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高效严谨型大肠杆菌targetron基因打靶系统的构建

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生物技术通报 2019年第6期35卷 213-220页

作者：陈相好谷俊莹崔古贞刘芳王彩霞陈峥宏洪伟蔡梦迪张峥嵘綦廷娜廖永慧贵州医科大学医学检验学院贵州医科大学基础医学院贵州省普通高等学校病原生物学特色重点实验室贵州医科大学分子生物学重点实验室贵州医科大学附属医院

构建高效严谨型大肠杆菌targetron 基因打靶系统。将来源于pET28a 的T7-lac 操纵子与来源于pSY6 的II 型内含子组装构建大肠杆菌IPTG 诱导型targetron 质粒系统。以lacZ 基因为例,选择lacZ-635s 和lacZ-1063a 两个位点为靶位点,利用构建... 详细信息

构建高效严谨型大肠杆菌targetron 基因打靶系统。将来源于pET28a 的T7-lac 操纵子与来源于pSY6 的II 型内含子组装构建大肠杆菌IPTG 诱导型targetron 质粒系统。以lacZ 基因为例,选择lacZ-635s 和lacZ-1063a 两个位点为靶位点,利用构建的IPTG 诱导型targetron 系统进行基因打靶,通过分析诱导前和诱导后II 型内含子在靶位点的插入效率,验证大肠杆菌IPTG 诱导型targetron 系统严谨性和打靶效率。最后,通过优化诱导剂浓度及诱导时间,建立高效严谨的诱导型大肠杆菌targetron 基因打靶系统。在没有IPTG 诱导时,II 型内含子在两个位点均不能插入,打靶效率均为0;当加入0.5 mmol/L IPTG 诱导45 min 时,其在lacZ-635s 位点的打靶效率提高到90.8±5.5%,在lacZ-1063a 位点的打靶效率提高到92.6±2.4%。成功建立高效严谨型大肠杆菌targetron 基因打靶系统,旨为II 型内含子的机理研究及应用奠定基础。

关键词： targetron II 型内含子诱导系统大肠杆菌 lacZ

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Ⅱ型内含子及其生物技术应用研究进展

生物工程学报 2022年第3期38卷 915-924页

作者：崔古贞花登雄谷俊莹陈峥宏贵州医科大学基础医学院微生物学教研室贵州贵阳550025 贵州医科大学医学检验学院贵州贵阳550004 贵州医科大学基础医学院病原生物学重点实验室贵州贵阳550025

型内含子(groupⅡintrons)是一类具有自我剪接功能的核酶,能够通过“归巢”(retrohoming)机制高频插入到DNA靶位点。Ⅱ型内含子对DNA靶位点的识别和剪接具有高度专一性和高效性,这种特性使其在基因工程中具有重要的应用价值。文中首先... 详细信息

型内含子(groupⅡintrons)是一类具有自我剪接功能的核酶,能够通过“归巢”(retrohoming)机制高频插入到DNA靶位点。Ⅱ型内含子对DNA靶位点的识别和剪接具有高度专一性和高效性,这种特性使其在基因工程中具有重要的应用价值。文中首先综述了Ⅱ型内含子基因打靶原理及其在微生物遗传改造中的应用;然后,根据Ⅱ型内含子“归巢”特点及其依赖高浓度Mg2+的特性,分析了Ⅱ型内含子在多功能基因编辑及真核生物应用中的局限性;最后,以笔者课题组研究工作为基础,结合Ⅱ型内含子自身结构特点,分析了Ⅱ型内含子在新型基因编辑工具开发方面的潜能,为Ⅱ型内含子生物技术应用提供借鉴。

关键词： Ⅱ型内含子 targetron 基因编辑生物技术应用

脱水四环素诱导的大肠杆菌targetron基因打靶系统构建

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现代预防医学 2021年第16期48卷 3005-3010页

作者：崔古贞花登雄陈相好陈峥宏管玉祝谷俊莹贵州医科大学基础医学院微生物学教研室贵州医科大学医学检验学院遵义市第一人民医院(遵义医科大学第三附属医院)

目的在大肠杆菌中构建脱水四环素诱导的targetron基因打靶系统,为微生物遗传改造提供可控的新型targetron基因打靶工具。方法首先,分析大肠杆菌对脱水四环素的敏感性,筛选合适的诱导剂浓度。其次,以绿色荧光蛋白为报告基因,构建脱水四... 详细信息

目的在大肠杆菌中构建脱水四环素诱导的targetron基因打靶系统,为微生物遗传改造提供可控的新型targetron基因打靶工具。方法首先,分析大肠杆菌对脱水四环素的敏感性,筛选合适的诱导剂浓度。其次,以绿色荧光蛋白为报告基因,构建脱水四环素诱导的荧光蛋白报告系统,检测其诱导效果。然后,将上述验证的脱水四环素诱导系统与Ⅱ型内含子打靶元件组合,构建脱水四环素诱导型targetron系统。最后,以大肠杆菌pyrF79a、lacZ1063a和lacZ635s三个基因位点为例,分析其在大肠杆菌中的打靶效率。结果脱水四环素诱导系统能够在大肠杆菌中诱导targetron元件表达,使用0.2μg/ml脱水四环素诱导3 h该诱导型targetron系统在pyrF79a、lacZ1063a和lacZ635s三个位点的打靶效率分别为(31.9%±5.2%)、(56.3%±10.8%)和(8.2%±3.6%)。结论在大肠杆菌中成功构建脱水四环素诱导的targetron基因打靶系统,为微生物基因工程改造提供了良好的遗传工具。

关键词：大肠杆菌脱水四环素诱导系统 EGFP targetron Ⅱ型内含子

L1.LtrB内含子编码蛋白反转录结构域关键催化位点分析及功能验证

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微生物学报 2019年第12期59卷 2357-2366页

作者：陈相好张峥嵘刘芳陈峥宏洪伟綦廷娜谷俊莹崔古贞贵州医科大学基础医学院贵州贵阳550025 贵州医科大学医学检验学院贵州贵阳550004 贵州省普通高等学校病原生物学特色重点实验室贵州贵阳550025 贵州医科大学分子生物学重点实验室贵州贵阳550004 贵州医科大学附属医院贵州贵阳550004

【目的】筛选影响Ll.LtrB内含子编码蛋白(Intron encoded protein,IEP)反转录功能的关键催化位点,并获得无反转录活性的IEP突变体。【方法】首先,利用NCBI数据库,通过序列比对及同源建模方法筛选影响IEP反转录功能的关键氨基酸催化位点... 详细信息

【目的】筛选影响Ll.LtrB内含子编码蛋白(Intron encoded protein,IEP)反转录功能的关键催化位点,并获得无反转录活性的IEP突变体。【方法】首先,利用NCBI数据库,通过序列比对及同源建模方法筛选影响IEP反转录功能的关键氨基酸催化位点;然后,对筛选获得的关键催化位点进行定点突变,同时以targetron载体为模板,构建无反转录功能的突变型targetron打靶系统;最后,以大肠杆菌lacZ基因为例,体内验证IEP突变体的功能及其对Ⅱ型内含子"归巢"效率的影响。【结果】筛选到C164和G214两个位点是影响内含子编码蛋白反转录功能的关键氨基酸残基,并获得C164K和G214W两个突变体。体内功能分析表明,此两个位点突变完全失活了Ⅱ型内含子的"归巢"功能。【结论】筛选并获得了失活反转录功能的Ll.LtrB内含子编码蛋白突变体,为深入研究Ⅱ型内含子的结构和"归巢"机理奠定了基础。

关键词： Ll.LtrB Ⅱ型内含子内含子编码蛋白反转录 targetron

内含子编码蛋白Mg2+结合位点功能分析及验证

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生物技术通报 2020年第10期36卷 165-172页

作者：崔古贞陈相好洪伟张峥嵘綦廷娜陈峥宏贵州医科大学基础医学院贵阳550025 遵义医科大学第三附属医院(遵义市第一人民医院) 遵义563002 贵州省普通高等学校病原生物学特色重点实验室贵阳550025 贵州省分子生物学重点实验室贵阳550004

旨为筛选并构建II型内含子编码蛋白Mg2+结合位点突变体,验证该位点突变对II型内含子“归巢”效率的影响。利用生物信息学技术筛选关键位点,利用定点突变技术构建突变体,利用targetron及蓝白斑计数法验证其“归巢”效率。结果显示,筛选到... 详细信息

旨为筛选并构建II型内含子编码蛋白Mg2+结合位点突变体,验证该位点突变对II型内含子“归巢”效率的影响。利用生物信息学技术筛选关键位点,利用定点突变技术构建突变体,利用targetron及蓝白斑计数法验证其“归巢”效率。结果显示,筛选到D308和D309两个位点是II型内含子编码蛋白Mg2+结合的核心催化位点,并成功构建该位点的三种突变体,包括两个单点突变体(D308A和D309A)和一个双点突变体(D308A/D309A),大肠杆菌体内实验结果表明,三种突变体均完全失活了II型内含子的“归巢”功能。证实了II型内含子编码蛋白Mg2+结合位点是其发挥功能的核心催化位点。

关键词： Ⅱ型内含子内含子编码蛋白 Mg2+结合位点 targetron 反转录结构域

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金黄色葡萄球菌基因组编辑技术

基因组学与应用生物学 2018年第12期37卷 5332-5338页

作者：王贞周威张浩胡梁斌莫海珍河南科技学院食品学院

金黄色葡萄球菌是一种革兰氏阳性病原菌,可引发多种严重感染。分子遗传学操作是研究金黄色葡萄球菌基因功能和分子感染机制的重要手段。金黄色葡萄球菌因其限制性修饰系统使得对其进行遗传学操作总显得费时费力。此外,较低的DNA转化效... 详细信息

金黄色葡萄球菌是一种革兰氏阳性病原菌,可引发多种严重感染。分子遗传学操作是研究金黄色葡萄球菌基因功能和分子感染机制的重要手段。金黄色葡萄球菌因其限制性修饰系统使得对其进行遗传学操作总显得费时费力。此外,较低的DNA转化效率和同源重组率也一直制约着相关研究的开展。本研究列举了近年来主流的金黄色葡萄球菌基因组编辑方法,包括基于基因等位替换的抗生素筛选和反向筛选系统、基于Ⅱ型内含子剪切的targetron系统以及重组的CRISPR/Cas9系统,从技术层面较为详细地介绍和比较了上述编辑技术的操作原理和试验流程,以期为相关领域的研究人员提供技术参考。

关键词：金黄色葡萄球菌同源重组抗性筛选反向筛选 targetron CRISPR/Cas9