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中国实验动物学报 2020年第1期28卷 1-9页

作者：王菲原一桐高渊涛田峰田野李宵李承罡杜若琛李鹏飞王雅丽王春芳山西医科大学实验动物中心太原030001 南昌大学玛丽女王学院南昌330000 山西省人民医院太原030001 山西医科大学第二医院骨科太原030001

目的构建稳定表达的tdtomato转基因小鼠并建系,观察其细胞及组织的荧光表达水平以及其干细胞共培养后的荧光表达水平。方法使用Gateway clone技术和DNA显微注射法构建含有tdtomato表达载体的受精卵,移植至假孕母鼠体内,待其自然生产。... 详细信息

目的构建稳定表达的tdtomato转基因小鼠并建系,观察其细胞及组织的荧光表达水平以及其干细胞共培养后的荧光表达水平。方法使用Gateway clone技术和DNA显微注射法构建含有tdtomato表达载体的受精卵,移植至假孕母鼠体内,待其自然生产。使用双向鉴定法鉴定并挑取饲养阳性小鼠并建系。另提取tdtomato阳性小鼠的神经干细胞分别与eGFP小鼠的骨髓间充质干细胞、原代神经干细胞共培养。结果成功构建了tdtomato转基因小鼠并建系,与野生型小鼠相比,tdtomato转基因小鼠生化指标和生长性状无明显差异,其组织切片及脑源神经干细胞均可观察到红色荧光。示踪实验表明注射部位可观察到明显的荧光成像,共培养实验可以清晰的观察到细胞分化后荧光的稳定表达。结论tdtomato转基因小鼠的组织和细胞能稳定表达红色荧光,可以利用荧光鼠的自发荧光特性,研究干细胞共培养后的分化方向。

关键词：工具鼠 tdtomato 转基因小鼠细胞共培养

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tdtomato转基因小鼠的建系及其在细胞示踪方面的应用研究

tdTomato转基因小鼠的建系及其在细胞示踪方面的应用研究

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作者：王菲山西医科大学

学位级别：硕士

目的:1.构建稳定表达的tandem-dimer Tomato（tdtomato）转基因小鼠并建系,观察其全身多器官组织的荧光表达情况,检测其生理生化指标有无异常,确保其符合实验小鼠的标准;2.提取tdtomato转基因小鼠的神经干细胞,观察其在活体细胞移植示... 详细信息

目的:1.构建稳定表达的tandem-dimer Tomato（tdtomato）转基因小鼠并建系,观察其全身多器官组织的荧光表达情况,检测其生理生化指标有无异常,确保其符合实验小鼠的标准;2.提取tdtomato转基因小鼠的神经干细胞,观察其在活体细胞移植示踪实验中的荧光表达情况。初步尝试双色异体干细胞共培养实验,意在探究离体细胞培养以及分化时荧光表达的稳定性。方法:本实验分为两个部分。第一部分,使用Gateway clone技术构建tdtomato载体后,将过表达载体通过DNA显微注射法注入受精卵,然后移植至假孕母鼠体内,待其发育足月后自然生产。使用双向鉴定法鉴定并挑取阳性tdtomato转基因小鼠,置于山西医科大学实验动物中心的屏障环境中进行饲养,交叉配种繁殖并建系。送检生理生化指标检测,与正常野生小鼠进行统计学分析。第二部分,提取tdtomato转基因小鼠的神经干细胞培养至3代,随后移植到脊髓损伤小鼠模型的脊髓损伤部位进行示踪观察。另提取eGFP转基因小鼠的骨髓间充质干细胞和神经干细胞分别与tdtomato转基因小鼠的神经干细胞进行双色异体干细胞共培养实验,跟踪拍摄干细胞分化情况并观察两种荧光的表达情况。结果:成功构建了tdtomato转基因小鼠并建系,与野生型小鼠相比,tdtomato转基因小鼠生化指标和生长性状无明显差异,其组织切片及脑源神经干细胞均可观察到红色荧光。示踪实验表明注射部位可观察到明显的荧光成像,共培养实验可以清晰的观察到细胞分化后荧光的稳定表达。结论:tdtomato转基因小鼠的组织和细胞能稳定表达红色荧光,其阳性率会随着代数的繁殖而增加。常规的实验操作亦不会影响红色荧光的稳定表达,也能够支持细胞离体培养以及异色异体共培养的实验要求。以上实验结果表明tdtomato转基因小鼠是一种操作更便捷、实用性更高的荧光工具鼠,可以广泛应用于细胞水平的实验研究。

关键词：工具鼠 tdtomato 转基因小鼠细胞示踪细胞共培养

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tdtomato转基因小鼠的建系及其在细胞示踪方面的应用研究

tdTomato转基因小鼠的建系及其在细胞示踪方面的应用研究

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第十六届中国实验动物科学年会

作者：王菲原一彤高渊涛田峰田野李宵李成罡杜若琛李鹏飞王雅丽王春芳山西医科大学实验动物中心南昌大学玛丽女王学院山西省人民医院山西医科大学第二医院骨科

目的构建稳定表达的tdtomato转基因小鼠并建系,观察其细胞及组织的荧光表达水平以及其干细胞共培养后的荧光表达水平。方法使用Gateway clone技术和DNA显微注射法构建含有tdtomato表达载体的受精卵,移植至假孕母鼠体内,待其自然生产。使用双向鉴定法鉴定并挑取饲养阳性小鼠并建系。另提取tdtomato阳性小鼠的神经干细胞分别与eGFP小鼠的骨髓间充质干细胞、原代神经干细胞共培养。结果成功构建了tdtomato转基因小鼠并建系,与野生型小鼠相比,tdtomato转基因小鼠生化指标和生长性状无明显差异,其组织切片及脑源神经干细胞均可观察到红色荧光。示踪实验表明注射部位可观察到明显的荧光成像,共培养实验可以清晰的观察到细胞分化后荧光的稳定表达。结论 tdtomato转基因小鼠的组织和细胞能稳定表达红色荧光,可以利用荧光鼠的自发荧光特性,研究干细胞共培养后的分化方向。

关键词：工具鼠 tdtomato 转基因小鼠细胞共培养

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Cell fusion in the liver, revisited

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World Journal of Hepatology 2018年第2期10卷 213-221页

作者： Michela Lizier Alessandra Castelli Cristina Montagna Franco Lucchini Paolo Vezzoni Francesca Faggioli Istituto di Ricerca Genetica e Biomedica CNR Human Genome Laboratory Humanitas Clinical and Research Center IRCCS Department of Genetics and Pathology Genetics Albert Einstein College of Medicine Centro Ricerche Biotecnologiche Università Cattolica del Sacro Cuore

There is wide agreement that cell fusion is a physiological process in cells in mammalian bone, muscle and placenta. In other organs, such as the cerebellum, cell fusion is controversial. The liver contains a considerable number of polyploid cells: They are commonly believed to originate by genome endoreplication, although the contribution of cell fusion to polyploidization has not been excluded. Here, we address the topic of cell fusion in the liver from a historical point of view. We discuss experimental evidence clearly supporting the hypothesis that cell fusion occurs in the liver, specifically when bone marrow cells were injected into mice and shown to rescue genetic hepatic degenerative defects. Those experiments-carried out in the latter half of the last century-were initially interpreted to show "transdifferentiation", but are now believed to demonstrate fusion between donor macrophages and host hepatocytes, raising the possibility that physiologically polyploid cells, such as hepatocytes, could originate, at least partially, through homotypic cell fusion. In support of the homotypic cell fusion hypothesis, we present new data generated using a chimera-based model, a much simpler model than those previously used. Cell fusion as a road to polyploidization in the liver has not been extensively investigated, and its contribution to a variety of conditions, such as viral infections, carcinogenesis and aging, remains unclear.

关键词： Cell fusion Hepatocytes tdtomato Lineage tracing Chimeras Extracellular vesicles

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大鼠品系PGR-iCre构建

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东北农业大学学报 2019年第7期50卷 40-48页

作者：马兴红李媛媛姜南李世杰东北农业大学生命科学学院

采用CRISPR/Cas9基因编辑技术首次制备用于子宫基因敲除的PGR-iCre大鼠。PGR-iCre大鼠与含有Flox报告基因tdtomato大鼠(tdtomatof/f)杂交得到PGRCre+/-- tdtomatof/+大鼠。利用real-time PCR、免疫组化、荧光检测等技术检测tdtomato基因在PGRCre+/-- tdtomatof/+大鼠不同器官表达,间接检测PGR驱动的Cre重组酶组织特异性表达。结果表明,PGR驱动Cre重组酶在大鼠子宫、卵巢、输卵管、乳腺、下丘脑、垂体、脾脏、肾脏、肺等器官不同程度表达;未检测到Cre重组酶在心脏、肝脏、肌肉中表达。综上,PGR-iCre大鼠可作为子宫基因敲除工具鼠研究大鼠子宫表达基因的相关功能。

关键词：孕酮受体基因敲除 tdtomato 大鼠子宫

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大豆慢生根瘤菌3种标记载体构建与应用

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大豆科学 2023年第3期42卷 276-283页

作者：王小倩钟永嘉廖红福建农林大学生命科学学院福建福州350002 福建农林大学根系生物学研究中心福建福州350002

大豆与根瘤菌的共生固氮是农业生态系统中主要的氮来源之一,研究其互作机制意义重大,但是由于根瘤菌个体小,转化难,目前尚缺乏高效、稳定标记根瘤菌的方法,限制了其在互利共生方面的研究。为开发用于大豆与慢生根瘤菌互作研究的根瘤菌... 详细信息

大豆与根瘤菌的共生固氮是农业生态系统中主要的氮来源之一,研究其互作机制意义重大,但是由于根瘤菌个体小,转化难,目前尚缺乏高效、稳定标记根瘤菌的方法,限制了其在互利共生方面的研究。为开发用于大豆与慢生根瘤菌互作研究的根瘤菌标记方法,本研究通过改造原始载体pMG103,构建高效表达tdtomato、GUS、LUC的标记载体,以高效固氮的慢生根瘤菌株系Bradyrhizobium elkanii BXYD3为试验菌株,采用电击转化法进行标记。利用显微镜、GUS染液、化学成像仪观察标记的*** BXYD3根瘤菌在大豆不同时期不同部位的定殖情况。结果表明:成功获得了tdtomato、GUS及LUC标记的慢生根瘤菌转化菌株,携带不同标记的慢生根瘤菌株*** BXYD3能在大豆根表及根瘤内稳定定殖,并且可满足不同试验需求。本研究建立了较为稳定的表达多种标记蛋白的载体,且能较好地应用于慢生根瘤菌株系中,为直观研究大豆与慢生根瘤菌的互作提供有效的方法参考。

关键词：慢生根瘤菌大豆标记共生固氮 tdtomato GUS LUC

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探究Embigin基因对肠神经嵴细胞迁移行为的影响

探究Embigin基因对肠神经嵴细胞迁移行为的影响

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作者：陈颖健华中科技大学

学位级别：硕士

第一部分 Emb基因敲除小鼠的构建及其肠神经系统发育的异常目的:建立可稳定遗传的Emb基因敲除小鼠模型,观察肠神经系统发育的情况。方法:用CRISPR-Cas9基因编辑技术构建Emb基因敲除鼠,通过Western blot和RT-qPCR实验来检测其后代小鼠肠... 详细信息

第一部分 Emb基因敲除小鼠的构建及其肠神经系统发育的异常目的:建立可稳定遗传的Emb基因敲除小鼠模型,观察肠神经系统发育的情况。方法:用CRISPR-Cas9基因编辑技术构建Emb基因敲除鼠,通过Western blot和RT-qPCR实验来检测其后代小鼠肠道中Emb基因的mRNA和蛋白的表达情况。从形态学及免疫荧光组织化学的方面研究基因敲除鼠肠神经系统的表型。结果:我们构建了 Emb基因敲除小鼠模型,并通过一系列实验验证了其肠道组织中相应mRNA和蛋白表达量的减少。我们发现Emb基因敲除鼠毛色与正常小鼠相同,体重与正常对照组相比并无统计学差异,但繁殖过程中Emb-/-小鼠数量较少,不符合孟德尔遗传定律,存在不完全胚胎致死现象。此外,成年小鼠近端肠道粪便淤积,远端狭窄,出现了巨结肠表型,经免疫荧光Tuj1染色发现小鼠结肠远端肠神经嵴细胞缺失。结论:成功构建Emb基因敲除小鼠模型,并且Emb-/-纯合子小鼠存在巨结肠表型,远端结肠中神经节细胞缺失。第二部分 Emb基因敲除小鼠肠神经嵴细胞体外迁移情况的研究目的:体外组织水平探究Emb基因敲除小鼠肠神经嵴细胞的迁移能力。方法:肠神经嵴细胞滤膜爬行实验,即体外培养胎鼠肠道48h后观察肠神经嵴细胞从肠道向外迁移的情况。结果:Emb-/-纯合子小鼠肠神经嵴细胞迁移出的距离明显小于正常对照组,虽然在距离肠道边缘0～100μm范围内肠神经嵴细胞数目稍多于正常对照组,但是迁移出来的细胞总数与对照组相比,明显减少。而Emb+/-杂合子小鼠与正常对照组的肠神经嵴细胞在迁移距离和数量上并无统计学差异。此外,正常对照组小鼠肠道边缘的肠神经嵴细胞轴突垂直于边缘生长,相互密集交错,而Emb+/-小鼠的轴突偶见倒伏生长,相邻间隔增大,Emb-/-小鼠少见垂直生长的轴突,多数缠绕在肠道的表面。结论:Emb基因是肠神经嵴细胞迁移和轴突生长所必须的。Emb-/-纯合子小鼠肠神经嵴细胞迁移能力障碍,迁移距离和细胞数目均减少,并且轴突生长受限。第三部分Emb基因敲除小鼠肠神经嵴细胞体内迁移速度与方向性的研究目的:构建肠神经嵴细胞特异性表达荧光蛋白的Emb基因敲除小鼠模型,通过延时成像实验探究Emb基因对肠神经嵴细胞迁移速度和方向性的影响。方法:利用Cre-loxp重组酶系统构建Sox10-tdtomato转基因荧光鼠,并与Emb基因敲除小鼠交配使其后代的肠神经嵴细胞特异性表达tdtomato荧光蛋白。使用共聚焦显微镜拍摄E12.5d胎鼠肠道中肠神经嵴细胞迁移的延时成像电影。结果:将Sox 10-CreER小鼠与Rosa-tdtomato小鼠交配,孕鼠注射他莫昔芬后,观察到E12.5d胎鼠肠道强烈表达红色荧光。通过延时成像实验观察了其单个肠神经嵴细胞的迁移速度与方向性。结论:成功构建Sox10-tdtomato转基因荧光鼠,其肠神经嵴细胞特异性表达红色荧光蛋白。由于时间原因尚未得到肠神经嵴细胞特异性表达红色荧光蛋白的Emb基因敲除鼠,但是验证了延时成像实验的可行性。

关键词：肠神经系统发育先天性巨结肠肠神经节细胞基因敲除小鼠细胞迁移神经元轴突体外培养 Sox10-Cre tdtomato 延时成像

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