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Expression and Characterization of a Thermostable Xylanase Gene xynA from a Themophilic Fungus in Pichia pastoris

Agricultural Sciences in China 2011年第3期10卷 343-350页

作者： ZHAO Nan GUO Run-fang YU Hong-wei, KE Xiao-jing, JIA Ying-min KE Xiao-jing JIA Ying-min BAIYu Department of Bioengineering College of Food Science and Technology Hebei Agricultural University Baoding 071001 P.R.China

The gene of xylanase （xynA） was amplified by RT-PCR from the total RNA of a themophilic fungus thermomyces lanuginosus SY2. The sequence analysis showed that gene coding region of mature peptide contained 0.585 kb, which coded 194 amino acids. The putative amino acid sequence and DNA sequence of xylanase from T. lanuginosus SY2 （GenBank no.： GU166389） were 98.97 and 99.49% identical to the other T. lanuginosus （GenBank no.： U35436）. A recombinant plasmid pPIC9K-xynA was constructed by inserting gene xynA into Pichia pastoris secretory vector pPIC9K. Linearized pPIC9K-xynA was transformed into P. pastoris GS115 with the method of electroporation. The recombinant strain was identified by G418 selection and confirmed by PCR analysis. It was induced by 1.0% methanol at 28°C to express the recombinant xylanase. The results showed that the recombinant xylanase was secreted into extracellular fermentation liquid. The highest enzyme activity of 113.5 IU mL-1 and protein content of 889.7 μg mL-1 were detected for 216 h of induction. The optimal pH value and temperature of the enzyme activity was 5.5 and 65°C, respectively. The xylanase activity retained above 80% from pH value 2.5 to 8.5 for 48 h. The enzyme activity was above 85% at incubation temperature of 55°C.

关键词： thermomyces lanuginosus xylanase Pichia pastoris expression

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嗜热真菌thermomyces lanuginosusC5次生代谢产物的研究

嗜热真菌Thermomyces lanuginosusC5次生代谢产物的研究

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作者：张俊贤云南大学

学位级别：硕士

目前已发现了大量含卤素的次生代谢产物,长期与环境的相互作用可能使微生物演化出利用卤素来合成相应代谢产物的能力,也可能使得这些微生物具有独特的代谢途径和代谢产物。本论文以高温真菌thermomyces lanuginosus C5为研究对象,该菌... 详细信息

目前已发现了大量含卤素的次生代谢产物,长期与环境的相互作用可能使微生物演化出利用卤素来合成相应代谢产物的能力,也可能使得这些微生物具有独特的代谢途径和代谢产物。本论文以高温真菌thermomyces lanuginosus C5为研究对象,该菌株分离于云南腾冲热海境内,根据表型差异筛选培养基后,使用添加卤素和不添加卤素的培养基发酵该菌株,研究发酵液乙酸乙酯部的化学成分并探讨其生物活性。从中分离鉴定了7个化合物,其中1个为脂类化合物、2个为萘酮类化合物,2个为PKS-NRPS杂合生源的大环内酯类化合物,1个为甾醇类化合物,1个为神经酰胺类化合物。用添加卤素的培养基培养thermomyces lanuginosus C5,通过对其发酵液乙酸乙酯部化学成分的研究,分离纯化得到了一个脂类化合物(1)、3,4-二氢-4,6,8-三羟基-1-萘酮(2)、3,4-二氢-3,4,6,8-四羟基-1-萘酮(3)、高温菌素F(4)和另一个高温菌素类化合物(5)以及麦角甾-7,22-二烯-3β,5α,6p-三醇(6),其中(1)和(5)为新化合物。测试了高温菌素F(4)的毒杀线虫活性。用不添加卤素的培养基培养thermomyces lanuginosus C5,研究发酵液乙酸乙酯部化学成分,分离纯化后得到一个神经酰胺类新化合物(7)。

关键词：嗜热真菌 thermomyces lanuginosus 卤素大环内酯次生代谢产物

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疏棉状嗜热丝孢菌转录组分析

疏棉状嗜热丝孢菌转录组分析

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中国植物病理学会第十二届青年学术研讨会

作者：耿志刚陈进银李多川山东农业大学

疏棉状嗜热丝孢菌(thermomyces lanuginosus)是嗜热真菌中生长上限温度最高的真菌,广泛存在在自然界中,特别在生物质残体中。为了理解该真菌降解生物质的机制,本研究分别将在微晶纤维素上和葡萄糖培养48 h的疏棉状嗜热丝孢菌的菌丝体进... 详细信息

疏棉状嗜热丝孢菌(thermomyces lanuginosus)是嗜热真菌中生长上限温度最高的真菌,广泛存在在自然界中,特别在生物质残体中。为了理解该真菌降解生物质的机制,本研究分别将在微晶纤维素上和葡萄糖培养48 h的疏棉状嗜热丝孢菌的菌丝体进行转录组测序与分析。转录组比较分析发现:有4 485个差异表达基因,其中上调基因2 301个,下调基因2 184个。上调基因中,***值大于2的207个,大于3的95个,大于4的48个,大于5的25个,大于6的19个,大于7的14个。显著上调表达的基因主要包括:糖苷水解酶、运转体、氧化酶、脱氢酶、转录因子和大量的假想蛋白等基因(hypothetical protein)。上述结果为进一步研究嗜热真菌降解纤维素的分子机制奠定了基础。

关键词：疏棉状嗜热丝孢菌 thermomyces lanuginosus 纤维素酶解转录组

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疏棉状嗜热丝孢菌转录组分析

疏棉状嗜热丝孢菌转录组分析

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中国菌物学会2015年学术年会

作者：耿志刚陈进银李多川山东农业大学

疏棉状嗜热丝孢菌(thermomyces lanuginosus)是嗜热真菌中生长上限温度最高的真菌,广泛存在在自然界中,特别在生物质残体中。为了理解该真菌降解生物质的机制,本研究分别将在微晶纤维素和葡萄糖培养48小时的疏棉状嗜热丝孢菌的菌丝体进... 详细信息

疏棉状嗜热丝孢菌(thermomyces lanuginosus)是嗜热真菌中生长上限温度最高的真菌,广泛存在在自然界中,特别在生物质残体中。为了理解该真菌降解生物质的机制,本研究分别将在微晶纤维素和葡萄糖培养48小时的疏棉状嗜热丝孢菌的菌丝体进行转录组测序与分析。转录组比较分析发现:有4485个差异表达基因,其中上调基因2301个,下调基因2184个。上调基因中,***值大于2的207个,大于3的95个,大于4的48个,大于5的25个,大于6的19个,大于7的14个。显著上调表达的基因主要包括:糖苷水解酶、运转体、氧化酶、脱氢酶、转录因子和大量的假想蛋白等基因(hypothetical protein)。上述结果为进一步研究嗜热真菌降解纤维素的分子机制奠定了基础。

关键词：疏棉状嗜热丝孢菌 thermomyces lanuginosus 纤维素酶解转录组

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疏绵状嗜热丝孢菌遗传转化体系的建立及蛋白激酶定位和敲除载体的构建

疏绵状嗜热丝孢菌遗传转化体系的建立及蛋白激酶定位和敲除载体的...

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作者：韩华山东农业大学

学位级别：硕士

疏绵状嗜热丝孢菌(thermomyces lanuginosus)是一种广泛分布的嗜热真菌,是真核生物中生长上限温度最高的一种真菌,从该菌中已分离了多种嗜热酶,并进行了真核表达,使得该菌种在工、农业生产和微生物研究中的作用越来越大。目前,对该嗜热... 详细信息

疏绵状嗜热丝孢菌(thermomyces lanuginosus)是一种广泛分布的嗜热真菌,是真核生物中生长上限温度最高的一种真菌,从该菌中已分离了多种嗜热酶,并进行了真核表达,使得该菌种在工、农业生产和微生物研究中的作用越来越大。目前,对该嗜热菌感受和传导信号的机制尚不清楚。通过遗传转化,向菌株基因组随机插入外源质粒DNA,构建该菌的突变体,对探索该菌的嗜热性机制具有重要意义。此外,遗传转化体系的构建为研究基因的功能,分离功能基因提供了重要的手段,也为外源基因在其体内的表达提供了有效地途径。农杆菌介导的转化因其优点众多而得到广泛的利用,而此方法尚未在嗜热真菌的转化中获得成功。本文以嗜热真菌***为研究对象,首次利用农杆菌介导的方法建立了其遗传转化体系,并对该体系的转化条件进行了优化,包括农杆菌菌株,孢子萌发时间,孢子浓度及乙酰丁香酮的浓度对转化效率的影响。最终确定农杆菌菌株EHA105在孢子萌发4h,孢子浓度为5×106个/皿,共培养时AS浓度为500μM时,转化效率达到最高。随机挑选转化子进行PCR验证,结果证明潮霉素基因已经整合到受体菌的基因组中;连续转接5代,大部分转化子能够稳定遗传。对转化子进行了Southern杂交验证,单拷贝插入率较高,达到了83.3%;分离T-DNA插入位点的侧翼序列,经分析得出T-DNA的插入位点是随机的,证明该体系是一个高效获得插入突变体的体系。此外,通过电击的方法转化将质粒pUCATPH转化***的原生质体,转化子经PCR验证潮霉素基因已经整合到受体菌的基因组中。蛋白激酶基因pspk是我们从疏绵状嗜热丝孢菌中分离到的1种新的蛋白激酶基因,通过生物信息学分析推测其可能具有mRNA裁剪的功能,其具体的功能尚需进行研究分析。预测蛋白质的亚细胞定位信息对于了解其功能有重要的意义,为分析***蛋白激酶基因pspk的功能,构建了该基因与GFP基因的融合表达载体pROK Ⅱ-GFP-pspk,通过农杆菌介导的方式转化洋葱表皮细胞并在其中进行表达,在荧光显微镜下进行观察,绿色荧光出现在细胞核的位置,推测该蛋白激酶在洋葱表皮亚细胞定位的部位为细胞核。为进一步分析该基因的功能,依据同源重组原理构建了敲除该基因的打靶载体pUCATPH/PK和pROK Ⅱ-hygro/PK,分别用于电击转化和农杆菌介导的转化方法敲除该基因,上下游同源臂分别为739bp和737bp,为今后进行嗜热真菌***中蛋白激酶基因pspk的敲除,获得pspk基因缺失的突变体,研究该基因的功能提供了重要材料。

关键词： thermomyces lanuginosus 转化体系蛋白激酶亚细胞定位基因敲除载体

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嗜热真菌蛋白激酶基因的克隆、表达与打靶载体构建

嗜热真菌蛋白激酶基因的克隆、表达与打靶载体构建

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作者：彭延杰山东农业大学

学位级别：硕士

信号转导是外界同生物体或生物体细胞间的信息传递的重要手段,许多研究证,生物信号在细胞内传递的主要方式就是蛋白激酶和蛋白磷酸酶催化的蛋白质可逆酸化,通过磷酸化和去磷酸化作用使蛋白质发生构型和构象的变化,从而调节其活,通过激... 详细信息

信号转导是外界同生物体或生物体细胞间的信息传递的重要手段,许多研究证,生物信号在细胞内传递的主要方式就是蛋白激酶和蛋白磷酸酶催化的蛋白质可逆酸化,通过磷酸化和去磷酸化作用使蛋白质发生构型和构象的变化,从而调节其活,通过激酶级联信号传导途径将信号传导到细胞核,通过对转录因子和离子通道蛋的调控而调节基因的表达。本研究通过RT-PCR的技术克隆了嗜热真菌thermomyces lanuginosus的蛋白激酶因,对其进行生物信息学分析。构建表达载体pPIC9K/pk和pPIC3.5K/pk并转化毕赤母GS115,通过G418多拷贝筛选,选定转化pPIC9K/pk胞外表达菌株和PIC3.5K/pk胞内表达菌株,分别命名为PS-PK-16和PS-PK-18。工程菌PS-PK-18的发酵产物分析发现与对照组有明显差异的蛋白,对此蛋白进行谱分析为ATPase,ATPase与细胞耐醇能力及维持胞内pH稳定等方面有重要作用。测胞内蛋白激酶的过表达对菌体ATPase的表达产生影响,利于酵母菌抵抗外界的高透压及醇类物质给菌体带来的伤害,提高酵母菌在高渗透压,低营养物质的不良环中主动运输的效率,使酵母菌在摇瓶发酵过程中适应不良的外界环境,维持菌体的常生长。根据已知序列设计用于荧光定量PCR的蛋白激酶基因和管家基因的引物,对原始株及转化得到的酵母工程菌株进行表达量的差异性分析。结果显示,在原始菌株培1～7天中,第一天的表达量最高,大约为其他六天的五十倍左右,其余六天的表达差异不大,这可能与在生长发育的初期,菌体代谢旺盛,参与生长发育的各种循环径基本都处于激活状态,发挥作用的酶的数量较多,因此需要大量的蛋白激酶来对关反应进行调节;在构建的酵母工程菌PS-PK-18发酵培养1～9天中,第四天的表达最高,大约为其余八天的四倍左右,其余八天的表达量差异不大。依据同源重组原理,以pUCATPB为基础构建了蛋白激酶基因的敲除突变载体UCATPB/PK。载体中分别取蛋白激酶基因上游670bp和下游731bp的片段作为同源组的两臂,并以博来霉素为筛选标记进行构建。构建完成后经过一系列的PCR验证酶切验证,确定已经成功构建了打靶载体pUCATPB/PK,为疏绵状嗜热丝孢菌的蛋激酶基因打靶提供了材料。

关键词： thermomyces lanuginosus 蛋白激酶 cDNA克隆异源表达荧光定量PCR RT-PCR 打靶载体

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