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Cloning and Analysis of tasa Gene in Bacillus subtilis HAS

Agricultural Biotechnology 2017年第2期6卷 48-50,54页

作者： Guoruo XIONG Gengfeng ZHAO Wenwei CAI Suran WU Benpeng YANG Shuzhen ZHANG Institute of Tropical Biotechnology/Sugarcane Research Center Chinese Academy of Tropical Agricultural Sciences Department of Biochemistry Hainan Medical College

In order to clarify the mechanism for the inhibitory action of the Bacillus subtilis strain HAS on Sporisorium scitamineum （ Syd. ）, which can cause sugarcane smut, the full-length tasa gene which encodes a protein with broad-spectrum antimicrobial activity, was PCR-amplified from HAS, and cloned into pMD18-T vector. Sequence analysis indicated that the full-length tasa cloned from HAS consisted of 786 nucleotides, and shared 99% homology in nucleotide sequence with the tasa gene sequence published in Genbank （AJ871386.1）. It was predicted that the molecular weight of tasa protein was about 28 kD. Base transitions or transversions ~curred at positions 104, 164, 169,250, 399,623 and 627, at the 2nd, 2nd, 3rd , 1st , 3rd, 2nd and 3rd bases of tasa codons. The mutations in the seven bases may cause the missense mutations of the polypeptide chain. Compared with the amino acid sequences of the tasa protein encoded by Bacillus aubtilis subsp, subtilis str. 168, mutations in two amino acids at positions 150 and 209 of the protein encoded by the cloned tasa gene were found, and as a result, an ala- nine was replaced with a threonine.

关键词： Bacillus subtilis HAS mad a glutamic acid was replaced with an asparagine. Sporisorium scitamineum ( Syd. ) Antimicrobial protein tasa

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杨树内生细菌的分子鉴定及tasa基因的克隆与表达

杨树内生细菌的分子鉴定及TasA基因的克隆与表达

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作者：徐亮山东农业大学

学位级别：硕士

溃疡病是杨树枝干上的重大病害,是国内外林木上的重大生物灾害,基于内生细菌发展生物制剂来控制杨树溃疡病较传统的化学防治更有前途;而物种的最终鉴定也是至关重要的,因为生物防治以及植物自身促生物质包括抗细菌、抗真菌的多肽类,胞... 详细信息

溃疡病是杨树枝干上的重大病害,是国内外林木上的重大生物灾害,基于内生细菌发展生物制剂来控制杨树溃疡病较传统的化学防治更有前途;而物种的最终鉴定也是至关重要的,因为生物防治以及植物自身促生物质包括抗细菌、抗真菌的多肽类,胞外植酸酶、几丁质酶的合成都具是菌株特异性。本研究所采用的分子鉴定手段有利于杨树内生细菌近缘种的鉴定;同时利用生物信息学方法研究了解淀粉芽孢杆菌tasa基因的特性,原核表达出tasa融合蛋白。本研究包括以下三部分:(1)杨树内生细菌的分子鉴定对从杨树水泡溃疡病斑处分离筛选得到的15株杨树内生细菌进行了16S rRNA测序,经序列比对鉴定其分别属于巨大芽孢杆菌(Bacillus megaterium)、解淀粉芽孢杆菌(Bacillus amyloliquefaciens)、枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)以及蜡状芽孢杆菌(Bacillus cereus)。结合Genbank中其它芽孢杆菌16S rRNA的序列分析发现,16S rRNA对区别和鉴定亲缘距离较远的杨树内生芽孢杆菌是简便和正确的,但对于亲缘关系较近的物种却存在一定不足;而芽孢杆菌16S rRNA在核酸115-485存在高变区,202、285、465、472、483五个位点的碱基多态性,有益于杨树内生细菌的分子鉴定,对芽孢杆菌属细菌的分子鉴定也是一个有益补充。而基于多态位点选取的Fnu4H I、Rsa I、Taq I 3种内切酶中的任何一种的酶切图谱可同时鉴定B. megaterium、B. amyloliquefaciens、B. subtilis以及B. cereus。tasa及其类似基因序列比对发现,B. amyloliquefaciens同B. subtilis核酸序列的同源性为74%,氨基酸序列的同源性也仅为80%左右,说明tasa序列分析可以作为芽孢杆菌分类鉴定的一种辅助手段。(2)解淀粉芽孢杆菌PEBA20 tasa功能基因的序列分析tasa基因ORF全长786bp,共编码了261个氨基酸,分子量为28.123KD,等电点为6.82;该基因在GenBank中注册的登记号为FJ718530。解淀粉芽孢杆菌PEBA20 tasa蛋白的信号肽区位于分泌蛋白tasa的N端,由27个氨基酸组成。通过氨基酸组成分析可发现:一些疏水氨基酸所占比例较大,连续几个疏水氨基酸在信号肽区组成了疏水核心。tasa蛋白的跨膜区域也集中在氨基酸序列3-30,长度为28aa。而在整个二级结构中,有54个氨基酸残基为ɑ-螺旋,占20.6%;有63个氨基酸残基为?-折叠股,占24.0%;有145个氨基酸残基为无规则卷曲,占55.3%。(3)tasa融合蛋白原核表达成功构建了的重组表达质粒pEASY-E1/tasa,并转入表达菌株BL21,利用IPTG诱导,融合蛋白得到正确表达,且25℃较37℃更有利于诱导重组蛋白的表达。

关键词：杨树内生细菌分子鉴定解淀粉芽孢杆菌原核表达 tasa

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解淀粉芽孢杆菌JK-JS8生物膜形成对其抗松枯梢病的影响

解淀粉芽孢杆菌JK-JS8生物膜形成对其抗松枯梢病的影响

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作者：汤雨葳南京林业大学

学位级别：硕士

生防细菌可以通过抑制植物病原菌的生长、诱导植物的系统抗性以及与植物病原菌争夺生态位来发挥其生物防治功能。生物膜是生防细菌占据生态位的重要存在形式,能够帮助其抵御不良环境,同时筑起一道防止植物病原微生物入侵的“围墙”。阐... 详细信息

生防细菌可以通过抑制植物病原菌的生长、诱导植物的系统抗性以及与植物病原菌争夺生态位来发挥其生物防治功能。生物膜是生防细菌占据生态位的重要存在形式,能够帮助其抵御不良环境,同时筑起一道防止植物病原微生物入侵的“围墙”。阐明生防细菌生物膜在拮抗病原微生物中的作用是探究其生防机制的重要方面。前期研究发现解淀粉芽孢杆菌(Bacillus amyloliquefaciens)JK-JS8对引起松枯梢病的松球壳孢菌(Sphaeropsis sapinea)具有一定的拮抗作用,且该菌株经过发酵培养后能够产生明显的生物膜结构。但生物膜的形成在菌株JK-JS8拮抗病原菌过程中是否发挥了作用尚未可知。为此,本研究通过Zn胁迫使JK-JS8生物膜形成受到抑制,探究了生物膜消失状态下JK-JS8拮抗松球壳孢菌的能力,并通过多个方面解释了JK-JS8菌株拮抗能力降低与生物膜形成之间的关系。同时,为了能使JK-JS8菌株在林间更好地发挥生防功能,探究了不同培养基和环境条件对该菌株生物膜形成的影响。主要研究结果如下:1.解淀粉芽孢杆菌JK-JS8在不同培养基中形成生物膜的能力不同,筛选出酵母浸出粉胨蔗糖培养基(Yeast Extract Sucrose Peptone Medium,YSP培养基)培养下的生物膜形成状况最优。环境条件对JK-JS8菌株的生物膜形成影响较大,30℃下静置48 h是JK-JS8形成生物膜的最佳条件;过酸性或过碱性的环境都不适宜生物膜的生成,中性条件下(p H=7)最适合该菌株生物膜的形成;除Cu外其余四种金属离子均对JK-JS8的生物膜形成有不同程度的抑制作用,其中Zn和Mn对生物膜的抑制效果最强,Mg和K的抑制效果较弱。2.利用ZnCl抑制JK-JS8生物膜的形成,检测了生物膜缺失状态下JK-JS8拮抗松球壳孢菌的能力,并通过高效液相色谱-质谱联用(HPLC-MS)对生物膜缺失前后脂肽类物质的变化进行了鉴定,表明Zn胁迫导致生物膜消失后,抑菌脂肽Bacillomycin D产量降低,通过平板拮抗试验验证了Bacillomycin D是拮抗松枯梢病菌的主要抑菌物质之一。3.通过RT-qPCR对ZnCl处理后的JK-JS8生物膜相关基因转录水平进行检测,结果表明胞外多糖相关基因eps A和信号肽酶合成基因sip W的转录水平未出现明显差异、淀粉样蛋白相关基因tas A、表面活性素合成相关基因srf AA、生物膜形成关键调控基因spo0A和Bacillomycin D合成关键基因bam D基因均有不同程度的下调。通过构建spo0A缺失突变株,表明spo0A基因的缺失会影响JK-JS8生物膜形成和Bacillomycin D合成,降低其拮抗松枯梢病病菌的能力。外源添加Bacillomycin D没有使生物膜性状恢复。由此推测Zn胁迫导致JK-JS8拮抗能力降低的原因可能是Zn胁迫下生物膜形成关键调控基因spo0A的转录水平下调,抑制生物膜形成的同时影响了抑菌脂肽Bacillomycin D的合成。4.运用生物信息技术和原核表达系统对JK-JS8生物膜组成蛋白Tas A进行功能分析,结果表明Tas A蛋白对松枯梢病病菌有一定的抑菌活性,表现为接触性抑制。进一步说明生物膜形成在JK-JS8拮抗病原菌的过程中起着重要的作用。

关键词：解淀粉芽孢杆菌生物膜拮抗作用 Bacillomycin D tasa

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苦豆子总碱治疗葡聚糖硫酸钠致急性期溃疡性结肠炎小鼠作用机制研究

苦豆子总碱治疗葡聚糖硫酸钠致急性期溃疡性结肠炎小鼠作用机制研...

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作者：王晓娟南方医科大学

学位级别：硕士

溃疡性结肠炎(ulcerative colitis, UC)是一种病因未明的非特异性肠道炎症性病变,以腹泻、腹痛、里急后重和粘液脓血便等为主要症状。世界范围内,UC的发病率波动在0.5-24.5/105,近年来我国的发病率已达到11.6/105,并逐年上升。UC病理变... 详细信息

溃疡性结肠炎(ulcerative colitis, UC)是一种病因未明的非特异性肠道炎症性病变,以腹泻、腹痛、里急后重和粘液脓血便等为主要症状。世界范围内,UC的发病率波动在0.5-24.5/105,近年来我国的发病率已达到11.6/105,并逐年上升。UC病理变化很复杂,按其发生、发展过程及内镜下表现,分为急性期和慢性期。UC急性期(活动期)发作,若得到控制,其症状缓解并治愈,若失治误治,炎症反复发作,则转变成慢性,其中有5-10%的UC患者易发生癌变,而病程在25年以上者癌变率高达40%。因此,急性期UC的治疗对于防止其慢性化及癌变有重要意义,但临床上至今没有特异性根治措施。所以UC已被世界卫生组织列为现代难治病之一。中药苦豆子(Sophora alopecuroides, L)为豆科槐属植物,民间广泛用于治疗肠炎腹泻。本课题组前期研究发现苦豆子总生物碱(total alkaloids of Sophora alopecuroides, tasa)是苦豆子治疗UC的主要活性部位(已取得国家专利“苦豆子总生物碱在制备治疗UC药物中的应用及结肠靶向制剂的制备方法”(ZL200410052029.0),拥有自主知识产权)。初步临床研究表明tasa治疗UC的总有效率达67.2%。动物实验发现,tasa能显著改善三硝基苯磺酸(TNBS)和葡聚糖硫酸钠(DSS)致慢性UC的模型动物便血等一般体征,抑制体重下降,缓解结肠粘膜炎症;能够使免疫抑制小鼠体重增加,胸腺指数、脾脏指数增加;初步研究其作用机制可能通过调节炎症因子CD4+CD25+、CD8+CD28-Tregs比例、IL-10、ICAM-1、MIF、TFF3等实现。但前期研究主要局限在慢性UC上,对急性或慢性急性发作的活动性UC未进行深入研究。目前,肠粘膜免疫功能紊乱介导的促炎细胞因子与抗炎细胞因子之间的平衡失调在UC中的作用日益受到重视。肠粘膜免疫功能异常,肠粘膜发生炎症,肠粘膜固有层单个核细胞(LPMC)异常激活,产生大量炎性细胞因子(如IL-1β、IL-6、TNF-α等),而抗炎细胞因子(如IL-4、IL-10)等表达减少,细胞因子网络失衡,炎症持续发展。细胞因子进一步激活炎症细胞内的炎症信号分子(如NF-κB和STAT等),启动并调节炎症因子的表达。IL-6/JAK/STAT是近年来研究比较多的一条信号通路,它与多种细胞因子、生长因子的信号转导有关,可以调控人体炎症反应、免疫反应以及细胞的生长、分化等。已有研究表明UC患者肠黏膜STAT3表达增加且活化增强,但其具体作用机制未明。目的：探讨tasa对葡聚糖硫酸钠(dextran Sulfate sodium, DSS)诱导的小鼠急性期UC的治疗作用及其对细胞因子IL-1β、IL-4和IL-6的影响,检测UC小鼠肠黏膜STAT3的表达和活化水平,同时检测IL-6的表达,探讨IL-6/STAT3信号通路在UC发病中的调节机制及tasa对该通路的影响。方法：60只C57BL/6小鼠随机分为正常组(Control),模型组(DSS),柳氮磺嘧啶(SASP:520mg·kg-1), tasa高、中、低剂量组(TAH、TAM、TAL: 80、40、20mg·kg-1)。Control组饮用蒸馏水。DSS组和治疗组自由饮用5%DSS7d以产生急性期UC模型,造模同时治疗组灌服相应药物。Control组和DSS组灌服等体积生理盐水。每日观察小鼠进食、饮水、活动、毛色等一般情况,称量体重,观察粪便性状、大便隐血及便血情况,进行疾病活动指数评分(DAI),观察小鼠结肠粘膜的大体形态和组织病理学变化,行组织学评分;通过酶联免疫吸附法(ELISA)观察tasa对急性期UC小鼠血清细胞因子IL-1β、IL-4和IL-6表达的影响;用免疫组织化学法和Western blotting法检测各组结肠粘膜IL-6、STAT3和p-STAT3蛋白的定位分布及表达。结果：1. Control组小鼠毛色光泽,活动自如,反应灵敏,饮食正常,体重增加。DSS组小鼠饮用DSS2天后开始出现黏液稀便,第4、5天逐渐加重,隐血实验阳性,第5-7天均出现不同程度的肉眼血便,1周左右可见脓血便、体重减轻、毛发无光泽、饮食明显减少、懒动、嗜卧扎堆等。各给药组小鼠毛色、精神及活动度较DSS组健康,体重未见显著减少,其腹泻、便血等症状有不同程度的减轻。给药7天后各组DAI评分比较有显著的统计学差异(F=37.210;P=0.000),DSS组小鼠DAI与Control组相比有显著性差异(P=0.000), TAH、TAM、TAL组和SASP组与DSS组相比具有显著地统计学差异(P值均为0.000),但SASP组与TAH、

关键词：溃疡性结肠炎 tasa DSS IL-1β IL-4 IL-6 STAT3 p-STAT3

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前列腺-Ⅱ直肠栓的制备及质量控制

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西北药学杂志 2002年第3期17卷 121-123页

作者：任棣常威兰州医学院第一附属医院甘肃兰州730000

目的　研制前列腺 - 直肠栓并建立制剂的含量测定方法。方法　以苦豆子总生物碱 (Total Alkaloid ofSophora alopecuroides,tasa)为主药 ,并采用酸性染料分光光度法测定 tasa的含量。结果　tasa的线性范围为 0 .1 4～ 1 5 .4mg· L-1,... 详细信息

目的　研制前列腺 - 直肠栓并建立制剂的含量测定方法。方法　以苦豆子总生物碱 (Total Alkaloid ofSophora alopecuroides,tasa)为主药 ,并采用酸性染料分光光度法测定 tasa的含量。结果　tasa的线性范围为 0 .1 4～ 1 5 .4mg· L-1,RSD≤ 2 .5 % ,氧化苦参碱对照品的加样回收率为 1 0 0 .7%～ 1 0 1 .8%。

关键词：前列腺-Ⅱ直肠栓 tasa 制备质量控制酸性染料分光光度法

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前列腺-Ⅰ直肠栓的制备、质量控制及临床应用

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中国药师 2003年第1期6卷 29-31页

作者：任棣常威白进良兰州医学院第一附属医院甘肃兰州730000

目的 :研制治疗慢性前列腺炎的直肠栓并进行临床疗效观察。方法 :以苦豆子总生物碱 (TotalAlkaloidofSophoraalopecuroides ,tasa)和双氯芬酸为主药 ,研制前列腺 Ⅰ直肠栓 ;测定tasa和双氯芬酸的含量 ;做直肠刺激性试验 ;并以前列安栓... 详细信息

目的 :研制治疗慢性前列腺炎的直肠栓并进行临床疗效观察。方法 :以苦豆子总生物碱 (TotalAlkaloidofSophoraalopecuroides ,tasa)和双氯芬酸为主药 ,研制前列腺 Ⅰ直肠栓 ;测定tasa和双氯芬酸的含量 ;做直肠刺激性试验 ;并以前列安栓作对照 ,进行临床疗效观察。结果 :tasa的线性范围为 1.4～ 15 .4 μg·ml-1;加样回收率为 10 1.2 % ,RSD =0 .6 % ;双氯芬酸的线性范围为 4～ 14 μg·ml-1,平均回收率为 10 0 .0 % ,RSD =1.0 %。直肠刺激性试验证明 ,该制剂对直肠无刺激性。临床疗效观察与前列安栓具有同样显著的疗效 ,有效率 93.8% (P >0 .0 5 )。结论 :该制剂疗效可靠 ,质量可控 ,无不良反应 ,有临床应用价值。

关键词：前列腺-I直肠栓 tasa 双氯芬酸前列腺炎慢性疗效观察

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