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STY及SPA的RT-pcr检测方法的建立

STY及SPA的RT-PCR检测方法的建立

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作者：肖燕佳木斯大学

学位级别：硕士

【目的】建立伤寒及甲型副伤寒沙门菌的实时荧光定量pcr检测法，具体包括：（1）伤寒沙门氏菌SYBR Green实时荧光定量pcr检测方法。（2）伤寒及甲型副伤寒沙门菌taqman实时荧光定量pcr检测方法。评价以上方法的特异性、敏感性、检测下... 详细信息

【目的】建立伤寒及甲型副伤寒沙门菌的实时荧光定量pcr检测法，具体包括：（1）伤寒沙门氏菌SYBR Green实时荧光定量pcr检测方法。（2）伤寒及甲型副伤寒沙门菌taqman实时荧光定量pcr检测方法。评价以上方法的特异性、敏感性、检测下限、以了解人群中对该菌的携带情况提高感染人群中伤寒及甲型副沙门氏菌的检出率。【方法】对建立伤寒及甲型副伤寒沙门菌的实时荧光定量pcr检测法，本研究采取以下实验方案：（1）经查阅资料后确定待测目的基因，并通过序列比对确定待检测基因的保守序列STY1633（Salmonella Typhi）及SPA4289（Salmonella enterica serovars paratyphiA），然后借助探针设计软件Beacon Designer7.7设计单重及双重实时荧光定量pcr引物和探针。（2）分别在1-10nmol/L10个浓度梯度和2-10nmol/L5个浓度梯度内，在美国Bio-Rad公司的CFX96荧光定量pcr仪上进行扩增比较，优化引物和探针浓度。（3）SYBR Green实时荧光定量pcr灵敏度、特异度的评价。（4）SYBR Green法检测粪便模拟标本中的伤寒沙门菌，评价其敏感性、特异度、检测下限、菌液增菌前后的检测下限。（5）单重taqman实时荧光定量pcr检测方法灵敏度、特异度的评价。（6）将优化了的单重实时pcr反应体系组合成双重taqman实时pcr反应体系，并评价其检测下限。【结果】（1）利用SYBR Green法检测粪便模拟标本中的伤寒沙门菌纯菌及10份伤寒患者标本均扩增阳性，其余的非伤寒沙门菌、致腹泻的其他5种肠道致病菌及引起发热症状的8种常见非肠道病原菌纯菌及相应患者标本均扩增阴性。在对纯伤寒沙门菌DNA检测中，实时荧光定量聚合酶链反应法的检测下限为500fg/反应，即97个拷贝/反应。以粪便模拟样品提取DNA为模板的检测中，增菌前检测下限达104cfu/g，增菌后可达50cfu/g。（2）在单重taqman实时荧光定量pcr法检测伤寒沙门菌的反应体系中，优化后的反应体系灵敏度和特异度均为100％。检测伤寒沙门菌纯菌DNA的检测下限为100fg/反应，即19.4个拷贝/反应,扩增效率为90%。以伤寒粪便模拟样品提取DNA为模板的检测中，增菌前检测下限即可达1cfu/g。单重taqman实时荧光定量pcr法检测甲型副伤寒沙门菌纯菌DNA的检测下限2.5pg/反应，即485个拷贝/反应，扩增效率为90%。以甲型副伤寒粪便模拟样品提取DNA为模板的检测中，增菌前达未检出，但增菌后检测下限可达10cfu/g。（3）经优化的伤寒和甲型副伤寒双重taqman实时荧光定量pcr反应体系中，对两种纯菌DNA的检测下限为分别为1pg/反应和2.5pg/反应，即194个拷贝/反应和485个拷贝/反应。对各自的粪便模拟样品的检测下限分别为：伤寒粪便模拟样品增菌前为102cfu/g，增菌后的检测下限是1cfu/g;甲型副伤寒粪便模拟样品增菌前为104cfu/g，增菌后的检测下限是10cfu/g。【结论】本研究建立了基于STY1633基因及SPA4289的实时荧光定量pcr方法。实验结果证明该检测法的特异度、灵敏度及检测下限均较理想。尤其在单重taqman实时荧光定量pcr法检测伤寒沙门菌其检测下限能达到19.4个拷贝/反应，高于普通pcr检测法的100-500倍。并且在双重taqman实时pcr法能够在一个反应体系中同时检测伤寒和甲型副伤寒两种菌。在检测粪便中的伤寒沙门菌中具有很好的特异性、灵敏度，为伤寒及甲型副伤寒沙门氏菌的诊断及其他原因不明发热或腹泻症状的病原初步鉴定提供了新的简便型手段，对于伤寒的早期诊断及预防控制提供了技术支持。

关键词：伤寒沙门菌实时荧光定量聚合酶链反应甲型副伤寒沙门菌 taqman实时荧光定量pcr检测方法

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3型猪源呼肠孤病毒的小RNA深度测序技术鉴定及其taqman qpcr检测方法建立和应用

3型猪源呼肠孤病毒的小RNA深度测序技术鉴定及其TaqMan qPCR检测...

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作者：武松山东北农业大学

学位级别：硕士

世界各地新发或再发传染病频繁发生,新型病毒出现的概率也随之增加,这对于传统的病毒检测手段提出了严峻挑战,需要改进相应的检测方法。由于传统病毒检测依赖于对病毒信息的了解,并且并非所有的病毒都可以进行分离培养,仅依赖传统病毒... 详细信息

世界各地新发或再发传染病频繁发生,新型病毒出现的概率也随之增加,这对于传统的病毒检测手段提出了严峻挑战,需要改进相应的检测方法。由于传统病毒检测依赖于对病毒信息的了解,并且并非所有的病毒都可以进行分离培养,仅依赖传统病毒检测方法鉴定未知病毒或新出现的病毒周期长、耗费较大量人力物力。小RNA深度测序技术属于二代测序技术,在对病毒没有了解的情况下便可以完成对未知病毒或者新型病毒的鉴定,并且有利于进一步建立该病毒的特异性诊断方法。哺乳动物呼肠孤病毒(MRV)在自然界分布广泛,人和动物感染MRV非常普遍,可引起呼吸道、肠道症状和心肌炎。动物源分离的MRV毒株与能够引起人类疾病的MRV毒株亲缘关系很近,对公共安全存在重大威胁。为了对MRV-3进行流行病学调查、病原诊断和防控提供技术支持,实现对MRV-3毒株检测监控。本研究通过小RNA深度测序技术对未知病毒样本小RNA测序共获得0.73G Reads,Q30在95.46以上;去除宿主的小RNA后,经组装和去冗余后该样品分别得到758条病毒uniq contig序列;病毒contig序列比对核酸和蛋白库数据库,得到了234条病毒contig。最终检测出了19条病毒序列,11条为MRV(其中MRV-1、MRV-2、MRV-3和MRV-4分别为1、3、6和1条),其余8条分别为α乳头瘤病毒、鲤疱疹病毒、巨细胞病毒、慢病毒、绵羊疱疹病毒、蓝舌病毒、副流感病毒和猪瘟病毒。由于MRV的S1基因决定血清型,所以本研究选择MRV-3的S1基因985～1130 bp处设计引物和taqman探针,构建阳性质粒标准品,建立了针对MRV-3毒株的taqman RTqpcr检测方法。结果显示Ct值与阳性质粒标准品浓度在1.50×107～1.50×100 copies/μL范围内呈良好的线性关系,相关系数(R2)为0.994;该方法最适引物浓度和taqman探针浓度分别为0.4μmol/L和0.2μmol/L;特异性实验结果表明此方法仅对MRV-3毒株进行扩增;本研究建立的taqman RT-qpcr敏感性优于常规pcr,其最低检测浓度达到1.50×10-1 copies/μL;重复性实验证明本方法重复性和稳定性好;通过临床样品的检测证明了本研究建立的检测方法效果较好,优于国标T/CALAS 50-2017所推荐的常规pcr和传统pcr方法,可以用于临床检测。综上所述,本文应用小RNA深度测序技术快速对临床样品进行病毒的鉴定,在此基础上建立了MRV-3毒株的taqman RT-qpcr检测方法,该方法特异性强、灵敏度高、稳定性好,为检测MRV-3病毒株提供了技术手段。

关键词：哺乳动物呼肠孤病毒小RNA深度测序技术小RNA taqman实时荧光定量pcr检测方法

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