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虾类行动障碍野田村病毒(MDNV)taqmanrt-pcr检测方法的建立与应用

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渔业科学进展 2021年第5期42卷 77-85页

作者：桑松文李小平张庆利中国水产科学研究院黄海水产研究所农业农村部海水养殖病害防治重点实验室青岛海洋科学与技术试点国家实验室海洋渔业科学与食物产出过程功能实验室山东青岛266071 上海海洋大学水产与生命学院上海201306

基于虾类行动障碍野田村病毒(movement disorder nodavirus,MDNV)的RNA依赖的RNA聚合酶(RdRp)基因设计寡核苷酸引物和探针,以含有MDNV靶基因的pMD18-MDNV质粒和RNA标准品为模板,通过优化反应体系和反应程序,建立了MDNV的taqman rt-pcr... 详细信息

基于虾类行动障碍野田村病毒(movement disorder nodavirus,MDNV)的RNA依赖的RNA聚合酶(RdRp)基因设计寡核苷酸引物和探针,以含有MDNV靶基因的pMD18-MDNV质粒和RNA标准品为模板,通过优化反应体系和反应程序,建立了MDNV的taqman rt-pcr检测方法。优化后的反应组分:20.0μL taqman rt-pcr反应液预混液中包含11.0μL一步法rt-pcr缓冲液、0.8μL酶混合物、0.3μmol/L正向引物、0.3μmol/L反向引物、0.4μmol/L探针、1.0μL模板和5.2μL RNA-free H2O;优化后的反应程序:54.5℃15 min,95℃1 min;45个热循环扩增(95℃10 s,60.3℃30 s)。本研究所建立的方法能实现对MDNV的特异性检测,在1.4×10^(10)-1.4×10^(1 )copies/μL标准质粒浓度范围内,起始模板浓度对数值与反应循环数间呈良好的线性关系;该方法最低可检测5.5×101拷贝的RNA标准品或1.4×10^(1)拷贝的pMD18-MDNV标准质粒。分析结果还显示,该检测方法批内Ct值和批间Ct值的变异系数(CV)分别小于1.27%和1.83%,具有良好的重复性和稳定性。利用该方法对2019年采自我国部分省市的样品进行检测发现,凡纳滨对虾(Litopenaeus vannamei)中MDNV的阳性检出率为23.5%(16/68)。本研究建立的MDNV taqman rt-pcr方法具有特异性、快速和灵敏等特点,可为对虾养殖实践中MDNV的定性、定量检测与监测以及有效防控提供技术支持。

关键词：养殖对虾行动障碍野田村病毒(MDNV) taqman rt-pcr 定量检测方法

Rapid Detection of Filoviruses by Real-time taqman Polymerase Chain Reaction Assays

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Virologica Sinica 2012年第5期27卷 273-277页

作者： Yi Huang Hongping Wei Yunpeng Wang Zhengli Shi Herve Raoul Zhiming Yuan State Key Laboratory of Virology Wuhan Institute of ViqrologyChinese Academy of SciencesWuhan 430071China Laboratoire P4 Jean Merieux National Institute for Health and Medical Research(Inserm)69365 Lyon Cedex 07France

Ebola virus （EBOV） and Marburg virus （MARV） are causative agents of severe hemorrhagic fever with high mortality rates in humans and non-human primates and there is currently no licensed vaccine or therapeutics. To date, there is no specific laboratory diagnostic test in China, while there is a national need to provide differential diagnosis during outbreaks and for instituting acceptable quarantine procedures. In this study, the taqman rt-pcr assays targeting the nucleoprotein genes of the Zaire Ebolavirus （ZEBOV） and MARV were developed and their sensitivities and specificities were investigated. Our results indicated that the assays were able to make reliable diagnosis over a wide range of virus copies from 103 to 109, corresponding to the threshold of a standard RNA transcript. The results showed that there were about 101 RNA copies per milliliter of virus culture supernatant, equivalent to 10,000 RNA molecules per infectious virion, suggesting the presence of many non-infectious particles. These data indicated that the taqman rt-pcr assays developed in this study will be suitable

关键词： Ebola virus Marburg virus Nucleoprotein (hiP) gene taqman rt-pcr

贵州省PEDV流行株遗传演化分析及抗原表位串联表达的研究

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贵州省PEDV流行株遗传演化分析及抗原表位串联表达的研究

作者：万娟贵州大学

学位级别：硕士

猪流行腹泻病毒（porcine epidemic diarrhea virus,PEDV）是导致不同生长阶段猪群发生腹泻类疾病的主要病原体之一。PEDV为有囊膜的单股正链RNA冠状病毒,S基因是PEDV的主要毒力基因,S基因的插入、缺失、突变可能会导致PEDV毒力的改变,... 详细信息

猪流行腹泻病毒（porcine epidemic diarrhea virus,PEDV）是导致不同生长阶段猪群发生腹泻类疾病的主要病原体之一。PEDV为有囊膜的单股正链RNA冠状病毒,S基因是PEDV的主要毒力基因,S基因的插入、缺失、突变可能会导致PEDV毒力的改变,是PEDV分型的主要依据。ORF3基因与PEDV的毒力有关,编码224个氨基酸,可以用于区分疫苗和野生型PEDV,是PEDV流行病学调查的有价值工具。为了解PEDV在贵州省的感染情况、PEDV流行毒株的遗传变异情况,以及初探S基因主要抗原表位串联表达蛋白的免疫效果,本实验基于PEDV S基因保守区域设计特异性引物及探针,经优化后建立了一种Taq Man rt-q pcr检测方法,应用该方法对2017年～2023年2月贵州省内养猪场临床送检的腹泻样品进行了PEDV回溯性检测,并对部分PEDV阳性样品的S、ORF3基因进行了克隆和遗传演化分析。同时,对PEDV S蛋白的主要抗原表位进行了预测分析,设计构建了主要抗原表位的串联表达质粒,并对诱导表达纯化的重组蛋白抗原性进行了研究。具体方法结果如下:1、猪流行性腹泻病毒荧光定量rt-pcr方法的建立与应用为建立一种便捷、特异性强、灵敏度高的Taq Man rt-q pcr检测方法,了解贵州省PEDV流行情况,本研究针对PEDV S基因的保守区域设计了引物和探针,通过rt-pcr扩增并克隆目的片段构建标准质粒,经系列优化后建立了Taq Man rt-q pcr检测方法。结果显示,该方法的最优反应程序为50℃逆转录15 min;95℃30 s;95℃5 s,56℃30 s,共40个循环。该方法具有良好的线性关系,其相关系数为0.995,可靠性较高;与Po RV、TGEV、PDCo V等病毒不存在交叉反应,特异性高;最低检测限度可达1.0 copies/μL,比普通rt-pcr反应检测方法灵敏100倍。在1×10～5～1×10～3copies/μL标准品范围内,批内和批间重复变异系数均小于1.5%,具有良好的重复性和稳定性。应用该方法对2017年～2023年2月贵州省不同地区养猪场送检的119份临床样品进行PEDV回溯性检测,结果显示PEDV阳性率为77.31%（92/119）,且每年的1～4月送检的腹泻样品最多,阳性率为84.85%（56/66）。上述结果表明,贵州省PED主要在春季多发。本研究在丰富贵州省PEDV流行病学资料的同时,亦为分析贵州省PEDV S和ORF3基因的遗传演化奠定了材料基础。2、30份阳性样品的S和ORF3基因克隆与遗传演化分析为了解贵州省PEDV流行毒株的遗传变异特点,本研究针对PEDV ORF3、S基因设计了特异性扩增引物,选取30份PEDV阳性样品进行S、ORF3基因的扩增、克隆、测序,对所得序列进行遗传演化分析,并对S蛋白的B、T淋巴细胞主要抗原表位进行预测分析。结果表明:30份样品的S基因大小在4146～4170 bp,编码1382～1390 aa,ORF3基因大小均为675 bp,编码224 aa。与CV777株相比,30份样品的S基因存在52处相同氨基酸位点突变,且突变主要存在于S1-NTD区;ORF3基因存在6处相同氨基酸位点突变,相对较保守。30份样品的S基因与CV777株氨基酸同源性为93.2%～95.0%,ORF3基因与CV777株氨基酸同源性为94.2%～96.4%,同源性较低。基于PEDV S基因,30份样品在GⅠ、GⅡ型均有流行,主要流行GⅡ型,其中4份隶属于GⅠb亚型;8份隶属于GⅡa亚型,与疫苗株XJ-DB2亲缘关系较近;18份隶属于GⅡb亚型,与疫苗株AJ1102、AJ1102-R亲缘关系较近。基于ORF3基因,30份样品全部隶属于GⅡ型,其中15份隶属于GⅡb亚型,与疫苗株XJ-DB2亲缘关系较近;15份隶属于GⅡa亚型,与疫苗株AJ1102、AJ1102-R亲缘关系较近。与CV777株相比,基于PEDV S基因分型,可以把ND、TD、GC、AV作为GⅡa亚型的分子标记,把TD、FY、SG、PS、Y缺失作为GⅡb亚型的分子标记,把KN、IL、YF、YF、ND、CF、FS、AD,G缺失作为GⅡc亚型的分子标记;基于ORF3基因分型,可以把LS、IV作为GⅡa亚型的分子标记,把FV、HQ作为区分GⅡb亚型的分子标记。与CV777株S基因相比,26份GⅡ型S基因糖基化位点均存在3个位点缺失和2个位点插入,相差较大;30份样品的S基因4个中和抗原表位的突变集中在COE区,存在7～11个氨基酸突变。预测发现,PEDV S蛋白主要存在9个B淋巴细胞抗原表位和5个T淋巴细胞抗原表位。上述结果表明本研究克隆的30株PEDV均为变异株,且与经典疫苗株S基因相比,同源性、抗原表位、N

关键词：猪流行性腹泻病毒 S基因 ORF3基因遗传演化分析 taqman rt-pcr 多表位融合蛋白抗原性

c-MET-e2-D及其表达与胃癌发生之间的关系研究

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c-MET-e2-D及其表达与胃癌发生之间的关系研究

作者：许义松西北大学

学位级别：硕士

随着医学检测技术的发展,使得对胃癌的发病机理的认识更加全面深入。如二代测序技术及依托pcr技术而衍生出来的检测方法,逐步完善了胃癌临床上的相关特征内容,如胃癌的病理分型。以前的病理分型主要分为Lauren分型、WHO分型和Borrmann... 详细信息

随着医学检测技术的发展,使得对胃癌的发病机理的认识更加全面深入。如二代测序技术及依托pcr技术而衍生出来的检测方法,逐步完善了胃癌临床上的相关特征内容,如胃癌的病理分型。以前的病理分型主要分为Lauren分型、WHO分型和Borrmann分型。最近的一篇Nature文章提出将胃癌又划分为四种亚型：基因组稳定型(GS),EB病毒感染型(EBV),染色体不稳定型(CIN),微卫星不稳定型(MSI)。本研究中的c-MET基因是临床上诊断及治疗的靶标。c-MET基因是原癌基因,属于酪氨酸激酶家族类,其介导肿瘤的发生主要体现在过表达,拷贝数变异,突变,异常的选择性剪切产生的新的转录本的表达及自分泌和旁分泌的配体(HGF)的刺激。c-MET的这些异常主要发生在MSI和CIN两种亚型中。目前,针对c-MET的靶向药物有十几种,如Onartuzumab, LY-2875358, INCB28060, EMD 1204831, EMD 1214063等等。因此在胃癌中研究c-MET基因的异常对临床诊断及治疗具有重要的意义。本课题的目的就是利用最新的分子生物学检测方法来检测c-MET基因存在的多种选择性剪切(AS)(2号外显子缺失,10号外显子缺失,13号外显子缺失,14号外显子缺失、18号外显子缺失及18/19号外显子缺失),以及研究这些选择性剪切与胃癌发生发展的关系。本实验利用转录组测序在胃癌细胞系BGC-823中检测这些外显子的缺失情况,然后用’aqman rt-pcr的方法在8株细胞系、57例胃癌样本及配对的34例正常样本中验证这些外显子的缺失,最后探究缺失外显子的转录本的表达与胃癌的关系。实验结果表明,在BGC-823细胞系的测序结果中只发现2号外显子的缺失(c-MET-e2-D),因此我们针对2号外显子设计相对应的引物及探针并构建c-MET-e2-D质粒。在’aqman rt-pcr对8株细胞系的检测结果中发现8株细胞系(100%)都存在c-MET-e2-D;在57例胃癌样本中发现57(100%)例样本存在c-MET-e2-D,另外有3例样本存在2号外显子的完全缺失;在34例正常样本中发现31(91.2%)例存在c-MET-e2-Do经过卡方检验得出胃癌中的发生率与正常样本中的发生率存在显著性差异(P=0.023)。随后我们对c-MET-e2-D及c-MET的表达量进行分析,利用相对定量的2-△CT方法和2-ΔΔCT方法来计算。发现c-MET-e2-D的表达量在胃癌(34例)中比配对的正常样本(34例)高,且存在显著性差异(P=0.01);且c-MET-e2-D在高TNM分期样本(35例)中的表达量比低TNM分期的样本(22例)高,也存在显著性差异(P=0.027)。最后我们利用相关与回归的方法检验c-MET-e2-D与c-MET在胃癌及正常样本中的关系,发现c-MET-e2-D与c-MET存在正相关的关系,且回归方程具有显著性意义(P<0.001)。因此,c-MET-e2-D可以为胃癌临床早期诊断及治疗提供一定的参考,也可以为患者预后提供一定的评价依据。

关键词：胃癌 c-MET-e2-D c-MET 选择性剪切转录组测序 taqman rt-pcr

细菌NDM-1质粒耐药表型与其表达的相关性研究

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中国抗生素杂志 2020年第5期45卷 477-481页

作者：冯伟欧阳净程林袁慊王瑜孙凤军陆军军医大学(第三军医大学)西南医院药剂科重庆400038 重庆市公共卫生医疗救治中心药剂科重庆400036

目的探讨NDM-1质粒携带菌株耐药表型与其基因表达的相关性,为临床抗菌药物选择提供理论参考。方法携带NDM-1的质粒电转化入大肠埃希菌TOP10,采用琼脂平板倍比稀释法测定碳青霉烯类药物对野生株和电转化子的最低抑菌浓度(minimal inhibit... 详细信息

目的探讨NDM-1质粒携带菌株耐药表型与其基因表达的相关性,为临床抗菌药物选择提供理论参考。方法携带NDM-1的质粒电转化入大肠埃希菌TOP10,采用琼脂平板倍比稀释法测定碳青霉烯类药物对野生株和电转化子的最低抑菌浓度(minimal inhibitory concentration,MIC),taqman rt-pcr检测碳青霉烯类耐药菌株的blaNDM-1基因表达及亚-MIC亚胺培南诱导对blaNDM-1基因表达的影响。结果12株产NDM-1菌株中共有8株电转化成功,电转化子对碳青霉烯类药物的耐药性与野生菌株基本一致。细菌对碳青霉烯类的耐药性与blaNDM-1基因表达成正比。亚-MIC亚胺培南诱导后菌株对碳青霉烯类药物的MIC值和blaNDM-1基因表达均显著高于野生株。结论碳青霉烯类耐药菌株耐药表型与blaNDM-1基因表达具有正相关性,taqman rt-pcr检测可快速准确地为临床治疗提供依据。

关键词： NDM-1 质粒碳青霉烯酶 taqman rt-pcr 耐药