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猪圆环病毒2型taqman荧光定量PCR检测方法的建立

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中国畜牧兽医 2014年第5期41卷 39-45页

作者：郭慧娟李秀丽张国伟鄢明华李海花李富强天津农学院天津300384 天津市畜牧兽医研究所天津300112

采用PCR方法克隆了猪圆环病毒2型（porcinecircovirus2，PCV2）衣壳蛋白（capsidprotein，CAP）基因，构建了重组质粒p-18T—CAP，并将其作为标准阳性模板。参照GenBank收录的PCV2ORF2基因设计合成1对特异性的引物和与该引物相匹配的特... 详细信息

采用PCR方法克隆了猪圆环病毒2型（porcinecircovirus2，PCV2）衣壳蛋白（capsidprotein，CAP）基因，构建了重组质粒p-18T—CAP，并将其作为标准阳性模板。参照GenBank收录的PCV2ORF2基因设计合成1对特异性的引物和与该引物相匹配的特异探针，通过对反应条件进行优化，以定量的10倍系列稀释的质粒p-18T—CAP为标准品进行taqman荧光定量PCR扩增，建立了一种检测PCV2的taqman荧光定量PCR方法。试验结果显示，该方法与猪圆环病毒1型、猪流感病毒、猪繁殖与呼吸综合征病毒、猪伪狂犬病病毒、猪瘟病毒等均无交叉反应；该方法最低可检测到4．53×10^2拷贝／μL，比PCR检测方法高100倍；其标准曲线线性范围是10^2～10^9拷贝／μL，且具有良好的重复性。

关键词：猪圆环病毒2型荧光定量PCR TaqMan探针

猪瘟病毒taqman实时荧光定量PCR检测方法的建立及初步应用

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中国畜牧兽医 2014年第6期41卷 18-22页

作者：岳锋朱艳平银梅王选年新乡学院生命科学与技术系河南新乡453003 新乡学院生物技术研究所河南新乡453003 河南科技学院动物科学学院河南新乡453003

根据GenBank中猪瘟病毒(classical swine fever virus,CSFV)5′NTR的保守序列,设计1对特异性引物和TaqMan探针,以CSFV全长基因重组质粒pGEM-CSFV为标准品,建立taqman实时荧光定量PCR标准曲线,进行特异性、敏感性和重复性试验,并检测人... 详细信息

根据GenBank中猪瘟病毒(classical swine fever virus,CSFV)5′NTR的保守序列,设计1对特异性引物和TaqMan探针,以CSFV全长基因重组质粒pGEM-CSFV为标准品,建立taqman实时荧光定量PCR标准曲线,进行特异性、敏感性和重复性试验,并检测人工感染CSFV后不同时期猪血浆中CSFV的载量。结果表明,标准曲线循环阈值与模板浓度具有良好的线性关系,R2=0.999;敏感性高,最低检测限为1×101拷贝/μL;特异性强,与猪圆环病毒2型、猪细小病毒、猪伪狂犬病病毒和猪繁殖与呼吸综合征病毒无交叉反应性;重复性好,组内和组间变异系数均小于2%。人工感染CSFV后第7天猪血浆中CSFV载量达到峰值,之后逐渐降低。结果表明,建立的taqman实时荧光定量PCR方法具有特异、敏感、重复性好等优点,为CSFV的定量分析及临床诊断奠定基础。

关键词：猪瘟病毒实时荧光定量PCR TaqMan探针

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柑橘黄龙病实时荧光PCR鉴定技术研究

安徽农业科学 2011年第6期39卷 3339-3340,3428页

作者：肖远辉陈国平傅翠娜广西柑桔研究所广西桂林541004

[目的]建立一套高效、准确的柑橘黄龙病(HLB)早期鉴定手段。[方法]根据HLBsecE基因(EF164805.1)保守区域设计引物和探针,建立HLB的TaqMan探针实时荧光PCR鉴定技术。[结果]被检测的236个柑橘苗圃样品中,有54个苗圃感染了HLB,检出率为22.9... 详细信息

[目的]建立一套高效、准确的柑橘黄龙病(HLB)早期鉴定手段。[方法]根据HLBsecE基因(EF164805.1)保守区域设计引物和探针,建立HLB的TaqMan探针实时荧光PCR鉴定技术。[结果]被检测的236个柑橘苗圃样品中,有54个苗圃感染了HLB,检出率为22.9%。引物特异性好。[结论]该检测方法具有快速、灵敏、重复性好等优点,其检测灵敏度达0.01 ng。

关键词：柑橘黄龙病 TaqMan探针实时荧光PCR

Satb2基因实时荧光定量聚合酶链反应标准品的制备及应用研究

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汕头大学医学院学报 2008年第2期21卷 67-70页

作者：张丹方唐世杰毛小炎许金华彭立红汕头大学医学院第二附属医院唇腭裂中心广东汕头515041

目的:制备用于Satb2基因实时荧光定量聚合酶链反应(PCR)的标准品。方法:提取胚胎上颌突组织总RNA,行逆转录反应获得第一链的cDNA,再通过PCR回收获得预期Satb2基因片段;通过T-A克隆将该片段插入pGMT质粒载体;大量提取质粒,定量后进行标... 详细信息

目的:制备用于Satb2基因实时荧光定量聚合酶链反应(PCR)的标准品。方法:提取胚胎上颌突组织总RNA,行逆转录反应获得第一链的cDNA,再通过PCR回收获得预期Satb2基因片段;通过T-A克隆将该片段插入pGMT质粒载体;大量提取质粒,定量后进行标准曲线的制作和实时荧光定量PCR。结果:重组质粒经PCR扩增及序列测定表明,pGMT/Satb2基因已成功克隆。结论:所构建的pGMT/Satb2基因实时荧光定量PCR检测标准品应用taqman荧光探针技术建立的标准曲线线性关系好,灵敏度和特异性高,准确可靠,此法可作为实时荧光定量PCR检测Satb2基因的标准方法。

关键词：实时荧光定量聚合酶链反应标准品 TaqMan探针 Satb2基因

bcr-abl P210和abl基因实时荧光定量PCR检测共用质粒标准品的制备及应用

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白血病．淋巴瘤 2007年第3期16卷 161-164页

作者：江千里孟凡义江汕杨柳李冰宋兰林冯茹周淑芸南方医科大学南方医院血液科广东省血液病重点专科广州510515 南方医科大学南方医院创伤骨科广州510515

目的建立一个荧光实时定量PCR(RQ-PCR)共用质粒标准品,用于同时检测bcr-abl P210白血病融合基因和abl内参基因。方法分离K562细胞RNA,反转录为cDNA,以此为模板,设计引物进行PCR,PCR产物经琼脂糖电泳、胶回收,T-A载体克隆后,转化JM109工... 详细信息

目的建立一个荧光实时定量PCR(RQ-PCR)共用质粒标准品,用于同时检测bcr-abl P210白血病融合基因和abl内参基因。方法分离K562细胞RNA,反转录为cDNA,以此为模板,设计引物进行PCR,PCR产物经琼脂糖电泳、胶回收,T-A载体克隆后,转化JM109工程菌,抽提质粒、测序、测定拷贝/μl,冻存备用。以RQ-PCR和定性巢式PCR进行验证,检测23例CML患者的骨髓标本,并同bcr-abl基因荧光原位杂交(FISH)结果比较。结果获得了预期的模板质粒,以欧洲抗癌协会推荐的引物探针RQ-PCR检测bcr-abl P210和abl基因,浓度相同时,Ct值相同;反复检测日内差和日间差均<5%。23例标本按FISH结果≥10%(n=8)、0.5%～10%(n=6)和阴性(n=9)分组,RQ-PCR结果分为0.492±0.263、0.023±0.033和(4.33±3.84)×10^(-4);FISH阴性组和其余两组间P值均<0.001,三组间P值均<0.05。结论该研究建立了bcr-abl P210基因和abl基因共用的质粒标准品,定量准确,性质稳定,能简化操作,满足临床检测和科研的要求。

关键词：基因,bcr-abl 实时定量PCR 质粒白血病,髓样,慢性 TaqMan探针

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荧光定量PCR

生物技术世界 2008年第2期5卷 58-59页

作者：李亚萍（编译）

荧光定量PCR又可以分为TaqMan探针和SYBR Green I荧光染料两种方法。比较而言，探针杂交技术在原理上更为严格，所得数据更为精确，荧光染料技术则成本更为低廉，实验设计更为简便。也许作为确认微阵列数据的金标准，taqman有些名不副实... 详细信息

荧光定量PCR又可以分为TaqMan探针和SYBR Green I荧光染料两种方法。比较而言，探针杂交技术在原理上更为严格，所得数据更为精确，荧光染料技术则成本更为低廉，实验设计更为简便。也许作为确认微阵列数据的金标准，taqman有些名不副实。taqman与SYBR Green孰优孰劣？在选择实验方案时要根据实验目的，以及对数据精度的要求来决定。

关键词：荧光定量PCR TaqMan探针 Green SYBR 荧光染料杂交技术实验设计实验目的

实时RT-PCR检测二氢嘧啶脱氢酶mRNA的表达

维普期刊数据库评论

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检验医学 2005年第1期20卷 59-62页

作者：陆志成蔡刚沈茜上海市第七人民医院上海200137 第二军医大学附属长海医院检验科上海200433

　　目的　建立实时逆转录聚合酶链反应(RT PCR)检测二氢嘧啶脱氢酶mRNA的定量方法,并分别从 RNA水平与蛋白质水平检测二氢嘧啶脱氢酶在人体部分组织中的表达。方法　采用基于TaqMan探针技术的实时RT PCR方法检测二氢嘧啶脱氢酶mRN... 详细信息

　　目的　建立实时逆转录聚合酶链反应(RT PCR)检测二氢嘧啶脱氢酶mRNA的定量方法,并分别从 RNA水平与蛋白质水平检测二氢嘧啶脱氢酶在人体部分组织中的表达。方法　采用基于TaqMan探针技术的实时RT PCR方法检测二氢嘧啶脱氢酶mRNA的表达,用酶联免疫吸附试验(ELISA)方法检测其蛋白质表达水平。结果　实时RT PCR检测二氢嘧啶脱氢酶的线性范围可达102～109拷贝数/μl,批内误差<5%。结论　这一实时RT PCR的方法可以从纳克级的总RNA中检出二氢嘧啶脱氢酶的表达,并且ELISA结果与实时RT PCR 结果有较好的相关性。

关键词：二氢嘧啶脱氢酶蛋白质表达总RNA RT-PCR检测酶联免疫吸附试验(ELISA) 实时逆转录聚合酶链反应体部拷贝数 TaqMan探针蛋白质水平

猪流感病毒实时荧光定量RT-PCR检测方法的建立

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中国畜牧兽医 2012年第6期39卷 181-184页

作者：张太翔凌宗帅岳志芹徐彪梁成珠刘文鹏张焕海张艺兵潍坊出入境检验检疫局山东潍坊261041 济南出入境检验检疫局山东济南250014 山东检验检疫局山东青岛250023

本研究选取猪流感病毒(swine influenza virus,SIV)的NP基因序列设计引物和探针,建立了检测SIV的taqman实时荧光定量PCR方法。以梯度稀释的含有SIV目的扩增片段的质粒作为标准品,进行定量PCR反应以确定检测灵敏度。2.0×108至2.0×102拷... 详细信息

本研究选取猪流感病毒(swine influenza virus,SIV)的NP基因序列设计引物和探针,建立了检测SIV的taqman实时荧光定量PCR方法。以梯度稀释的含有SIV目的扩增片段的质粒作为标准品,进行定量PCR反应以确定检测灵敏度。2.0×108至2.0×102拷贝/μL 7个数量级的范围内定量PCR有"S"型扩增曲线,检测灵敏度为20个拷贝/μL。根据病毒拷贝数与Ct值的关系绘制了标准曲线。该方法具有特异性,对猪瘟病毒、伪狂犬病病毒、口蹄疫病毒和猪繁殖与呼吸综合征病毒核酸都没有扩增反应。本研究建立的实时定量PCR方法,灵敏度高、特异性好,可以进行定量分析,在猪流感的快速检测上具有重要意义。

关键词：猪流感病毒实时荧光定量PCR TaqMan探针

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鸭疫里默氏杆菌荧光定量PCR检测方法建立

中国家禽 2011年第10期33卷 65-65页

华南农业大学冯金牛等根据鸭疫里默氏杆菌（RA）16SrlKNA基因的保守序列设计特异性引物和TaqMan探针，建立了检测RA的实时荧光定量PCR方法。试验结果显示，该方法具有良好的特异性，DNA拷贝数在108～108范围内检测曲线有良好的线性关系... 详细信息

华南农业大学冯金牛等根据鸭疫里默氏杆菌（RA）16SrlKNA基因的保守序列设计特异性引物和TaqMan探针，建立了检测RA的实时荧光定量PCR方法。试验结果显示，该方法具有良好的特异性，DNA拷贝数在108～108范围内检测曲线有良好的线性关系，对质粒标准品的最低检测限为1．0x10^1copies／μL，重复性检测的变异系数低于5％，利用该方法分别对自然感染表现典型鸭疫里默氏杆菌临床症状和病理变化的死亡雏鸭肝、心、脑组织等不同脏器进行细菌定量检测，阳性率均为100％，而用普通PCIK检测阳性率分别只有72％、84％和92％。证明该研究所建立的荧光定量PCR方法具有敏感性高、特异性好、稳定性强的特点，可用于RA感染的快速诊断、流行病学调查以及鸭产品的检疫。

关键词： PCR检测方法鸭疫里默氏杆菌荧光定量 TaqMan探针特异性引物 PCR方法华南农业大学流行病学调查