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人结肠癌细胞 HT-29表达 tn 抗原的机制研究

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中华微生物学和免疫学杂志 2015年第3期35卷 219-224页

作者：于晓锋杜镇镇孙旭红石传芹张怀祥胡涛滨州医学院免疫学教研室烟台264003 基础医学概论教研室

目的：探讨结肠癌细胞株HT-29中tn（＋）细胞表达tn抗原的机制。方法免疫磁珠分选结肠癌细胞株HT-29中HT-29-tn（＋）细胞与HT-29-tn（－）细胞；RT-PCR、PCR 扩增Cosmc基因，测序比对是否存在基因突变。野生型Cosmc转染正常及肿瘤细胞... 详细信息

目的：探讨结肠癌细胞株HT-29中tn（＋）细胞表达tn抗原的机制。方法免疫磁珠分选结肠癌细胞株HT-29中HT-29-tn（＋）细胞与HT-29-tn（－）细胞；RT-PCR、PCR 扩增Cosmc基因，测序比对是否存在基因突变。野生型Cosmc转染正常及肿瘤细胞；Western blot检测转染后Cosmc蛋白表达状况；荧光分析法检测转染前后T-synthase活性。结果分选后的HT-29-tn（＋）细胞缺乏T-synthase活性，Cosmc基因编码区缺失，转染WtCosmc可恢复tn抗原阳性细胞的T-synthase活性，抑制tn抗原表达。结论 Cosmc基因编码区缺失引起T-synthase活性丧失导致人结肠癌HT-29-tn（＋）细胞表达tn抗原。

关键词： tn抗原 HT-29细胞基因突变

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tn抗原在上皮性卵巢癌中的表达及临床意义

Tn抗原在上皮性卵巢癌中的表达及临床意义

作者：方华吉林大学

学位级别：硕士

目的：通过检测tn抗原在上皮性卵巢癌中的表达，分析其与上皮性卵巢癌临床病理因素的相关性，探究tn抗原在卵巢肿瘤发生、发展中的作用，希望为卵巢癌的早期诊断、治疗及预后判断提供新的参考指标。方法：选用链霉亲和素-生物素-辣... 详细信息

目的：通过检测tn抗原在上皮性卵巢癌中的表达，分析其与上皮性卵巢癌临床病理因素的相关性，探究tn抗原在卵巢肿瘤发生、发展中的作用，希望为卵巢癌的早期诊断、治疗及预后判断提供新的参考指标。方法：选用链霉亲和素-生物素-辣根过氧化物酶(SP)凝集素组化方法。检测tn抗原在正常卵巢组织、上皮性卵巢良性肿瘤组织、交界性上皮性卵巢肿瘤组织和上皮性卵巢癌组织中的表达情况。应用SPSS19.0软件包进行统计学分析。采用χ2检验和Fisher确切概率法分析tn抗原在各组织中的表达及与临床病理因素之间的关系。结果： ***抗原在正常卵巢组织、良性上皮性卵巢肿瘤组织、交界性上皮性卵巢肿瘤组织和上皮性卵巢癌的表达率分别为0（0/8），12%（3/26），50%（8/16），88%（44/50）。tn抗原在卵巢癌组织中的阳性表达率是88%，与良性卵巢瘤组织（12%）之间有显著性差异（P0.05）。 ***抗原在卵巢癌组织中是高表达，卵巢癌阳性表达率为88%（44/50），tn抗原在浆液性卵巢癌阳性表达率为80%（8/10），粘液性卵巢癌阳性表达率为100%（6/6），子宫内膜样卵巢癌阳性表达率为89%（16/18），透明细胞癌阳性表达率为100%（10/10），未分化卵巢癌阳性表达率为67%（4/6）。各组织类型间均无统计学差异（P>0.05）。 ***抗原阳性表达率在手术病理分期较早组低于手术病理分期较晚组。Ⅰ期和Ⅱ期卵巢癌组织的tn抗原阳性表达差异有统计学意义(Ptn抗原阳性表达差异有统计学意义(Ptn抗原阳性表达差异无统计学意义（P>0.05）。 ***抗原在高分化、中分化、低分化卵巢癌阳性表达率分别为67%（4/6）、75%（6/8）、100%（20/20）。低分化卵巢癌组织中tn抗原阳性表达率高于高分化、中分化卵巢癌组织，低分化卵巢癌组织和高分化卵巢癌组织比较，P抗原在有淋巴结转移卵巢癌组织阳性表达率为94%（15/16），无淋巴结转移的阳性表达率为85%（29/34），两组间比较P>0.05，差异无统计学意义。结论： 1、tn抗原在正常卵巢组织、良性卵巢瘤组织表达极低，而交界性卵巢瘤组织及卵巢癌组织中的阳性表达率明显增高，差异显著。提示tn抗原的高表达可能在卵巢癌的发生、发展中发挥了一定的作用。 2、tn抗原阳性表达与临床期别、组织学分级有关系，tn抗原随着临床期别的升高及组织恶性程度的增高，阳性表达率逐渐增高。tn抗原的阳性表达与淋巴结转移及组织学类型均无相关性。tn抗原可能参与了卵巢癌的发生、发展过程，有可能作为卵巢癌的肿瘤标记物之一，可能作为卵巢癌预后的判断指标。

关键词： tn抗原卵巢上皮性肿瘤凝集素组织化学肿瘤标志物

tn抗原在子宫内膜癌组织中的表达及临床意义

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Tn抗原在子宫内膜癌组织中的表达及临床意义

作者：魏曼吉林大学

学位级别：硕士

研究目的：本研究旨在应用免疫组化方法检测tn抗原在正常子宫内膜组织、不典型增生子宫内膜组织及子宫内膜癌组织中的表达情况，研究tn抗原在子宫内膜癌组织中的表达情况与肌层浸润深度、手术病理分期、组织病理学分级、淋巴结转移情... 详细信息

研究目的：本研究旨在应用免疫组化方法检测tn抗原在正常子宫内膜组织、不典型增生子宫内膜组织及子宫内膜癌组织中的表达情况，研究tn抗原在子宫内膜癌组织中的表达情况与肌层浸润深度、手术病理分期、组织病理学分级、淋巴结转移情况及脉管有无癌栓的关系，探讨tn抗原在子宫内膜癌的发生、发展及预后中的作用，为子宫内膜癌的早期诊断、治疗及预后提供一定的参考依据。研究方法：我们选取了139例临床样本，其中正常子宫内膜组织25例，不典型增生子宫内膜组织10例，子宫内膜癌组织104例，采用免疫组织化学方法以半乳糖胺特异性凝集素VVL（vicia villosa lectin）去检测组织中的tn抗原表达情况。研究结果： 1、tn抗原在正常子宫内膜组织、不典型增生子宫内膜组织及子宫内膜癌组织的阳性表达率分别为：12%（3/25）、30%（3/10）、69%（72/104），tn抗原在子宫内膜癌组织中的阳性表达率明显升高。子宫内膜癌组织阳性表达率（69%）与正常子宫内膜组织阳性表达率（12%）比较(P=0.000)P0.05，差异无统计学意义。 2、tn抗原在子宫内膜癌手术病理分期Ⅰ-Ⅱ期阳性表达率为63%（50/80），Ⅲ-Ⅳ期阳性表达率为92%（22/24），两者之间比较（P=0.014）Ptn抗原在Ⅰ型子宫内膜癌阳性表达率为77%（46/60），Ⅱ型子宫内膜癌阳性表达率为59%（26/44），两者之间比较P>0.05，差异没有统计学意义。 4、tn抗原在G1、G2、G3子宫内膜癌组织阳性表达率分别为：43%（12/28）、66%（21/32）、89%（39/44），G3与G2比较，G3与G1比较， Ptn抗原在子宫内膜癌组织肌层浸润深度tn抗原在有淋巴结转移子宫内膜癌组织阳性表达率为83%（30/36），无淋巴结转移的阳性表达率为62%（42/68），两者之间比较（P=0.041）Ptn抗原在脉管有癌栓子宫内膜癌组织阳性表达率为70%（28/40），脉管无瘤栓的阳性表达率为69%（44/64），两者之间比较P>0.05，差异没有统计学意义。结论： 1、tn抗原在正常子宫内膜组织、非典型增生内膜组织及子宫内膜癌组织中的阳性表达率逐渐增高，提示tn抗原的高表达可能在子宫内膜癌的发生、发展中发挥了一定的作用。 2、tn抗原在子宫内膜癌中的高表达与手术病理分期、肌层浸润深度、淋巴结转移及组织学分级有关，提示tn抗原可能参与了子宫内膜癌的转移、浸润过程。

关键词：子宫内膜癌免疫组化 tn抗原

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生物素标记的tn抗原的合成

化学试剂 2009年第5期31卷 334-336,361页

作者：冯丽娟孙志勇遵义医学院珠海校区生物工程系广东珠海519041

以全乙酰化的2-叠氮基半乳糖基三氯乙酰亚胺酯为起始原料,通过与L-苏氨酸衍生物的糖基化反应以及叠氮还原,并同时进行N-乙酰化的一锅法反应制得全保护的tn抗原,在脱去苏氨酸上的氨基保护基后,含生物素的琥珀酰亚胺酯与tn抗原上的氨基发... 详细信息

以全乙酰化的2-叠氮基半乳糖基三氯乙酰亚胺酯为起始原料,通过与L-苏氨酸衍生物的糖基化反应以及叠氮还原,并同时进行N-乙酰化的一锅法反应制得全保护的tn抗原,在脱去苏氨酸上的氨基保护基后,含生物素的琥珀酰亚胺酯与tn抗原上的氨基发生选择性胺解得到标题化合物。目标产物及重要中间体的结构都通过1HNMR、13CNMR和MS进行了表征。

关键词： tn抗原生物素糖基化反应合成

活化T细胞表面tn抗原动态变化与Cosmc之间的关系研究

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中国病原生物学杂志 2017年第5期12卷 428-433页

作者：石传芹徐雪于晓锋刘栋于泽顺河恩玲杜镇镇胡涛滨州医学院免疫学教研室泰山学者团队山东烟台264003 临淄区人民医院山东淄博255400 滨州医学院附属医院山东滨州256600

目的探讨T细胞活化过程中表面tn抗原的表达状况与Cosmc转录及蛋白表达水平之间的关系。方法30例健康志愿者,男15例,女15例,平均年龄(34±8.9)。抽取志愿者外周静脉血,肝素抗凝,采用Ficoll密度梯度离心法分离单个核细胞(peripheral blood... 详细信息

目的探讨T细胞活化过程中表面tn抗原的表达状况与Cosmc转录及蛋白表达水平之间的关系。方法30例健康志愿者,男15例,女15例,平均年龄(34±8.9)。抽取志愿者外周静脉血,肝素抗凝,采用Ficoll密度梯度离心法分离单个核细胞(peripheral blood mononuclear cell,PBMC),免疫磁珠法分选纯化的CD3+T细胞,分别采用T细胞活化剂Cocktail、CD3/CD28Dynabeads刺激12、24、36、48、60、72h。流式细胞术检测两种活化剂刺激活化前后不同时间点CD3+T细胞中tn+细胞的百分率及tn抗原平均荧光强度,采用RT-PCR和Western blot检测两种活化剂刺激活化前后不同时间点T细胞中Cosmc转录及蛋白表达状况,采用荧光分析法检测T-synthase活性,应用SPASS13.0软件进行统计学分析,阐明活化T细胞表面tn抗原动态变化与Cosmc之间的关系。结果 Cocktail、CD3/CD28Dynabeads均能促使活化T细胞表面表达tn抗原,以及tn抗原表达的平均荧光强度随活化时间的延长先升高后下降。CD3/CD28Dynabeads活化组tn+细胞百分率的峰值出现在活化后48h,而Cocktail活化组峰值出现在活化后60h,差异具有统计学意义(Ptn抗原表达水平相反,差异具有统计学意义(Ptn抗原表达呈动态变化,表达水平与Cosmc转录及蛋白水平下降、T-synthase活性降低密切相关,为以tn抗原为靶点治疗由T细胞活化引起的免疫性疾病提供了重要依据。

关键词： T淋巴细胞 tn抗原分子伴侣Cosmc T细胞活化剂(CD3CD28 Dynabeads,Cocktail)

基于tn抗原和葡聚糖颗粒佐剂的肿瘤疫苗研究

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基于Tn抗原和葡聚糖颗粒佐剂的肿瘤疫苗研究

作者：成素英天津科技大学

学位级别：硕士

肿瘤相关糖类抗原tn(tn antigen,GalNAc-α-Ser/Thr)是粘蛋白型O-聚糖的核心结构,正常情况下受到糖基转移酶的修饰,形成复杂的糖链结构。研究表明,多种上皮来源肿瘤(例如结肠癌、乳腺癌、胰腺癌、卵巢癌等)均可检测到tn抗原异常表达,并... 详细信息

肿瘤相关糖类抗原tn(tn antigen,GalNAc-α-Ser/Thr)是粘蛋白型O-聚糖的核心结构,正常情况下受到糖基转移酶的修饰,形成复杂的糖链结构。研究表明,多种上皮来源肿瘤(例如结肠癌、乳腺癌、胰腺癌、卵巢癌等)均可检测到tn抗原异常表达,并且tn抗原与肿瘤的转移和预后密切相关,其可能参与肿瘤的发生和转移,常常作为肿瘤标志物。此外,越来越多的研究证明,佐剂是肿瘤疫苗促进免疫系统产生特异性抗体不可缺少的成分,新型佐剂的开发及使用为肿瘤疫苗的设计和评价提供了重要的物质基础。本研究基于肿瘤相关糖抗原tn,选用面包酵母制备的β-1,3-葡聚糖颗粒作为疫苗佐剂,在肿瘤疫苗的合成和评价方面进行了以下研究:(1)设计并合成了 tn抗原和氟代衍生物(Ftn),以氨基半乳糖盐酸盐为起始原料,以39%收率获得tn抗原和27%收率获得氟代tn抗原,NMR验证了化合物的准确性和纯度。并将tn/Ftn抗原与鸡卵清蛋白OVA偶联得到糖抗原OVA-tn/Ftn,MALDI-TOF-MS验证糖蛋白的成功结合,并计算出OVA的载糖率为2.5%;(2)以面包酵母为原料设计并制备了β-1,3-葡聚糖颗粒(Glucan Particles,GP),通过对GP的氧化方法和负载糖蛋白的方法的选择优化,成功制备了产率为15%氧化葡聚糖颗粒(GP-COOH)和载糖量为0.6%的疫苗(GP-COOH-OVA-tn/Ftn),通过DLS验证糖抗原与GP-COOH成功偶联;(3)开展了基于tn抗原的肿瘤疫苗免疫活性评价的研究。探索了酵母β-1,3-葡聚糖颗粒作为疫苗佐剂对抗原免疫原性和诱导免疫类型的影响。小鼠免疫评价结果显示,GP-COOH-OVA-tn诱导小鼠产生高效价的IgG抗体水平(滴度值25833),IgG2a/IgG1 比值较低说明激活了 T细胞依赖的Th2型免疫反应,细胞因子实验中候选疫苗GP-COOH-OVA-tn的IL-4因子表达量(均值81.1 pg/mL)高于IFN-γ因子(均值37.8 pg/mL)证实了免疫分型的结论;同时还对小鼠生长状态和体重的监测评估了疫苗的安全性。综上,本研究基于tn抗原在肿瘤细胞中异常表达的特性,以制备的tn-OVA作为免疫原,初次使用GP作为疫苗佐剂,成功制备出新型肿瘤疫苗,实验证明了其高免疫原性和安全性。该研究成果为肿瘤疫苗的设计和开发方面提供了新思路。

关键词： tn抗原 β-1,3-葡聚糖肿瘤疫苗疫苗佐剂

基于tn抗原并内含壳三糖佐剂的肿瘤疫苗的全合成和免疫学评价

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基于Tn抗原并内含壳三糖佐剂的肿瘤疫苗的全合成和免疫学评价

作者：亚强天津科技大学

学位级别：硕士

肿瘤相关碳水化合物抗原(TACAs)是由转化为肿瘤细胞时出现的异常糖基化产生的。Thomsen-nouveau(tn)抗原是一种与肿瘤相关的O连接粘蛋白糖肽,具有α构型的N-乙酰半乳糖胺(Gal NAc)残基。作为最常见的肿瘤相关碳水化合物抗原(TACAs)之一... 详细信息

肿瘤相关碳水化合物抗原(TACAs)是由转化为肿瘤细胞时出现的异常糖基化产生的。Thomsen-nouveau(tn)抗原是一种与肿瘤相关的O连接粘蛋白糖肽,具有α构型的N-乙酰半乳糖胺(Gal NAc)残基。作为最常见的肿瘤相关碳水化合物抗原(TACAs)之一,tn抗原在大约90%的癌症中表达。因此,tn抗原被广泛用作生物标志物和作为针对表达tn的癌症的免疫治疗靶点。壳三糖(Chitotriose,CTS)是由氨基葡萄糖经β-1,4糖苷键连接而成的碱性氨基三糖。壳三糖的水溶性及生物相容性非常好,且能有效激活机体免疫系统,发挥免疫调节功能的作用,其被证明具有优良的疫苗佐剂活性,具有潜在的应用前景。本研究设计并成功合成了含有壳三糖内源性佐剂的tn肿瘤疫苗,并对其免疫活性进行评价。具体为:(1)本文以氨基半乳糖盐酸盐为起始原料,通过7步化学反应,以41%的总收率合成了还原端末端为氨基的tn糖抗原(Gal NAcαPro N3);(2)制备含有双功能基团的连接臂Linker,通过DSA这种双功能基团并将tn糖抗原通过连接臂与载体蛋白KLH偶联,成功制备出糖蛋白缀合物tn-KLH;(3)对分离纯化的壳三糖进行巯基化衍生;(4)将巯基化壳三糖与活化后的tn-KLH糖蛋白进行偶联,成功制备出糖蛋白缀合物疫苗tn-KLH-CTS。免疫实验结果显示,tn-KLH-CTS组与tn-KLH/CTS物理混合组均可以诱导强烈免疫反应,其抗tn的Ig G抗体滴度可以分别达到51200和102400。另外,tn-KLH-CTS疫苗组诱导产生体液免疫Ig M抗体滴度为400,因此证明该疫苗有效激活了T细胞免疫。以上研究将为壳寡糖作为新型疫苗佐剂用于抗肿瘤疫苗研制提供理论依据,也丰富了肿瘤相关糖抗原在肿瘤治疗中的应用。

关键词： tn抗原壳三糖糖缀合物结合疫苗佐剂

基于tn抗原和糖肽自组装佐剂的肿瘤疫苗研制

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基于Tn抗原和糖肽自组装佐剂的肿瘤疫苗研制

作者：高颖天津科技大学

学位级别：硕士

肿瘤相关糖抗原(tumor-associated carbohydrate antigens,TACAs)是由肿瘤细胞表面异常糖基化产生的。Thomsen-nouveau(tn)抗原是O型粘蛋白糖基化形式,在多种肿瘤细胞中表达。因此,tn抗原被广泛用作生物标志物和作为针对表达tn的癌症的... 详细信息

肿瘤相关糖抗原(tumor-associated carbohydrate antigens,TACAs)是由肿瘤细胞表面异常糖基化产生的。Thomsen-nouveau(tn)抗原是O型粘蛋白糖基化形式,在多种肿瘤细胞中表达。因此,tn抗原被广泛用作生物标志物和作为针对表达tn的癌症的免疫治疗靶点。甘露糖属于连接先天免疫和适应性免疫的模式识别分子,并识别广泛的内源性和外源性配体。单核细胞来源的树突状细胞(DC)上有大量甘露糖表达,甘露糖有助于产生多种HLA限制性抗原特异性T细胞反应。探索合适有效的佐剂一直是提高治疗性疫苗作用的一个方向。本课题将甘露糖负载到一种具有两亲性的糖肽上,通过超声分散使之在水溶液中实现了自组装,所形成的纳米颗粒表面有多个甘露糖,相当于成为糖簇,具有多价效应。将这种纳米颗粒作为佐剂,与tn抗原一起制备肿瘤疫苗,并对其免疫活性进行评价。本课题最后制备出糖蛋白缀合物疫苗tn-OVA/Man NPs。DLS结果显示,该甘露糖糖肽自主装纳米颗粒粒径为167.6±45.6,亲水性的甘露糖基暴露在纳米颗粒表面。使用Man NPs佐剂与免疫抗原tn-OVA联合免疫小鼠,实验结果显示,甘露糖糖肽纳米颗粒作为佐剂可以显著提高糖蛋白疫苗的免疫原性,可以诱导机体产生较高的Ig G抗体滴度(9800),高于弗氏佐剂组(Ig G 4900)。综上,本文研究结果拓展了应用佐剂的形式,也丰富了肿瘤相关糖抗原在肿瘤治疗中的应用,为新型疫苗佐剂的研制提供了理论依据。

关键词： tn抗原甘露糖糖肽糖缀合物自组装佐剂肿瘤疫苗

活化剂体外诱导人T细胞表达tn抗原的机制研究

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活化剂体外诱导人T细胞表达Tn抗原的机制研究

作者：石传芹滨州医学院

学位级别：硕士

***3/CD28体外诱导人T细胞表达tn抗原的机制研究目的:通过CD3/CD28诱导T细胞体外活化后检测其表面tn抗原表达的情况,探讨Cosmc基因对tn抗原表达的影响及其调控机制。方法:选用来自烟台中心血站的30例健康成人抗凝血,Ficoll密度梯度离心... 详细信息

***3/CD28体外诱导人T细胞表达tn抗原的机制研究目的:通过CD3/CD28诱导T细胞体外活化后检测其表面tn抗原表达的情况,探讨Cosmc基因对tn抗原表达的影响及其调控机制。方法:选用来自烟台中心血站的30例健康成人抗凝血,Ficoll密度梯度离心法分离人外周血单个核细胞(PBMC),免疫磁珠分选获得纯化的CD3+T淋巴细胞,CD3/CD28活化T细胞12h,24h,36h,48h,60h,72h;流式细胞术检测活化前后不同时间段CD4+、CD8+T细胞表面tn抗原表达的百分率,并对不同亚群T细胞表面tn抗原的平均荧光强度进行统计学分析。RT-PCR,Western-blot分别检测Cosmc在基因转录与蛋白水平上的表达变化,荧光分析法检测各活化时间点T-synthase活性的改变;ELISA检测活化前后各时间点细胞培养上清中IL-4,IFN-γ的分泌情况;测序比对Cosmc编码区是否存在基因突变;BSP法检测活化前后Cosmc启动子的甲基化状态。结果:CD3/CD28活化T细胞表面均表达tn抗原,并表现为时间依赖性。但tn抗原的表达情况存在差异,tn抗原的表达量高峰出现在活化后48h。Cosmc cDNA、Cosmc蛋白水平,T-synthase活性均随活化时间的延长而下降;且与tn抗原表达水平呈负相关。随着活化时间的延长,IL-4的分泌水平先升高后下降,IFN-γ分泌水平与其相反;活化T细胞的Cosmc编码区未发生基因突变,但其启动子及SP1/SP3结合位点呈高甲基化。结论:CD3/CD28体外诱导T细胞活化后表达tn抗原的机制可能是Cosmc启动子及SP1/3结合位点的高甲基化导致Cosmc转录与蛋白水平下降,进而间接调控tn抗原的表达。*** Stimulation Cocktail体外诱导T细胞表达tn抗原的动态变化研究目的:探讨活化剂Cell Stimulation Cocktail体外诱导T细胞活化过程中,其表面tn抗原的表达情况及其与Cosmc转录及蛋白表达水平之间的关系。方法:Ficoll密度梯度离心法分离健康人外周血单个核细胞(PBMC),免疫磁珠分选CD3+T细胞,加入T细胞活化剂Cell Stimulation Cocktail,置于37℃细胞培养箱中培养12h,24h,36h,48h,60h,72h。流式细胞术检测T细胞活化前后不同时间点T细胞中tn+细胞的百分率及tn抗原平均荧光强度;采用qPCR,RT-PCR,扩增Cosmc基因;Western-blot分别检测各活化时间点T细胞中Cosmc蛋白表达状况;荧光分析法检测活化各时间点T细胞中T-synthase的活性。结果:T细胞活化剂Cocktail活化T细胞致使其表面表达tn抗原,且tn+细胞的百分率随活化时间的延长先升高后降低。活化各时间点T细胞的Cosmc转录及蛋白水平、T-synthase活性均随活化时间延长呈先降低后升高的趋势,此变化与tn抗原表达水平相反。结论:Cocktail刺激T细胞活化过程中tn抗原表达呈动态变化,表达水平与Cosmc转录及蛋白水平下降、T-synthase活性降低密切相关。

关键词： T cell CD3/CD28 Cosmc T-synthase 启动子甲基化 SP1/SP3-binding sites T cell tn抗原 Cosmc T-synthase Cell Stimulation Cocktail