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TaqMan探针熔解曲线技术检测GJB2基因突变

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中华耳科学杂志 2015年第3期13卷 541-544页

作者：高慧刘晶晶沈姗姗梁少明危林耿李芳芳王沙燕暨南大学第二临床医学院深圳市人民医院深圳518020 亚能生物技术(深圳)有限公司深圳518133

目的建立快速可靠的Taq Man探针熔解曲线技术,分析非综合征型遗传性耳聋患者的GJB2基因及探讨Taq Man探针熔解曲线技术。方法制备标准品,利用Taq Man探针基于荧光PCR熔解曲线平台建立熔解曲线分析技术;收集138例正常人群、113例非综合... 详细信息

目的建立快速可靠的Taq Man探针熔解曲线技术,分析非综合征型遗传性耳聋患者的GJB2基因及探讨Taq Man探针熔解曲线技术。方法制备标准品,利用Taq Man探针基于荧光PCR熔解曲线平台建立熔解曲线分析技术;收集138例正常人群、113例非综合征型遗传性耳聋患者及2个非综合征型遗传性耳聋家系,应用Taq Man探针熔解曲线技术分析GJB2基因最常见的35del G,176_191del16,235del C,299_300del AT的4个突变位点;结果利用直接测序技术加以验证。结果 138例正常人群中检出2例GJB2基因突变,113例非综合征型遗传性耳聋患者中检出22例GJB2基因突变,2个耳聋家系先证者均为GJB2基因突变患者;所有检测结果均与测序结果一致。结论利用Taq Man探针建立了一种快速可靠的探针熔解曲线技术,经测序验证能准确的检测GJB2基因常见的4种突变。

关键词：遗传性耳聋 TaqMan探针熔解曲线 GJB2基因

广州地区犬、猫细小病毒的分离鉴定、遗传进化分析及TaqMan探针荧光定量方法的建立

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广州地区犬、猫细小病毒的分离鉴定、遗传进化分析及TaqMan探针荧...

作者：钱鹏华南农业大学

学位级别：硕士

猫泛白细胞减少症病毒(Feline panleukopenia virus,FPV)又称猫细小病毒,自二十世纪初在猫体内被分离,可导致严重的白细胞数目减少、胃肠炎和神经症状。犬细小病毒(Canine parvovirus 2,CPV-2)在20世纪70年代后期作为犬科病原体出现,可... 详细信息

猫泛白细胞减少症病毒(Feline panleukopenia virus,FPV)又称猫细小病毒,自二十世纪初在猫体内被分离,可导致严重的白细胞数目减少、胃肠炎和神经症状。犬细小病毒(Canine parvovirus 2,CPV-2)在20世纪70年代后期作为犬科病原体出现,可以引起出血性肠炎和幼龄犬心肌炎。在20世纪80年代,出现了两种抗原亚型(CPV-2a和CPV-2b),最终完全取代了原来的CPV-2,2000年在意大利报道了新的变异株CPV-2c。目前猫泛白细胞减少症病毒、犬细小病毒及其亚型在全球范围内分布广泛,具有高致病性及高死亡率,给世界范围内的犬、猫种群造成严重的威胁。犬、猫细小病毒的衣壳蛋白VP2的基因突变已被证明会影响不同抗原变体的进化(Decaro et al.,2007;Pinto et al.,2012),病毒VP2基因的序列分析及其后续表征对于研究病毒的系统发育具有非常重要的作用。本研究在2016年至2018年从广州地区的各个动物医院采集具有细小病毒发病症状的犬、猫粪便及肛门拭子,并将这些病料接种F81细胞系进行病毒分离。获得8个毒株包括6株犬细小病毒和2株猫细小病毒,通过扩增VP2基因序列并测序,分析并绘制相应的系统进化树,结果显示6株犬细小病毒均处于东南亚地区的分枝上,其中有2株是New-CPV-2a(297、440处氨基酸残基均为丙氨酸),4株是CPV-2c(426处氨基酸残基均谷氨酸)。New-CPV-2a的两株分离株显示他们分别来自不同的祖先,而CPV-2c分离株则共同构成一个分支,并且系统发育分析显示CPV-2c分离株均与2014年中国山东的CPV-SD/14/12分离株同源性最高。从时间上分析2016-2018年间广州地区的CPV流行株主要为New-CPV-2a及CPV-2c。FPV进化树分析结果显示这两个分离株与多个中国的分离株处于同一分支,表明本次分离到的毒株在地理位置上流行性还是在中国范围内,而2017年的分离株FPV-LM在VP2衣壳蛋白氨基酸残基上第16、67、75处中出现了3个之前没有发生的突变。这些突变位点是否稳定出现在其他毒株,尚需更广泛的序列测定及分析。本文在分离病毒的基础上建立了一种针对犬、猫细小病毒的TaqMan探针荧光定量方法。事实证明该方法具较高灵敏度,能够检测到82.3个拷贝/μL的病毒DNA,高于常规PCR检测。该实时荧光定量PCR方法展示出了对犬科和猫科细小病毒病诊断出色的适用性,为犬、猫细小病毒病的临床诊疗提供可靠手段。

关键词：犬细小病毒猫泛白细胞减少症病毒遗传进化分析 TaqMan探针荧光定量PCR

枣疯病植原体TaqMan探针实时荧光定量PCR检测方法的建立

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植物保护 2014年第5期40卷 111-116页

作者：韩剑罗明徐金虹王同仁张祥林新疆农业大学农学院乌鲁木齐830052 新疆阿瓦提县农技推广中心阿瓦提843200 新疆出入境检验检疫局乌鲁木齐830063

根据枣疯病植原体16SrDNA基因保守区域设计、合成特异性引物和TaqMan探针,以构建的重组质粒作为阳性标准品,建立并优化了对枣疯病植原体的taqman实时荧光定量PCR检测方法。对优化后的方法进行灵敏度、特异性及稳定性评价,制作了标准曲... 详细信息

根据枣疯病植原体16SrDNA基因保守区域设计、合成特异性引物和TaqMan探针,以构建的重组质粒作为阳性标准品,建立并优化了对枣疯病植原体的taqman实时荧光定量PCR检测方法。对优化后的方法进行灵敏度、特异性及稳定性评价,制作了标准曲线。结果显示,制作的标准曲线有极好的线性关系,相关系数(r2)达到0.998,建立的实时荧光定量PCR检测方法能够特异性地检测枣疯病植原体,能检测到60拷贝的质粒DNA。本研究建立的实时荧光定量PCR检测方法灵敏度、特异性、重复性好,不仅能够实现对枣疯病植原体的快速检测,而且为实现从病原定量水平上对枣疯病病情分级奠定了基础。

关键词：枣疯病植原体 TaqMan探针实时荧光定量PCR 检测

TaqMan探针FQ-PCR检测肝脏疾病血清miR-122的表达水平及其临床意义

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Taqman探针FQ-PCR检测肝脏疾病血清miR-122的表达水平及其临床意义

作者：吴瑞珊暨南大学

学位级别：硕士

目的建立TaqMan探针实时荧光定量PCR（FQ-PCR）方法检测血清miR-122的表达水平，选择taqman DNA聚合酶最适浓度以及以U6snRNA作为内参的可行性研究;并应用该法检测肝脏疾病患者血清miR-122的表达水平及探讨其临床应用价值。方法 1.建... 详细信息

目的建立TaqMan探针实时荧光定量PCR（FQ-PCR）方法检测血清miR-122的表达水平，选择taqman DNA聚合酶最适浓度以及以U6snRNA作为内参的可行性研究;并应用该法检测肝脏疾病患者血清miR-122的表达水平及探讨其临床应用价值。方法 1.建立TaqMan探针FQ-PCR方法检测血清中miR-122的表达水平，选出taqman DNA聚合酶的最适浓度和以U6snRNA作为内参可行性的分析。 2.应用TaqMan探针FQ-PCR检测27例肝癌患者、15例乙型肝炎患者、15例丙型肝炎患者、15例正常对照者、15例肝癌术后患者及15例肝癌术后复发患者血清中miR-122的表达水平。 3.探讨血清miR-122与肝脏疾病相关标志物（HBV DNA、HCV RNA、ALT、HBsAg、HBeAg、HCV-Ab和AFP）的关系。结果 1. taqman DNA聚合酶最适浓度为0.0625U/μl;U6snRNA可作为检测血清miR-122的内参。 2.肝癌、乙型肝炎、丙型肝炎和肝癌术后复发患者血清miR-122的表达水平均高于正常对照者和肝癌术后患者（P0.05），肝癌术后患者血清miR-122的表达水平比肝癌和术后复发者均低（PTaqMan探针FQ-PCR方法适用于血清miR-122表达水平的检测，血清miR-122可作为肝脏疾病，特别是肝癌的早期诊断、手术疗效及预后判断的新指标。

关键词： TaqMan探针 FQ-PCR 血清 miR-122 肝癌

基于TaqMan探针荧光定量PCR检测临床致病真菌方法的建立及应用

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基于Taqman探针荧光定量PCR检测临床致病真菌方法的建立及应用

作者：汲珊珊广西医科大学

学位级别：硕士

研究目的针对红色毛癣菌(Trichophyton runbrum)、尖孢镰刀菌(Fusarium oxysporum)、卡氏肺孢子菌(Pneumocystis carinii)和巴西副球孢子菌(Paracoccidioides brasiliensis)四种临床致病真菌,建立基于TaqMan探针荧光定量PCR技术的快速检测方法,并对临床分离株进行应用性验证。研究意义随着广谱抗生素、皮质类固醇激素以及免疫抑制剂的使用率逐年上升,致病真菌的感染率不断提高,使真菌感染成为许多常见病和并发症的诱因之一。红色毛癣菌是临床上最为常见的皮肤癣菌,也是导致浅部真菌感染的主要病原体。临床上约80%体股癣及72%手足癣及甲癣由红色毛癣菌引起。在引起人类真菌性角膜炎的常见致病真菌中,镰刀菌最多,占62%。卡氏肺孢子菌是一种机会性感染病原体,多见于免疫机制缺陷者,导致卡氏肺孢子菌肺炎的发生,患者若不经治疗病死率达100%。巴西副球孢子菌可引起皮肤粘膜,淋巴结和内脏器官感染的慢性化脓性肉芽肿性疾病。可经呼吸道、消化道以及皮肤黏膜损伤处进入人体引起感染,艾滋病患者发病率极高。目前我国临床致病真菌的检测主要依赖形态学观察,但仍存在阳性检出率低,以及阳性率和准确率因取材部位和取材量不同易出现假阴性结果。真菌培养仍然是诊断的金标准,这类诊断方法存在耗时较长、检出率低等不足。通过真菌培养法鉴定临床致病真菌至少需要2-7天,至2周后仍没有菌体生长才可确定为阴性结果,在一定程度上延误了早期诊断和治疗。我国尚缺乏一种快速、准确、稳定的检测致病真菌的方法以满足临床快速诊断的需要。因此,逐步开展临床致病真菌检测的研究对于我国临床上致病真菌的快速诊断及早期针对性的用药具有深刻的指导意义。研究方法本研究运用Bioeidt和Beacon Designer等生物学软件,分别设计了四组特异性的引物和探针,建立了红色毛癣菌、尖孢镰刀菌、卡氏肺孢子菌和巴西副球孢子菌的荧光定量PCR检测方法,并通过制备各种真菌的质粒DNA标准品,对致病真菌进行准确定量;同时评估该方法的特异性、灵敏度、重复性。最后利用建立的四种致病真菌检测方法对北京大学真菌与真菌病研究中心、陕西省眼科研究所、山东省眼科研究所以及本研究中保存的共115株致病真菌标准株和临床分离株进行验证。研究成果本研究分别建立了基于TaqMan探针荧光定量PCR技术的红色毛癣菌、尖孢镰刀菌、卡氏肺孢子菌和巴西副球孢子菌快速检测方法。这些方法通过1-2天内培养出足够进行荧光定量PCR检测的真菌菌体,再通过菌体收集、DNA提取以及进行定量PCR反应,仅需2-3天。与传统的真菌培养法相比,不仅明显缩短了真菌检测的时间,特异性高,均为100%;灵敏度高,前两者灵敏度为102copies/μl,而后两者灵敏度达到101copies/μl;重复性好。应用该方法对临床分离株的检测,准确率也达到100%。研究结论本研究建立的检测红色毛癣菌、尖孢镰刀菌、卡氏肺孢子菌以及巴西副球孢子菌的TaqMan探针荧光定量PCR方法,不仅快速简单,而且准确特异,灵敏度高且重复性好,将为临床致病真菌的检测打下基础。

关键词： TaqMan探针荧光定量PCR 致病真菌检测

taqman荧光探针技术在食源性致病菌检测中的应用

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食品工业科技 2013年第7期34卷 374-377页

作者：伊鋆蔡雪凤国家食品质量安全监督检验中心北京100094

taqman荧光探针技术作为定量PCR的代表性方法,综合了PCR技术及荧光标记技术,由引物和探针双重控制靶基因的选择,具有很好的特异性和灵敏度。近年来该技术逐步应用于食品中致病微生物的检测。本文概述了taqman荧光探针技术的原理、优缺... 详细信息

taqman荧光探针技术作为定量PCR的代表性方法,综合了PCR技术及荧光标记技术,由引物和探针双重控制靶基因的选择,具有很好的特异性和灵敏度。近年来该技术逐步应用于食品中致病微生物的检测。本文概述了taqman荧光探针技术的原理、优缺点及其在食源性致病菌检测中的应用与研究进展,并对其应用前景进行了探讨。

关键词： TaqMan探针食源性致病菌定量检测

非洲马瘟病毒TaqMan探针荧光定量RT-PCR检测方法的建立

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中国兽医科学 2013年第11期43卷 1167-1174页

作者：赵文华杨仕标李富祥云南省畜牧兽医科学院国家外来动物疫病诊断实验室云南省热带亚热带动物病毒病重点实验室云南昆明650224

为建立非洲马瘟病毒(AHSV)TaqMan探针荧光定量RT-PCR检测方法,根据GenBank及自己所测的AHSV 9个血清型VP7的ORF全长核苷酸序列,设计2套位于AHSV基因组S7片段的特异引物及相应TaqMan探针。经试验,结果证实2套引物探针可将9种血清型的AHSV... 详细信息

为建立非洲马瘟病毒(AHSV)TaqMan探针荧光定量RT-PCR检测方法,根据GenBank及自己所测的AHSV 9个血清型VP7的ORF全长核苷酸序列,设计2套位于AHSV基因组S7片段的特异引物及相应TaqMan探针。经试验,结果证实2套引物探针可将9种血清型的AHSV RNA分为2群而分别进行特异性检测,而对与AHSV同属的蓝舌病病毒、鹿出血热病毒及正常马淋巴组织均无荧光信号可检出。其中探针H2及其配套引物可特异性检测AHSV1、3、4、6、7、8、9七个血清型,而MGB探针及其配套引物可特异性检测AHSV 2、5两个血清型。分别以构建好的2型、9型全长VP7的pMD18-T-VP7质粒为标准品建立标准曲线,最终建立了AHSV taqman荧光探针实时荧光定量RT-PCR快速检测方法,可实现对全部9个血清型AHSV的定量检测和快速诊断。

关键词：非洲马瘟病毒 TaqMan探针实时荧光定量RT—PCR

TaqMan探针实时定量PCR检测肉中金黄色葡萄球菌的研究

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食品工业 2013年第3期34卷 109-112页

作者：邵美丽许岩刘思国赵燕丽孔保华东北农业大学食品学院哈尔滨150030 中国农业科学院哈尔滨兽医研究所动物细菌病研究室哈尔滨150001

根据GenBank公布的金黄色葡萄球菌的nuc基因序列设计一对引物和一条TaqMan探针,在分析其特异性基础上,构建阳性重组质粒进行荧光定量PCR扩增,制备标准曲线,分析方法的敏感度。进一步将该方法应用到人工染菌肉样中,分析其最低检出限。结... 详细信息

根据GenBank公布的金黄色葡萄球菌的nuc基因序列设计一对引物和一条TaqMan探针,在分析其特异性基础上,构建阳性重组质粒进行荧光定量PCR扩增,制备标准曲线,分析方法的敏感度。进一步将该方法应用到人工染菌肉样中,分析其最低检出限。结果显示该方法对5株金黄色葡萄球菌均可产生特异性扩增曲线,其他6株非单增李斯特菌不产生扩增曲线,表明该方法具有较强的特异性。对阳性重组质粒定量扩增所建立标准曲线的相关系数为0.997,敏感度为1.87×101拷贝.μL-1。该法对人工染菌肉样中金黄色葡萄球菌的最低检出限为2.0×102cfu.g-1。该方法特异性强、敏感性高,可为肉中金黄色葡萄球菌的快速、准确的定量检测奠定基础。

关键词： TaqMan探针金黄色葡萄球菌的nuc基因肉荧光定量PCR

TaqMan探针实时荧光定量PCR快速检测土拉弗朗西斯菌

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中国人兽共患病学报 2012年第6期28卷 602-606页

作者：赵素慧王春晖周莹韦耀韩桂圆钮红岺赵卫张其威万成松南方医科大学公共卫生与热带医学学院微生物学系广州510515

目的建立TaqMan探针实时荧光定量PCR方法(QF-PCR),快速检测土拉弗朗西斯菌。方法针对土拉弗朗西斯菌的外膜蛋白fopA基因,利用Primer 5.0设计引物及TaqMan探针,人工合成fopA基因保守片段,克隆到载体作为阳性标准品,进行荧光定量检测,制... 详细信息

目的建立TaqMan探针实时荧光定量PCR方法(QF-PCR),快速检测土拉弗朗西斯菌。方法针对土拉弗朗西斯菌的外膜蛋白fopA基因,利用Primer 5.0设计引物及TaqMan探针,人工合成fopA基因保守片段,克隆到载体作为阳性标准品,进行荧光定量检测,制作定量标准曲线,并以合成fopA基因为模板,PF、PR为引物,研究其灵敏度、特异性和准确性。结果构建了含fopA基因的重组质粒,以不同浓度的重组质粒制作标准曲线,在103～107拷贝数之间有较好的线性关系。灵敏度试验表明,该方法可检测到30.6个拷贝数的重组质粒,比普通PCR灵敏度高;特异性试验表明,能选择性检测土拉弗朗西斯菌,而与其他病原菌无交叉反应,与普通菌落PCR结果一致;重复性试验表明,拷贝数为3.06×106样品5次平行试验,标准差为0.201,变异系数为0.88%。结论本研究建立了TaqMan探针QF-PCR快速检测技术,具有灵敏度高、特异性强、重复性好等特点,可用于快速、实时、定量检测土拉弗朗西斯菌,为快速检测生物战剂级微生物建立了一种人工合成特异基因TaqMan探针实时荧光定量PCR新方法。

关键词：土拉弗朗西斯菌 TaqMan探针 fopA基因荧光定量PCR