为构建广藿香青枯菌突变体库及发现青枯菌致病基因奠定了基础。

关键词：广藿香青枯菌 tn5转座子电击转化突变体

利用tn5转座子介导突变提高大肠杆菌丁醇生产水平

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生物工程学报 2015年第12期31卷 1711-1719页

作者：林兆董红军李寅中国科学院微生物研究所北京100101 中国科学院大学北京100049

目前,对于构建高产丁醇大肠杆菌工程菌株的工作,主要是对丁醇通路和相关途径的基因进行理性改造。为进一步提升菌株的丁醇生产能力,需要发掘基因组上可影响丁醇生产能力的基因,但这很难通过已有认识或计算机模型进行预测。本工作以一株... 详细信息

目前,对于构建高产丁醇大肠杆菌工程菌株的工作,主要是对丁醇通路和相关途径的基因进行理性改造。为进一步提升菌株的丁醇生产能力,需要发掘基因组上可影响丁醇生产能力的基因,但这很难通过已有认识或计算机模型进行预测。本工作以一株实验室前期构建的产丁醇大肠杆菌工程菌株为研究对象,利用tn5转座子构建了一个含有1 196个菌株的突变文库。丙酮酸是丁醇的前体,并且在发酵终产物中,副产物丙酮酸的含量与丁醇的含量呈反相关,因此,可以利用丙酮酸的含量来间接反映丁醇的含量,而丙酮酸可用二硝基苯肼显色法进行快速测定,基于此,建立了96孔板——酶标仪快速筛选方法。利用该方法成功筛选到了比对照菌株丁醇产量提高了29%、49%、56%的3个突变体菌株。利用反向PCR及测序的方法,确定了其转座子插入位置分别为:pyk A、tdk、cad C基因。这些基因可以作为进一步提高菌株丁醇产量的靶点,同时这种利用tn5转座子筛选基因靶标的策略也为构建其他微生物细胞工厂提供了新思路。

关键词：大肠杆菌丁醇 tn5转座子基因组

高效离子交换色谱法分析青枯雷尔氏菌tn5转座子突变菌株的异质性

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中国农业科学 2018年第2期51卷 268-278页

作者：郑雪芳刘波朱育菁陈德局陈小强福建省农业科学院农业生物资源研究所

【目的】研究青枯雷尔氏菌(Ralstonia solanacearum)tn5转座子突变菌株的异质性,筛选出无致病力高效生防菌株。【方法】利用已构建的青枯雷尔氏菌致病力参考指标"弱化指数(attenuation index,AI)"和接种番茄植株的生物测定法对60株供试... 详细信息

【目的】研究青枯雷尔氏菌(Ralstonia solanacearum)tn5转座子突变菌株的异质性,筛选出无致病力高效生防菌株。【方法】利用已构建的青枯雷尔氏菌致病力参考指标"弱化指数(attenuation index,AI)"和接种番茄植株的生物测定法对60株供试的青枯雷尔氏菌tn5转座子突变菌株进行致病力测定;利用高效离子交换色谱法研究不同致病力突变菌株的色谱行为异质性;构建色谱效价指数(chromatography titer index,CTIi),CTIi=Si/(S1+S2+S3)×100%(i=1、2或3;S1、S2和S3分别对应P1、P2和P3的峰面积),测定不同致病力青枯雷尔氏菌突变菌株的CTIi值,用皮尔逊相关系数(Pearson correlation coefficient,PCC)分析色谱效价指数与突变菌株的致病力和青枯病害防治效果的相互关系。【结果】基于AI值和生物测定结果,青枯雷尔氏菌tn5转座子突变菌株具有3种不同致病力类型:强致病力、无致病力和中间型。强致病力菌株共33株,其AI值介于0.49—0.63,接种番茄15 d,植株发病率为66.33%—100%;无致病力菌株共有20株,其AI值介于0.78—0.89,接种番茄15 d,植株发病率为0;中间型菌株共有7株,其AI值介于0.68—0.73,接种番茄15 d,植株发病率为24.17%—45.92%。20株无致病力突变菌株对番茄青枯病的防治效果测定结果显示,防治效果介于16.68%—92.45%,菌株T831防治效果最好,达91.74%,其次是菌株T780,防治效果为87.51%,菌株T497防治效果最差,为16.68%。不同致病力青枯雷尔氏菌的高效离子交换色谱分离结果显示,青枯雷尔氏菌经高效离子交换色谱可以分离出P1(出峰时间为0.6 min)、P2(出峰时间为4.4或4.5 min)和P3峰(出峰时间为5.9或6.0 min);强致病力菌株和无致病力菌株均具有3种不同峰类型:单峰、双峰和3个峰,强致病力菌株的主峰为P3峰,无致病力菌株的主峰为P1峰,中间型菌株有双峰和3个色谱峰两种类型;强致病力菌株中CTI3为100%的菌株,致病力最强,诱导番茄植株发病率均达85%以上,CTI3tn5转座子突变菌株具有3种致病力类型,不同致病力菌株的色谱行为不同。构建的色谱效价指数CTI1可用于快速筛选出无致病力高效生防菌株,CTI3可作为青枯雷尔氏菌致病力的参考指标。

关键词：高效离子交换色谱青枯雷尔氏菌青枯病 tn5转座子突变菌株

百脉根根瘤菌MAFF303099 tn5转座子插入突变体库的构建及筛选

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华中农业大学学报 2018年第2期37卷 16-22页

作者：周向珍朱辉华中农业大学生命科学技术学院/农业微生物学国家重点实验室武汉430070

以百脉根根瘤菌MAFF303099为材料,利用转座子tn5-sacB转座技术得到了约10 000个MAFF303099的转座接合子,构建随机插入突变体库进行保藏;同时建立了一套能从突变体库中快速筛选突变菌株的方法,且鉴定到共同结瘤基因nodB的突变体。结果表... 详细信息

以百脉根根瘤菌MAFF303099为材料,利用转座子tn5-sacB转座技术得到了约10 000个MAFF303099的转座接合子,构建随机插入突变体库进行保藏;同时建立了一套能从突变体库中快速筛选突变菌株的方法,且鉴定到共同结瘤基因nodB的突变体。结果表明:组成突变体库的接合子基因组中均有tn5-sacB插入,三亲本转化效率为3.75×10^(-5);与野生型相比,MAFF303099 nodB的突变体在表型上不能使其宿主百脉根形成根瘤。

关键词： Mesorhizobium loti MAFF303099 tn5转座子突变体 nodB

热不对称PCR(TAIL-PCR)和tn5转座子质粒拯救法快速分离水稻条斑病菌致病相关基因

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农业生物技术学报 2009年第6期17卷 1089-1095页

作者：袁亮李玉蓉张希福郭威车亦舟陈功友南京农业大学植物保护学院/农业部病虫监测与治理重点开放实验室上海交通大学农业与生物学院

构建植物病原菌突变体库是进行新基因发掘和功能基因组学研究的有效途径之一。为快速准确地鉴定tn5的插入位点和相应的功能基因,研究采用热不对称PCR(TAIL-PCR)和tn5转座子质粒拯救两种技术,鉴别了在筛选水稻条斑病菌(Xanthomonas oryza... 详细信息

构建植物病原菌突变体库是进行新基因发掘和功能基因组学研究的有效途径之一。为快速准确地鉴定tn5的插入位点和相应的功能基因,研究采用热不对称PCR(TAIL-PCR)和tn5转座子质粒拯救两种技术,鉴别了在筛选水稻条斑病菌(Xanthomonas oryzaepv.oryzicola)tn5插入突变体库过程中获得的8个在水稻(Oryza sativa)上毒性减弱的突变体。结果显示,TAIL-PCR和tn5质粒拯救结合使用,可有效地鉴别tn5的插入位点和相应的功能基因。TAIL-PCR鉴别的5株突变体是tn5分别插入在分泌系统结构蛋白F基因(gspF)、cAMP调控蛋白、膜镶嵌蛋白酶酶原、S-蛋硫氨酸脱羧酶亚基和gspJ基因上;tn5质粒拯救法鉴别的3株突变体是tn5分别插入在致病性蛋白、功能未知的保守蛋白和鞭毛特异性ATP合酶基因上。序列同源性分析发现,8株突变体tn5插入的基因与基因组测序的BLS256菌株中的对应基因同一性达100%。这表明,TAIL-PCR和tn5质粒拯救技术可有效地应用于植物病原菌tn5突变体库的鉴别和目标基因的分离。

关键词：水稻条斑病菌 tn5转座子热不对称PCR(TAIL-PCR) 质粒拯救致病性

利用tn5转座子构建杆状病毒AcMNPV随机突变体的初步研究

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复旦学报（自然科学版） 2005年第4期44卷 498-502页

作者：李惠赵明磊尹隽钟江复旦大学生命科学学院微生物学与微生物工程系上海200433

以杆状病毒模式种AcMNPV为研究对象,应用基于tn5转座子的随机转座的方法,构建杆状病毒突变体库.将果蝇hsp70启动子后接绿色荧光蛋白基因后插入tn5转座子,构建了可以在昆虫细胞中表达,易于跟踪的转座载体.利用体外转座系统将转座子随机插... 详细信息

以杆状病毒模式种AcMNPV为研究对象,应用基于tn5转座子的随机转座的方法,构建杆状病毒突变体库.将果蝇hsp70启动子后接绿色荧光蛋白基因后插入tn5转座子,构建了可以在昆虫细胞中表达,易于跟踪的转座载体.利用体外转座系统将转座子随机插入AcMNPV基因组,并用转座反应液转染Sf21细胞,得到了表达绿色荧光蛋白的病毒突变体库.进一步纯化了两株病毒B9F和Li6A,进行了转座子插入位点的分析,确定两株病毒中,转座子分别插入了94K基因和p10基因.该方法将为杆状病毒功能基因组研究提供重要的手段.

关键词： AcMNPV tn5转座子转座酶突变体

洋葱伯克霍尔德菌T1828和ZWL15-tn5转座子插入突变体库的构建及相关突变体的筛选初探

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中国农学通报 2014年第9期30卷 242-247页

作者：刘好桔钟义军饶志强葛岚吴晓玉江西农业大学生物科学与工程学院南昌330045 南昌市发酵应用技术重点实验室南昌330045 江西省红壤研究所南昌331717 国家红壤改良工程技术研究中心南昌331717

采用双亲结合法将含有tn5转座子的质粒pRLl063a导入洋葱伯克霍尔德菌T1828和ZWL15中,在含有卡那霉素和链霉素的抗性平板上筛选抗性接合子。通过随机插入诱变后,共获得300个突变株。PCR检测随机挑选的6株突变株,结果显示为阳性;且6株突... 详细信息

采用双亲结合法将含有tn5转座子的质粒pRLl063a导入洋葱伯克霍尔德菌T1828和ZWL15中,在含有卡那霉素和链霉素的抗性平板上筛选抗性接合子。通过随机插入诱变后,共获得300个突变株。PCR检测随机挑选的6株突变株,结果显示为阳性;且6株突变株发酵后高效液相色谱检测不能合成冠毒素。研究结果表明,6株突变株均已被tn5插入染色体基因组且丧失冠毒素合成的能力。本研究为今后转座子插入位点侧翼序列的克隆与测序,并进行功能回复试验提供了基础。

关键词：洋葱伯克霍尔德菌冠毒素 tn5转座子突变体库

水稻黄单胞杆菌（Xanthomonas oryzae pv.oryzae）tn5转座子插入突变体文库构建及噻枯唑药敏性突变体筛选

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水稻黄单胞杆菌（Xanthomonas oryzae pv.oryzae）Tn5转座子插入...

作者：梁淑平南京农业大学

学位级别：硕士

水稻黄单胞杆菌(Xanthomonas oryzae pv. oryzae Xoo)引起的水稻白叶枯病是水稻上重要的病害之一。噻枯唑[N,N-亚甲基-双(2-氨基-5-巯基-1,3,4-噻二唑]杀菌剂属于噻二唑类化合物,被广泛用于控制水稻白叶枯病等细菌病害。由于噻枯唑具有... 详细信息

水稻黄单胞杆菌(Xanthomonas oryzae pv. oryzae Xoo)引起的水稻白叶枯病是水稻上重要的病害之一。噻枯唑[N,N-亚甲基-双(2-氨基-5-巯基-1,3,4-噻二唑]杀菌剂属于噻二唑类化合物,被广泛用于控制水稻白叶枯病等细菌病害。由于噻枯唑具有广谱抗菌活性,毒性低,选择性强等优点而被长期单一使用。然而,近年噻枯唑在生产上也出现了相应的抗性问题,使细菌病害的化学防控面临了新的挑战。鉴于目前仍不了解噻枯唑的作用和抗性机理,本文通过构建tn5随机插入突变体文库,并以噻枯唑杀菌剂筛选药敏性变化的突变体,为研究噻枯唑作用机理和抗性机理提供了可靠的试验材料。该突变体文库包含16000个突变体。随机挑选2个突变体在活化25代之后,通过Southern blot杂交验证,未发现插入位点变化,突变体稳定性良好;随机挑选26个突变体,Southern blot杂交结果显示插入位点是随机的,有tn5的单次插入,也有双次插入;通过RATE-PCR获得43个突变体中tn5旁侧序列,作出tn5在水稻黄单胞杆菌全基因组上插入位置图谱,观察发现tn5转座子均匀分布于全基因组,该突变体文库具有良好的饱和度。经验证,该突变体文库随机性、稳定性、饱和度均良好,是一个质量很高的突变体文库。实验中测定了噻枯唑对野生型菌株ZJ173的最低抑制浓度MIC为70μg/ml,以此为参照,通过在NA平板中添加药剂,观察菌落的生长情况来筛选水稻黄单胞杆菌突变体文库。筛选获得对噻枯唑更加敏感的突变体7株,获得不同抗药性水平的噻枯唑抗性突变体8株。通过致病力和对噻枯唑药敏性等生物学表型测定,发现对噻枯唑敏感和抗性的15个突变体的致病力均有不同程度的下降;噻枯唑对野生型菌株ZJ173的有效中浓度EC50为12.5μg/ml,抗药性突变体中EC50最高为24.1μg/ml,敏感突变体中EC50最低为3.7μg/ml。通过RATE-PCR获得tn5旁侧序列,与全基因组序列对比,可知在8个抗药性突变体中,tn5插入了基因组的IS家族(Transposase andinactivated derivatives, IS30 family)-.色素C氧化酶亚基Ⅱ(cytochrome C oxidase subunit Ⅱ)、单链DNA特异性外切核酸酶(single-stranded-DNA-specific exonuclease)等基因中,在7个敏感突变体中,tn5插入了信号传导组氨酸激酶(Signal transduction histidine kinase)、Rhs家族蛋白(Rhs family protein)、转座子(putative transposase)等基因中。同时对噻枯唑敏感性变异的突变体胞外多糖含量和细胞膜的电导率研究发现,抗药性菌株的胞外多糖水平下降;所有突变体的细胞膜通透性提高。

关键词：水稻黄单胞杆菌 tn5转座子突变体文库噻枯唑筛选