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运用TaqMan探针实时荧光PCR技术检测AKAP10基因2073A/G单核苷酸多态性

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四川大学学报（医学版） 2009年第2期40卷 275-278页

作者：王默进周总光王玲李园张鹏张益崔长富周斌四川大学华西医院消化外科研究室成都610041

目的建立一套以TaqMan探针实时荧光PCR技术为基础的单核苷酸多态性（SNP）检测平台，并用于AKAPIO基因2073A／GSNP的检测。方法设计一对TaqMan探针加入到PCR反应系统中，并设立阴阳对照，对AKAPIO基因2073A／GSNP进行分型。同时验证部... 详细信息

目的建立一套以TaqMan探针实时荧光PCR技术为基础的单核苷酸多态性（SNP）检测平台，并用于AKAPIO基因2073A／GSNP的检测。方法设计一对TaqMan探针加入到PCR反应系统中，并设立阴阳对照，对AKAPIO基因2073A／GSNP进行分型。同时验证部分样本PCR产物的直接测序结果。结果运用TaqMan探针实时荧光PCR技术对AKAPIO基因2073A／GSNP检测结果准确，与PCR产物的直接测序结果完全一致。AKAPIO基因2073A／G多态性分布与性别年龄无关（P〉0．05）。非条件logistic回归分析提示，AKAP10基因2073A／G突变型（AG＋GG）与野生型AA相比增加结直肠癌的发生风险（OR=1．52，95％CI：1．07～2．15。P=0．019）。结论通过合理设计TaqMan探针，设立阴阳性对照，应用TaqMan探针实时荧光PCR技术成功建立起一套SNP检测平台。AKAP10基因2073A／G多态性与结直肠癌发病存在显著相关性。

关键词： TaqMan探针实时荧光PCR 单核苷酸多态性

牛腺病毒5型TaqMan探针实时荧光定量PCR检测方法的建立

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畜牧与兽医 2019年第8期51卷 101-104页

作者：安微陈世界王史张婧杨苗薛昌华余姓鸿林华四川出入境检验检疫局检验检疫技术中心四川成都610041 海南出入境检验检疫局检验检疫技术中心海南海口570100

建立针对牛腺病毒5型六邻体(Hexon)基因的实时荧光定量taqman PCR检测方法。根据牛腺病毒5型Hexon基因高度保守区设计引物和TaqMan探针,绘制标准曲线,对其灵敏度、特异性、重复性进行验证,建立牛腺病毒5型实时荧光定量taqman PCR快速检... 详细信息

建立针对牛腺病毒5型六邻体(Hexon)基因的实时荧光定量taqman PCR检测方法。根据牛腺病毒5型Hexon基因高度保守区设计引物和TaqMan探针,绘制标准曲线,对其灵敏度、特异性、重复性进行验证,建立牛腺病毒5型实时荧光定量taqman PCR快速检测方法。结果显示,构建的重组质粒pUC57-BAV5,标准曲线在10~2~10~7拷贝数之间有较好的线性关系,相关系数为0.975 2,建立检测方法的最低检测限为32拷贝/μL;应用建立的方法检测牛传染性鼻气管炎病毒、牛轮状病毒、牛呼吸道合胞体病毒无交叉反应;重复性试验表明,同一浓度的20个平行样品的变异系数为1.4%。牛腺病毒5型TaqMan探针荧光定量PCR方法具有灵敏度高、特异性强、重复性好等特点,可以用于牛腺病毒5型的快速、准确的检测。

关键词：牛腺病毒5型 Hexon基因 TaqMan探针荧光定量PCR

基于TaqMan探针和染料相结合的液滴数字PCR用于PIK3CA基因E545K三种基因型的检测

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基于Taqman探针和染料相结合的液滴数字PCR用于PIK3CA基因E545K三...

作者：江春大连医科大学

学位级别：硕士

目的:针对目前实时定量PCR（real-time quantitative PCR,qPCR）和液滴数字PCR（droplet digital PCR,ddPCR）只能检测已知突变位点的不足,尝试建立一种基于TaqMan探针和染料相结合的ddPCR方法用于检测未知突变序列,并应用该方法检测PIK... 详细信息

目的:针对目前实时定量PCR（real-time quantitative PCR,qPCR）和液滴数字PCR（droplet digital PCR,ddPCR）只能检测已知突变位点的不足,尝试建立一种基于TaqMan探针和染料相结合的ddPCR方法用于检测未知突变序列,并应用该方法检测PIK3CA基因E545K突变位点的三种基因型（野生型、杂合突变型和纯合突变型）。方法:本研究属于方法学研究,即先建立方法,然后与已有方法进行统计学分析比较,确定方法的可靠性。1.选择包含PIK3CA基因的野生型（MCF-7细胞）和杂合突变型（H460细胞）细胞系以及合成包含PIK3CA基因的纯合突变型双链DNA,针对PIK3CA基因E545K突变位点设计合成特异性引物及一对野生型（FAM标记）和突变型（VIC标记）探针。2.提取各细胞系的核酸,PCR扩增后测序扩增产物,确定各细胞系包含的PIK3CA基因E545K位点的基因型。3.实时定量PCR检测引物和探针的特异性,初步建立基于TaqMan探针和DNA结合染料（EvaGreen）联合使用的qPCR反应体系,并优化反应体系,使三种基因型纯样本之间的qPCR终荧光信号值差别最大,从而便于对三种基因型纯样本进行鉴别区分。4.理论上qPCR反应体系可以直接应用于ddPCR,但在实际实验中需要对体系的某些条件进行微调,然后以qPCR反应体系为基础,应用ddPCR建立和优化双探针法（野生型+突变型）与野生型探针联合EvaGreen染料的方法,用于PIK3CA基因E545K突变位点三种基因型的检测,确保能够从ddPCR结果图中清晰的区分不同基因型的液滴团。5.应用上述两种ddPCR方法对同时含有三种基因型的混合样本进行定量检测,分别得到三种基因型的拷贝数,对三组数据分别做配对样本均数的t检验,通过P值判断两种检测方法所得到的结果的差异是否具有统计学差异,验证方法的可靠性。结果:1.由染料法qPCR优化体系及PCR循环条件,得到最佳退火温度为62℃,此时体系扩增效率（amplification efficiency,E）E=0.918l。良好的扩增效率可降低ddPCR中各液滴之间因扩增效率不同导致的荧光信号差异和结果的不准确。2.采用qPCR双探针体系分别检测三种基因型纯样本,由扩增曲线可知探针特异性良好。3.初步建立了联合使用野生型探针和EvaGreen染料的qPCR体系,分别对等拷贝数的三种基因型纯样本进行扩增检测,优化后各样本间野生型探针（VIC）信号差值最大。4.基于ddPCR建立的双探针法体系,经优化可用于检测同时含有三种基因型的混合样本,包含不同基因型的液滴团可清晰区分。5.基于ddPCR建立的联合使用野生型探针和EvaGreen染料的体系,优化后也可检测同时包含三种基因型的混合样本,各基因型对应的液滴团清晰可分。6.应用ddPCR的双探针法和联合使用野生型探针和EvaGreen染料两种方法分别对同一组含有三种基因型的混合样本进行检测,分别得到三种基因型的拷贝数,分别对三组样本数据进行配对样本均数的t检验。野生型组:P=0.954＞0.05;杂合突变型组:P=0.451＞0.05;纯合突变型组:P=0.308＞0.05,说明两种检测方法差异无统计学意义。结论:成功建立了基于ddPCR联合使用TaqMan探针和染料检测PIK3CA基因E545K突变位点三种基因型的方法。该方法只使用野生型探针,可检测与此野生型探针序列不匹配的任何SNP或其他类型的突变,打破了普通双探针法只能对突变型探针所设计的已知突变位点进行检测的局限,有望降低多突变位点检测的成本,并用于突变的筛查。

关键词：液滴数字PCR TaqMan探针 EVA Green染料 PIK3CA基因 SNP

肺炎衣原体TaqMan探针实时荧光定量PCR检测法

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临床检验杂志 2016年第5期34卷 343-346页

作者：程永婷贾晓晖马良贾天军河北北方学院病原生物学与免疫研究所临床检验诊断学重点实验室河北张家口075000

目的针对Cpn0308基因建立检测肺炎衣原体的TaqMan探针实时荧光定量PCR(FQ-PCR)方法。方法根据肺炎衣原体包涵体膜蛋白Cpn0308基因序列设计引物和TaqMan探针,建立taqman FQ-PCR检测体系,对反应体系进行优化,进行灵敏度、特异性、重复性评... 详细信息

目的针对Cpn0308基因建立检测肺炎衣原体的TaqMan探针实时荧光定量PCR(FQ-PCR)方法。方法根据肺炎衣原体包涵体膜蛋白Cpn0308基因序列设计引物和TaqMan探针,建立taqman FQ-PCR检测体系,对反应体系进行优化,进行灵敏度、特异性、重复性评价;并与商品化肺炎衣原体核酸检测试剂盒检测临床标本进行对比分析。结果肺炎衣原体taqman FQ-PCR方法的引物浓度300 nmol/L,探针浓度200 nmol/L,Mg^(2+)4.0 mmol/L为最优反应条件;灵敏度为8.36×102copies/μL;该法对常见几种呼吸道病原菌及沙眼衣原体无交叉反应;重复性试验中4个浓度变异系数均小于3%。自建方法与商品化试剂盒对呼吸道感染组、心血管疾病组及正常对照组标本检出率分别为10%vs 10%(χ~2=0.167,P>0.05),44.44%vs 40.74%(χ~2=0,P>0.05),6.67%vs 3.33%(χ~2=0,P>0.05),各组阳性率间差异无统计学意义;2种方法的总阳性率(16.54%vs 14.96%)比较差异无统计学意义(χ~2=0.071,P>0.05)。结论本研究建立的TaqMan探针实时荧光定量PCR检测肺炎衣原体的方法灵敏度好,特异性高,重复性好,可应用于临床肺炎衣原体核酸检测。

关键词：肺炎衣原体 TaqMan探针实时荧光定量PCR Cpn0308

基于等位基因引物和TaqMan探针的结直肠癌KRAS基因检测qPCR的研究

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基于等位基因引物和Taqman探针的结直肠癌KRAS基因检测qPCR的研究

作者：刘享享齐鲁工业大学

学位级别：硕士

结直肠癌KRAS基因位于人体12号染色体的2号外显子（Exon）上,在膜受体到腺苷酸环化酶的信号转导中起着重要的作用。近年来,KRAS基因与抗EGFR抗体疗效具有相关性是结直肠癌的研究领域中最突出的成果。研究结果显示,只有KRAS未突变的患者... 详细信息

结直肠癌KRAS基因位于人体12号染色体的2号外显子（Exon）上,在膜受体到腺苷酸环化酶的信号转导中起着重要的作用。近年来,KRAS基因与抗EGFR抗体疗效具有相关性是结直肠癌的研究领域中最突出的成果。研究结果显示,只有KRAS未突变的患者,才推荐使用抗表皮生长因子受体（EGFR）单克隆抗体进行治疗。因此,靶向用药前的基因突变检测显得尤为重要。本研究拟建立一种经济、简便且灵敏度高的结直肠癌KRAS基因检测技术。通过基因克隆成功构建出7种常见的KRAS基因突变序列,并设计7种等位基因引物和共用TaqMan探针。单对引物检测构建成功的突变模板及等位基因引物和TaqMan探针的特异性。7对引物混合后加入TaqMan探针,利用qPCR分别检测构建成功的7种常见KRAS基因突变序列,搭建稳定的检测体系。对构建的混合等位基因引物和TaqMan探针qPCR检测体系进行分析性能测试:（1）结直肠癌KRAS野生型组织DNA为背景,将7种KRAS突变序列制备成相当于10%、1%、0.1%和0.01%突变浓度的样品。结果显示,最低检测限为0.1%。（2）结直肠癌KRAS野生型组织DNA为背景,分别检测含有5%KRAS三种同源基因序列（KRAS密码子12/13假基因序列、NRAS外显子2序列和HRAS外显子3序列）的样品,结果显示,未检出;结直肠癌KRAS野生型组织DNA分别与5%7种KRAS突变序列混合,在其各自5%同源基因序列存在下检测,结果显示,未产生交叉反应。提取结直肠癌KRAS野生型组织DNA时加入微生物,选取7种KRAS突变序列的任一种,制备成相当于0.1%突变水平的样本进行检测。结果显示,微生物存在和不存在的情况下,0.1%突变浓度下的检测结果均呈阳性。（3）在甘油三酯和牛血红蛋白存在下,分别提取结直肠癌KRAS野生型组织DNA,选取7种KRAS突变序列的任一种,制备成相当于0.1%突变水平的样本进行检测。结果显示,甘油三脂或牛血红蛋白存在和不存在的情况下,0.1%突变浓度下的检测结果均呈阳性,不影响实验结果的判定。选取18例结直肠癌患者石蜡包埋组织样本,其中,13例KRAS基因突变,5例KRAS基因野生状态,进行方法学比对。（1）与Sanger测序进行一致性评估:两种方法均检出13例阳性,5例阴性,总检出率为100%（13/13）,两种检测方法取得的结果完全一致。（2）重复性评估:任选一例KRAS基因突变组织样本,进行批内和批间的检测,CV值分别为1.6%和2.0%,显示出该实验方案具有较好的稳定性。本研究所构建的检测方法在结直肠癌KRAS基因检测中具有特异性强和灵敏度高,耗时短等特点,值得应用于临床样本检测。

关键词：结直肠癌 TaqMan探针 KRAS 基因突变实时荧光定量PCR

TaqMan探针技术用于X-SNP位点的分型

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法医学杂志 2010年第1期26卷 22-25页

作者：张素华李莉李成涛赵书民苏州大学医学部法医学系江苏苏州215123 司法部司法鉴定科学技术研究所上海市法医学重点实验室上海200063

目的建立一种基于TaqMan探针技术的快速、准确且经济的实时荧光PCR方法,用于检测X染色体上的单核苷酸多态性(single nucleotide polymorphism,SNP)。方法选择X染色体上的13个SNP位点(X-SNP),针对每个位点分别设计1对PCR引物和TaqMan探针... 详细信息

目的建立一种基于TaqMan探针技术的快速、准确且经济的实时荧光PCR方法,用于检测X染色体上的单核苷酸多态性(single nucleotide polymorphism,SNP)。方法选择X染色体上的13个SNP位点(X-SNP),针对每个位点分别设计1对PCR引物和TaqMan探针,进行实时荧光PCR扩增,对X-SNP位点进行分型。结果13个位点均符合Hardy-Weinberg平衡;多态信息含量分布为0.3497～0.3750,杂合度为0.4537～0.5021。建立的方法能够用于X-SNP位点的基因分型,检测结果与DNA测序结果完全一致。结论基于TaqMan探针技术的等位基因特异的实时荧光PCR方法灵敏、简单、快速,可实现对X-SNP位点的分型检测;所选择的13个X-SNP位点具有高信息量,在法医遗传学中具有潜在的应用价值。

关键词：法医遗传学多态性单核苷酸 X染色体 TaqMan探针

滩羊肥胖基因(OB)TaqMan探针SNP分型研究

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黑龙江畜牧兽医（下半月） 2017年第12期 71-72,292,293页

作者：马丽娜于洋宁夏农林科学院动物科学研究所银川750002

为了建立滩羊肥胖(OB)基因SNP高效分型的方法,试验采用TaqMan探针方法对398只滩羊OB基因进行SNP分型研究。结果表明:OB基因具有三种基因型,分别为XX(95%)、XY(4%)和YY(1%)。说明OB基因存在于滩羊中,且主要是以纯合子的状态。

关键词：滩羊 OB基因 TaqMan探针 SNP 基因型

TaqMan探针法荧光定量PCR检测鲜切甜瓜中单核细胞增多性李斯特菌的研究

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食品工业科技 2014年第19期35卷 297-300页

作者：关棣锴胡文忠朴永哲冯可大连工业大学食品学院辽宁大连116034 大连民族学院生命科学学院辽宁大连116600 大连理工大学生命科学与技术学院辽宁大连116024

根据多条单核细胞增多性李斯特菌的hly基因序列,设计了1对简并引物和1条TaqMan探针,建立荧光定量PCR快速检测单核细胞增多性李斯特菌的方法,对该方法的特异性、灵敏度进行了验证,并采用该法对染菌的鲜切甜瓜进行了检测。结果表明,该方... 详细信息

根据多条单核细胞增多性李斯特菌的hly基因序列,设计了1对简并引物和1条TaqMan探针,建立荧光定量PCR快速检测单核细胞增多性李斯特菌的方法,对该方法的特异性、灵敏度进行了验证,并采用该法对染菌的鲜切甜瓜进行了检测。结果表明,该方法具有较好的特异性,对质粒标准品的灵敏度为1.12×102copies/μL,对染菌的鲜切甜瓜中单核细胞增多性李斯特菌的最低检出限为6.28×102cfu/mL。该方法可为快速检测鲜切果蔬病原微生物污染度及其控制奠定技术基础。

关键词：单核细胞增多性李斯特菌 hly基因荧光定量PCR TaqMan探针鲜切甜瓜

ETA基因作为荧光定量PCR靶基因设计TaqMan探针快速检测铜绿假单胞菌的研究

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生物工程学报 2008年第4期24卷 581-585页

作者：肖性龙张经纬龚俊潘艳萍余以刚杨晓泉吴晖华南理工大学轻工与食品学院广州510640 深圳太太基因工程有限公司深圳518057

铜绿假单胞菌是临床上常见致病菌,传统的检测方法有各种弊端。本研究对该细菌的ETA基因用生物信息学方法加以分析,选取相对保守且高度特异的DNA序列,设计一对特异性引物和一个TaqMan探针,建立FQ-PCR (fluorescence quantitative PCR)检... 详细信息

铜绿假单胞菌是临床上常见致病菌,传统的检测方法有各种弊端。本研究对该细菌的ETA基因用生物信息学方法加以分析,选取相对保守且高度特异的DNA序列,设计一对特异性引物和一个TaqMan探针,建立FQ-PCR (fluorescence quantitative PCR)检测PA的方法。通过对梯度浓度的铜绿假单胞菌基因组DNA样品进行FQ-PCR检测和对多种细菌的DNA进行扩增,来检测其灵敏度和验证引物和探针的特异性。试验结果表明,对比现有的检测方法,以ETA基因为靶基因,基于TaqMan探针的快速FQ-PCR检测技术有更高的灵敏度和更好的特异性等优点,具有很好的研究价值和应用前景。

关键词：铜绿假单胞菌外毒素A 荧光定量PCR TaqMan探针检测