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阿尔茨海默症生物标志物tau蛋白的高准确度定量研究

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阿尔茨海默症生物标志物tau蛋白的高准确度定量研究

作者：陆艳丽北京化工大学

学位级别：硕士

阿尔茨海默症(AD)是一种神经退行性疾病,目前已有多种生物标志物被发现,其中tau蛋白是阿尔茨海默症重要生物标志物之一。tau蛋白异常磷酸化是AD的重要疾病特征,由于没有有效的治病药物,所以只能通过早发现,早预防的方式减少危重症患者,... 详细信息

阿尔茨海默症(AD)是一种神经退行性疾病,目前已有多种生物标志物被发现,其中tau蛋白是阿尔茨海默症重要生物标志物之一。tau蛋白异常磷酸化是AD的重要疾病特征,由于没有有效的治病药物,所以只能通过早发现,早预防的方式减少危重症患者,早发现则需要较为准确的检测方法,以免漏诊或误诊,因此建立一种针对tau蛋白的高准确度检测方法非常重要。本研究以纯化重组的全长tau蛋白(441)为研究对象,在试验前将tau蛋白分装成100μg/m L,样品存放于-80℃的冰柜中,通过同一批样品来探究准确定量tau蛋白的可靠方法。探究不同标的物对检测结果和检测方法的影响,并验证不同方法的一致性。实验方法和结果如下:以纯化重组的全长有441个氨基酸序列的tau蛋白为研究对象,以酶解得到的稳定特征肽段作为检测目标物,实现了对tau蛋白的定值。对酶解实验中胰蛋白酶的添加量和酶解时间优化后得到酶添加量应与蛋白质比例为1:10,酶解时间应≥48 h。在酶解前引入标记的特征肽段共同参与酶解,检测标记与普通肽段的峰面积比值。计算可得到tau蛋白溶液的准确浓度,并多次实验检测方法和肽段的稳定性。最后实现了对简单基体中tau蛋白的定值,定值结果为75.08±3.00μg/m L。以氨基酸水解法将tau蛋白充分水解成氨基酸,通过对目标氨基酸的检测实现了对tau蛋白的定值分析。在氨基酸水解实验中,分别对温度、盐酸浓度、盐酸加入量和水解时长进行优化,最终选用130℃,加入1.2m L的6 mol/L盐酸水解48小时得到水解样品。水解前加入理论质量比约为1:1的标记氨基酸,实验选了五种氨基酸分别是缬氨酸、脯氨酸、丙氨酸、亮氨酸和苯丙氨酸,水解后在LC-MS质谱仪中分别检测对应氨基酸的普通和加标氨基酸的峰面积比值,带入公式可求得tau蛋白的准确浓度。经过多次实验得到tau蛋白的定值结果为74.47±3.00μg/m L。采用高效液相色谱与高分辨电感耦合等离子体质谱仪联用,将色谱的分离优势与质谱的检测优势结合,通过对tau蛋白中的硫元素的检测定值实现了对tau蛋白的检测定值。实验使用岛津高效液相色谱仪自带的副泵以0.15 m L/min的流速将0.1 ppm的S同位素稀释剂稳定的泵入三通混合管中,与样品所在管路混合后进入高分辨ICP-MS,通过对S和S的信号响应强度的检测得到蛋白质的质谱峰,依据质量流公式计算后可得到待测样品中天然硫的准确浓度,经由硫元素与tau蛋白在质量上的对应关系得到tau蛋白的准确浓度。经过多次实验得到tau蛋白的定值结果为74.13±3.00μg/m L。上述三种实验方法的定值结果较为一致,在多次试验后仍结果稳定,同时证明了方法和样品的稳定性,构成了可用于简单基体中tau蛋白高准确度定量分析的实验方法。

关键词： tau蛋白定量检测特征肽段氨基酸水解硫

tau蛋白、胶质纤维酸性蛋白在创伤性颅脑损伤程度不同患者中的表达及其与患者认知障碍相关性研究

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陕西医学杂志 2023年第4期52卷 452-455页

作者：刘剑陈亮商洛市中心医院急诊医学科陕西商洛726000

目的:分析tau蛋白、胶质纤维酸性蛋白(GFAP)在创伤性颅脑损伤程度不同患者中的表达情况,并分析其与患者认知障碍的关联性,为临床诊疗提供理论依据。方法:研究对象选取就诊治疗的创伤性颅脑损伤(TBI)患者,其中包括轻度组、中度组、重度... 详细信息

目的:分析tau蛋白、胶质纤维酸性蛋白(GFAP)在创伤性颅脑损伤程度不同患者中的表达情况,并分析其与患者认知障碍的关联性,为临床诊疗提供理论依据。方法:研究对象选取就诊治疗的创伤性颅脑损伤(TBI)患者,其中包括轻度组、中度组、重度组患者各58例。比较各组患者不同时期tau、GFAP水平,并采用洛文斯顿认知功能成套评估工具(LOTCA)对不同时期各组患者认知功能进行评估;同时对tau、GFAP水平与各组患者LOTCA评分的相关性进行分析。结果:与轻度组患者相比,中度组及重度组患者不同时期tau、GFAP水平显著升高(均Ptau水平、GFAP水平及LOTCA评分显著升高(均Ptau、GFAP表达水平与患者LOTCA评分呈负相关,差异有统计学意义(均Ptau、GFAP水平随着TBI患者病情严重程度的增加呈升高趋势,同时tau、GFAP表达水平均与轻型、中型及重型TBI患者LOTCA评分呈显著负相关,提示tau、GFAP水平对TBI患者病情评估具有积极意义,对患者tau、GFAP水平进行动态监测,有助于及时对临床治疗进行调整,临床应用价值较高。

关键词： tau蛋白胶质纤维酸性蛋白创伤性颅脑损伤认知障碍洛文斯顿认知功能成套评估相关性

去甲肾上腺素影响tau蛋白聚集物的分子动力学研究——运动干预阿尔茨海默病的机理初探

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去甲肾上腺素影响tau蛋白聚集物的分子动力学研究——运动干预阿...

作者：万嘉倩上海体育学院

学位级别：硕士

研究目的:阿尔茨海默病(Alzheimer’s disease,AD)是一种神经退行性疾病,其多发于65岁以上的老年人。随着人口老龄化程度的不断加深和人均预期寿命的增加,AD的患病人数逐年递增,现已经成为危害老年人健康的第四大病因。tau蛋白聚集物作... 详细信息

研究目的:阿尔茨海默病(Alzheimer’s disease,AD)是一种神经退行性疾病,其多发于65岁以上的老年人。随着人口老龄化程度的不断加深和人均预期寿命的增加,AD的患病人数逐年递增,现已经成为危害老年人健康的第四大病因。tau蛋白聚集物作为AD的病理特征之一,最早出现在大脑蓝斑核(Locus Coeruleus,LC),这也是目前最早可以检测到的病理特征。而AD的药物研发经过了漫长的时间,仍没有有效的治愈药物,因此寻找有效的非药物疗法得到了广泛的关注。运动作为一种促进身体健康的有效方法,许多研究证明:运动能够缓解AD患者的症状,并且可以延缓AD发生的时间,从而起到预防作用。运动对机体的强烈刺激,引起应急激素去甲肾上腺素(Norepinephrine,NE)水平上升,运动可以刺激LC中去甲肾上腺素能神经元分泌NE,并且LC中NE水平的上升可以改善AD小鼠的症状。本研究通过分子动力学模拟研究NE对tau蛋白核心片段的影响,揭示NE破坏AD的致病蛋白tau蛋白聚集物核心片段的微观机理,从而为运动延缓AD潜在的生物学机制提供了理论依据。研究方法:本研究主要采用了全原子分子动力学模拟来探究NE破坏tau蛋白聚集物核心片段的微观机理。本研究主要使用GROMACS程序搭建了单独的tau蛋白体系作为对照组,并在相同结构的tau蛋白体系中加入NE小分子作为实验组,从而观察NE对tau蛋白的影响。在对照组和实验组中,tau蛋白均是在AMBER99SB-ILDN力场下进行全原子分子动力学模拟。在实验组中,结合在小分子专用力场GAFF力场下的NE进行全原子分子动力学模拟。在两个体系中模拟环境均保持一致,且每个体系均进行了两个时间为550ns的独立的模拟。模拟结束后使用VMD软件查看轨迹,使用GROMACS自带的程序、第三方程序以及Origin和SPSS22.0软件进行数据分析。研究结果:(1)NE可以使tau蛋白聚集物的结构稳定性有所降低,与对照组相比,实验组中tau蛋白N-端β2(ptau蛋白整体的构型发生了改变,原本的C形结构趋于J形转变。(2)在实验组tau蛋白中起稳定作用的β-sheet结构出现了减少,且存在显著性差异(ptau蛋白的β4、β6和β8区域。(3)NE通过减弱tau蛋白内部GQV-EVK、KIGSL-LDNI和VQI-LTF三个区域的相互作用,从而对tau蛋白产生了破坏。(4)本研究识别出NE在tau蛋白上的结合位点呈W型的趋势,既两端和中间区域结合为主。并且NE主要与tau蛋白中极性氨基酸Q336、T377,疏水氨基酸G335、V337和芳香族氨基酸F378的主链接触较多,同时会与tau蛋白中极性氨基酸Q336、E338、E342、D348、R349,与带苯环结构的氨基酸Y310、P312、H374、F378的侧链有较多的接触。(5)通过结合模式分析发现,NE与tau蛋白中间区域的E338、E342、D348、D358以及C-端的E372和F378通过氢键结合;与N-端的Y310、P312以及C-端的H374和F378通过芳香相互作用结合,而NE与F378的结合模式尤为特别,既可以通过氢键结合也可以通过芳香相互作用结合。研究结论:(1)tau蛋白的核心结构是双层C型结构,因此其内层与外层也存在较强的相互作用,从而形成了一个较为稳定的结构。NE的加入使tau蛋白的核心结构产生了一定的破坏。(2)NE通过减少tau蛋白中的b-sheet形成的概率,减弱其内部的相互作用,使tau蛋白整体的结构稳定性有所减弱,进而使C形构型趋于J形转变。而其中最显著的变化区域是tau蛋白的N-端和C-端以及中间区域。(3)通过结合位点分析发现,NE与tau蛋白上所有的氨基酸都有不同程度地接触,其主要的结合区域在tau蛋白上呈现W型。NE主要与tau蛋白上极性、疏水和芳香族氨基酸接触较多,该结果表明静电、疏水和芳香相互作用在NE与tau蛋白的结合中起着重要的作用。(4)NE主要通过氢键与tau蛋白中间区域以及C-端的F378结合,并且通过π-π堆积与N-端的和C-端带苯环的氨基酸与tau蛋白结合。而NE与F378之间通过较强的氢键和芳香相互作用共同推动两者之间的结合,在破坏tau蛋白N-端以及N-端和C-端之间的相互作用中起着至关重要的作用。

关键词： tau蛋白去甲肾上腺素运动破坏机理

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tau蛋白寡聚体与阿尔茨海默病

中国生物化学与分子生物学报 2019年第5期35卷 493-498页

作者：姚炫豹谭秋龙肖时锋深圳大学生命与海洋科学学院深圳市海洋生物资源与生态环境重点实验室广东深圳518000

阿尔茨海默病(AD)是严重影响老年人健康的一种神经退行性疾病。AD主要两个病理特征是tau蛋白组成的神经原纤维缠结和β淀粉样蛋白组成的Aβ斑块。tau蛋白是目前研究AD机制和防治药物的一个重要靶点。tau蛋白的寡聚体形式被认为是最具神... 详细信息

阿尔茨海默病(AD)是严重影响老年人健康的一种神经退行性疾病。AD主要两个病理特征是tau蛋白组成的神经原纤维缠结和β淀粉样蛋白组成的Aβ斑块。tau蛋白是目前研究AD机制和防治药物的一个重要靶点。tau蛋白的寡聚体形式被认为是最具神经毒性的,并且其能在神经元之间传播,诱导胞内的正常tau蛋白聚集。本综述结合近年来的文献报道,对tau寡聚体的制备手段、形成机理、神经毒性、传播机制以及治疗前景等方面做了系统总结和讨论,为人们深入认识tau寡聚体提供参考。

关键词：阿尔茨海默病 tau蛋白寡聚体神经毒性传播

tau蛋白正电子发射断层显像在阿尔茨海默病及其他神经退行性疾病中的研究进展

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中国临床神经科学 2023年第6期31卷 695-701页

作者：吴婕肖朕旭马小茜丁玎赵倩华复旦大学附属华山医院神经内科上海200040 复旦大学神经病学研究所上海200040 国家老年疾病临床医学研究中心上海200040 复旦大学脑科学前沿中心上海200040

异常磷酸化的tau蛋白组成神经原纤维缠结(NFT)和β淀粉样蛋白(Aβ)聚集形成老年斑是阿尔茨海默病(AD)的主要病理改变。NFT负荷与神经元丢失、脑萎缩以及认知状况相关。正电子发射断层显像(PET)能客观显示活体脑内NFT的沉积量以及分布情... 详细信息

异常磷酸化的tau蛋白组成神经原纤维缠结(NFT)和β淀粉样蛋白(Aβ)聚集形成老年斑是阿尔茨海默病(AD)的主要病理改变。NFT负荷与神经元丢失、脑萎缩以及认知状况相关。正电子发射断层显像(PET)能客观显示活体脑内NFT的沉积量以及分布情况,在AD的诊断和病情评估方面具有重要参考价值。文中总结tau蛋白示踪剂的开发情况及其在AD和其他神经退行性疾病中的研究进展。

关键词：阿尔茨海默病 tau蛋白 tau蛋白示踪剂正电子发射断层显像

tau蛋白聚集体促进小胶质细胞活化的机制研究

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卒中与神经疾病 2023年第5期30卷 429-432,439页

作者：郭笑迪张国新彭琴玉张振涛武汉大学人民医院神经内科 430060

目的探讨tau蛋白聚集体对小胶质细胞活化的影响及机制。方法纯化重组的tau蛋白并制备tau聚集体,处理小鼠小胶质细胞(BV2 microglia of mice,BV2),Western blot检测半乳糖凝集素(Galectin,Gal)-9的表达水平,酶联免疫吸附测定(Enzyme link... 详细信息

目的探讨tau蛋白聚集体对小胶质细胞活化的影响及机制。方法纯化重组的tau蛋白并制备tau聚集体,处理小鼠小胶质细胞(BV2 microglia of mice,BV2),Western blot检测半乳糖凝集素(Galectin,Gal)-9的表达水平,酶联免疫吸附测定(Enzyme linked immunosorbent assay,ELISA)法检测细胞培养基中Gal-9蛋白的水平;体外表达纯化Gal-9蛋白,处理BV2,Western blot检测细胞中白细胞分化抗原68(Cluster of differentiation 68,CD68)和电离钙结合适配器分子1(Lonized calcium-binding adapter molecule 1,IBA1)蛋白的表达水平;免疫荧光检测CD68的表达水平;ELISA检测细胞培养基中炎症因子肿瘤坏死因子-α(Tumor necrosis factor-α,TNF-α)的水平,逆转录-聚合酶链反应(Reverse transcription-Polymerase chain reaction,RT-PCR)检测细胞中TNF-α的转录水平;tau蛋白聚集体与短发夹RNA(Short hairpin RNA,ShRNA)-Gal-9同时处理BV2,观察阻断Gal-9的作用对小胶质细胞活化的影响。结果与对照组比较,tau蛋白聚集体处理BV2引起Gal-9蛋白表达增加,并释放到细胞外;Gal-9蛋白处理BV2导致其活化,CD68和IBA1表达增加;促炎性细胞因子TNF-α表达增加;阻断Gal-9的作用可减轻tau聚集体诱导的小胶质细胞活化。结论tau聚集体促进BV2表达Gal-9蛋白,后者诱导小胶质细胞激活和促炎性细胞因子释放。

关键词：半乳糖凝集素-9 tau蛋白小胶质细胞炎症因子

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tau蛋白与分子伴侣的相互作用

生命的化学 2022年第7期42卷 1241-1247页

作者：吕淑婷邓云松肖时锋深圳大学生命与海洋科学学院深圳518060

作为老年人中最常见的一种神经退行性疾病,阿尔茨海默病(Alzheimer’s disease,AD)发病机制一直未明确,多种因素共同作用导致该病的发生和发展。AD患者脑内的一大关键病理特征是异常磷酸化的tau蛋白错误折叠、聚集形成的神经纤维缠结。... 详细信息

作为老年人中最常见的一种神经退行性疾病,阿尔茨海默病(Alzheimer’s disease,AD)发病机制一直未明确,多种因素共同作用导致该病的发生和发展。AD患者脑内的一大关键病理特征是异常磷酸化的tau蛋白错误折叠、聚集形成的神经纤维缠结。作为调节蛋白质构象的重要分子,分子伴侣可以与tau蛋白发生相互作用,对tau蛋白的聚集产生一定的影响。本文主要介绍了4种与tau蛋白相互作用的分子伴侣,包括HSP70、HSP90、HSP40和sHSP,并从结构生物学角度详细描述了它们互作的分子机制。本文进一步展望了以HSP或其相关分子为靶标的AD药物的研发前景,为AD的防治研究提供新思路。

关键词：阿尔茨海默病 tau蛋白聚集分子伴侣相互作用

tau蛋白正电子核素探针[^(18)F]MK-6240标记前体的合成

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华西药学杂志 2022年第3期37卷 229-232页

作者：蔡玥潘立立吴小艾四川大学华西医院科技部四川成都610041 四川大学华西医院核医学科四川成都610041

目的探索tau蛋白正电子核素探针[^(18)F]MK-6240标记前体的合成工艺。方法以3-氯异喹啉为起始原料,通过硝化、还原、缩合、硝化、亲核取代、水解等反应路径,成功制备了[^(18) F]MK-6240标记前体,结构用氢谱和质谱鉴定。结果以7步直线式... 详细信息

目的探索tau蛋白正电子核素探针[^(18)F]MK-6240标记前体的合成工艺。方法以3-氯异喹啉为起始原料,通过硝化、还原、缩合、硝化、亲核取代、水解等反应路径,成功制备了[^(18) F]MK-6240标记前体,结构用氢谱和质谱鉴定。结果以7步直线式合成反应,约6.4%的总收率制备了[^(18) F]MK-6240标记前体。结论所用方法原料便宜易得,且合成步骤简单,大大提高了收率,适合[^(18)F]MK-6240标记前体的实验室制备。

关键词：神经退行性疾病神经纤维缠结探针正电子发射断层显像 tau蛋白 MK-6240 放射性标记前体合成核磁共振阿尔茨海默病

2,6-二异丙基苯酚逆转嗅球切除抑郁模型大鼠电休克后的tau蛋白过度磷酸化和认知障碍

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生物化学与生物物理进展 2012年第9期39卷 893-909页

作者：刘超闵苏魏柯刘东董军罗洁刘小滨重庆医科大学附属第一医院麻醉科重庆400016 天津医科大学第二医院神经外科天津300211

通过观察2,6-二异丙基苯酚对电休克后嗅球切除抑郁模型大鼠学习记忆和tau蛋白过度磷酸化的影响,探讨兴奋性氨基酸受体拮抗剂对tau蛋白过度磷酸化的调节及两者对抑郁大鼠学习记忆的影响,为改善学习记忆障碍的神经心理学机制研究和临床干... 详细信息

通过观察2,6-二异丙基苯酚对电休克后嗅球切除抑郁模型大鼠学习记忆和tau蛋白过度磷酸化的影响,探讨兴奋性氨基酸受体拮抗剂对tau蛋白过度磷酸化的调节及两者对抑郁大鼠学习记忆的影响,为改善学习记忆障碍的神经心理学机制研究和临床干预性治疗提供实验依据.按随机单位组2×2析因设计设置2个干预因素,即电休克干预(两水平:无处置、施行一个疗程电休克)和2,6-二异丙基苯酚干预(两水平:腹腔注射5 ml生理盐水或5 ml 2,6-二异丙基苯酚100 mg/kg)的所有组合.选24周龄健康雄性Sprague-Dawley大鼠建立嗅球切除抑郁模型,将32只24周龄模型大鼠随机分为4个实验组(n=8):Ⅰ组(腹腔注射5 ml 2,6-二异丙基苯酚100 mg/kg)、Ⅱ组(腹腔注射5 ml 2,6-二异丙基苯酚100 mg/kg+施行电休克1个疗程)、Ⅲ组(腹腔注射5 ml生理盐水)、Ⅳ组(腹腔注射5 ml生理盐水+施行电休克1个疗程).全部电休克处置结束24 h内开始Morris水迷宫检测,之后留取海马组织.高效液相色谱法检测神经递质谷氨酸(Glu)在海马组织中的含量;免疫组化SP法和蛋白质印迹法检测tau-5(总tau蛋白)、p-PHF1Ser396/404、p-AT8Ser199/202、p-12E8Ser262、GSK-3β1H8和PP-2A在海马组织神经元中的表达.电休克和2,6-二异丙基苯酚均可造成大鼠学习记忆障碍,即延长逃避潜伏期并缩短空间探索时间,两者的影响呈相减效果.电休克可明显增加海马中神经递质谷氨酸(Glu)的浓度,2,6-二异丙基苯酚可降低海马中神经递质Glu的浓度,且两者有相减效果.电休克和2,6-二异丙基苯酚对海马总tau蛋白和PP-2A蛋白的表达无明显影响.电休克可增加海马中磷酸化tau蛋白和GSK-3β1H8蛋白的表达;2,6-二异丙基苯酚可减少海马中磷酸化tau蛋白和GSK-3β1H8蛋白的表达;两者的影响均呈相减效果.实验结果表明,电休克导致海马Glu浓度升高,通过上调GSK-3β1H8增加海马tau蛋白的磷酸化程度导致学习记忆功能障碍,而2,6-二异丙基苯酚则可通过降低海马Glu浓度下调GSK-3β1H8的表达,从而减缓tau蛋白的磷酸化程度以改善ECT后的学习记忆.

关键词： 2,6-二异丙基苯酚电休克学习记忆能力 tau蛋白过度磷酸化糖原合成酶激酶-3β