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tufm对GIST-T1细胞生物学特性的影响

TUFM对GIST-T1细胞生物学特性的影响

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作者：翁晓源福建医科大学

学位级别：硕士

目的:胃肠间质瘤(Gastrointestinal stromal tumor,GIST)是消化道间叶源性肿瘤中最常见的疾病病理类型。患者面临着早期血行转移、术后复发、临床预后差等诸多问题;甲磺酸伊马替尼(Imatinib Mesylate,IM)是应用于治疗原发不可切除或转... 详细信息

目的:胃肠间质瘤(Gastrointestinal stromal tumor,GIST)是消化道间叶源性肿瘤中最常见的疾病病理类型。患者面临着早期血行转移、术后复发、临床预后差等诸多问题;甲磺酸伊马替尼(Imatinib Mesylate,IM)是应用于治疗原发不可切除或转移复发GIST患者目前最常用的靶向治疗药物;IM主要获益在于可延长丧失手术切除机会的GIST患者中位生存期;但在IM靶向治疗过程中,患者对IM等靶向药物产生的耐药现象成为目前治疗GIST的难题,并最终导致GIST再度进展,缺乏有效治疗手段,预后不良。线粒体蛋白质翻译延伸因子Tu(mitochondrial Tu translation elongation factor,tufm)在多种肿瘤组织及GIST上发现存在的高表达,并有研究表明其与肿瘤发生、发展、耐药形成过程及预后相关。本研究通过沉默GIST-T1及由IM诱导继发耐药细胞株GIST-IR细胞中tufm基因,进而探索tufm在GIST发生、发展及耐药过程中机制及对相关的细胞生物学特性的影响,为治疗GIST及逆转IM耐药GIST提供新线索。方法:1.构建tufm沉默质粒,体外转染胃肠间质瘤细胞GIST-T1及其耐药细胞GIST-IR。应用RT-PCR检测tufm相对表达量,评价干扰效果。2.通过电转染方法将tufm沉默质粒体外转染至GIST-T1及其耐药细胞GIST-IR,倒置荧光显微镜评估转染效率及观察细胞形态变化;3.通过细胞计数和CCK-8法观察比较tufm沉默对GIST-T1与GIST-IR细胞增殖的影响;4.通过细胞划痕实验及Transwell迁移实验观察tufm沉默对GIST-T1与GIST-IR细胞迁移能力的影响;5.通过CCK-8法计算细胞半数抑制浓度并绘制IC50曲线,观察GIST-IR细胞tufm沉默后对IM药物敏感性的影响;6.通过流式细胞周期检测,观察tufm沉默后GIST-T1与GIST-IR细胞周期及晚期凋亡的影响。结果:1.RT-PCR检测胃肠间质瘤细胞GIST-T1及GIST-IR中转染tufm沉默质粒后tufm表达情况。RT-PCR数据统计结果:GIST-T1 tufm沉默后细胞中tufm的表达量明显低于阴性对照质粒组和空白对照组(Ptufm沉默组、阴性对照组、空白组之间无明显差别。3.细胞计数法及CCK-8法检测GIST-T1和GIST-IR在tufm沉默后细胞增殖及活力。细胞计数法连续细胞计数GIST-T1和GIST-IR tufm沉默组、阴性对照组细胞6天显示:tufm沉默组GIST-T1增殖细胞计数约为24×104个,阴性对照组为30×104个。GIST-IR tufm沉默组细胞计数约为24×104个,阴性对照组为17×104个,阴性对照组、空白对照组细胞计数无明显差别(Ptufm后对GIST-T1和GIST-IR细胞迁移特性的影响。划痕实验结果显示:GIST-T1和GIST-IR沉默组细胞侧向迁移能力降低,划痕后48小时明显。5.Transwell小室迁移实验研究GIST-T1和GIST-IR细胞体外纵向迁移能力。Transwell小室背膜迁移细胞统计结果:在tufm沉默后GIST-T1沉默组穿过小室背膜细胞数明显减少,细胞纵向迁移能力明显下降。Transwell小室背膜伊红染色,统计小室背膜的迁移细胞,沉默组小室背面每视野细胞数为(47.0±2.8),阴性对照组每视野细胞数为(84.8±4.8)。tufm沉默后GIST-IR沉默组穿过小室背膜细胞数明显减少,细胞纵向迁移能力明显下降。Transwell小室背膜伊红染色,统计小室背膜的迁移细胞数,GIST-IR沉默组小室背面每视野细胞数为(30.8±3.8),阴性对照组每视野细胞数为(66.7±7.9)。GIST-T1和GIST-IR沉默组细胞数目明显少于阴性对照组,差异具有统计学意义(P0.05)。6.流式细胞术检测GIST-T1和GIST-IR

关键词： tufm 胃肠间质瘤耐药细胞株甲磺酸伊马替尼

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tufm在膀胱癌中的表达及对T24细胞生物特性的影响

TUFM在膀胱癌中的表达及对T24细胞生物特性的影响

引用

作者：何成武南方医科大学

学位级别：硕士

研究背景膀胱癌是我国泌尿系统中最常见的恶性肿瘤,其发病率和死亡率呈逐年上升趋势,严重威胁人类健康。根据其浸润深度,主要分为浅表性膀胱癌及浸润性膀胱癌,其中尿路上皮癌约占90%[1]。膀胱肿瘤的治疗手段仍然采用手术为主放化疗为... 详细信息

研究背景膀胱癌是我国泌尿系统中最常见的恶性肿瘤,其发病率和死亡率呈逐年上升趋势,严重威胁人类健康。根据其浸润深度,主要分为浅表性膀胱癌及浸润性膀胱癌,其中尿路上皮癌约占90%[1]。膀胱肿瘤的治疗手段仍然采用手术为主放化疗为辅的治疗方案,但其疗效仍不确定,诊断为浸润性BCa患者术后2年内约有50%的患者出现复发、转移,5年生存率仅有27%-50%,因发生转移而未能及时手术切除,其中位生存期为7-20个月[2]。膀胱癌的早期诊断及术后复发成为影响治愈率及改善患者生活质量的关键因素。目前,评估膀胱癌患者肿瘤进展及预后主要是根据术后病理分级及临床分期[3]。然而,由于在相同病理分级及临床分期的膀胱癌患者中,呈现多样化的临床预后。这可能与肿瘤相关基因表达差异相关,而膀胱癌分子生物学的发展及靶向基因的发现将为膀胱癌提供新的治疗策略。通过对人体的遗传物质进行修正、补充或改造,即可达到治疗疾病的目的,即“基因治疗”(gene therapy)。随着遗传学和分子生物学的进展以及基因的发现,人类基因治疗已成为现实。在膀胱肿瘤基因治疗的研究上,人们也取得了许多重要的成果。近年来,线粒体蛋白质翻译延伸因子Tu(mitochondrial Tu translation elongation factor, tufm)在肿瘤发生进展中的作用及机制逐渐成为研究热点。运用蛋白质组学的方法,发现tufm基因在人膀胱癌[4]、胃癌[5]、胰腺癌[6-7]、结直肠癌[8]、食管鳞状细胞癌[9]、卵巢癌[10]等肿瘤细胞株或组织中呈高表达,其中tufm的表达水平与胃癌及结直肠癌的临床分期和预后相关。tufm蛋白在胃腺癌组织中不表达或低表达的患者临床分期一般较高,术后生存率较低,预后较差[8];而结直肠癌组织中tufm高表达的患者进展较快,5年内肿瘤复发率较高[9],提示在tufm在不同肿瘤中表达不同,从而得出了不同的结论。尽管相关蛋白质组学研究发现tufm蛋白在大部分肿瘤中呈高表达,并与胃癌和结直肠癌临床预后相关,但其在肿瘤发生进展中的作用机制及该蛋白对肿瘤细胞生物学特性的影响仍不清楚。而且,tufm在膀胱癌中的表达及其对膀胱癌细胞生物学功能特性的影响并不清楚。本研究首次探讨tufm基因在膀胱癌中的表达,成功建立tufm低表达细胞系,之后通过相关方法检测,进一步研究了沉默tufm基因后对膀胱癌细胞株生物特性的影响。研究目的探讨tufm基因在膀胱癌组织及细胞中的表达,探讨靶向沉默tufm基因后对膀胱癌T24细胞生物功能的影响。方法本研究分为两部分：一、检测tufm基因在膀胱癌组织及细胞中的表达 1. tufm基因在膀胱癌患者组织标本中的表达检测膀胱癌及其配对癌旁正常组织来自在南方医院泌尿外科住院行TURBT或膀胱癌根治术的患者,经南方医院伦理委员会批准,获得患者知情同意。取得的膀胱上皮粘膜组织标本经南方医院病理科鉴定证实为膀胱尿路上皮癌组织,然后小组织放入冻存管,放入液氮后,-80℃冰箱保存备用。根据病理诊断分为浸润性尿路上皮癌组、高级别非浸润性尿路上皮癌组、低级别非浸润性尿路上皮癌组和癌旁组织组,应用免疫组化和实时定量PCR检测27例膀胱癌及癌旁组织中tufm的表达水平,研究其与病理分级、临床分期之间的相关性。 2. tufm基因在膀胱癌细胞及膀胱上皮永生化细胞中的表达检测收集两株人源膀胱癌细胞(T24、UMUC-3)和膀胱上皮永生化细胞SV-HUC-1,用TRIzol提取总RNA,去DNA,逆转录,实时定量PCR检测三株细胞中tufm的表达水平,比较两株人源膀胱癌细胞与膀胱上皮永生化细胞的表达差异,并据此选取细胞株进一步研究。二、沉默tufm基因后对膀胱癌T24细胞生物功能影响的检测 1.tufm基因低表达细胞系的建立及转染效率的检测。选取对数生长期的T24细胞株分为三组,分别为干扰组、阴性对照组、空白对照组,其中干扰组用RNAi的方法,应用脂质体Lipo2000,将特异性siRNA干扰片段转入细胞,沉默膀胱癌T24细胞tufm基因的表达;阴性对照组细胞用相同方法转染阴性对照片段;空白对照组则不作任何处理。48小时后用实时定量PCR检测干扰及阴性对照组干扰片段的转染效率。 2.沉默tufm基因后对膀胱癌T24细胞增殖、迁移、凋亡及细胞周期的检测。 MTT法检测T24细胞的增殖。应用MTT实验检测三组细胞的抑制率,绘制细胞生长曲线,评价沉默tufm基因后对T24细胞增殖能力的影响。划痕实验和Transwe11迁移实验检测各组细胞的迁移能力,评价沉默tufm基因后对T24细胞迁移能力的影响。选用Annexin V-FITC细胞凋亡实验和DeadEnd TM比色法凋亡检测转染后T24细胞的凋亡。流式检测仪检测转染后T24细胞周期的影响。结果第一部分 1.共收集膀胱癌组织标本27例,浸润性尿路上皮癌组7例、高级别非浸润性尿路上皮癌组7例、低

关键词： tufm 膀胱癌小干扰 RNA 凋亡线粒体

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tufm通过ROS参与阿尔兹海默病的病理改变

TUFM通过ROS参与阿尔兹海默病的病理改变

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作者：钟碧柔重庆医科大学

学位级别：硕士

线粒体翻译延伸因子（tufm或EF-Tu）通过线粒体翻译参与了线粒体呼吸链蛋白的合成和细胞内氧化应激。研究显示,阿尔茨海默病（Alzheimer’s disease,AD）患者大脑中tufm的表达降低,提示tufm可能在AD病理生理过程中发挥作用。本研究探讨... 详细信息

线粒体翻译延伸因子（tufm或EF-Tu）通过线粒体翻译参与了线粒体呼吸链蛋白的合成和细胞内氧化应激。研究显示,阿尔茨海默病（Alzheimer’s disease,AD）患者大脑中tufm的表达降低,提示tufm可能在AD病理生理过程中发挥作用。本研究探讨了tufm参与AD病理改变的机制。我们首先验证了老年AD小鼠（APP/PS1）海马和皮层中tufm蛋白水平下降。其次在稳定表达人β-淀粉样蛋白前体（HEK-APP）的HEK细胞中,沉默tufm增加了β-淀粉样蛋白（Aβ）并降低β-淀粉样转化酶1（BACE1）的蛋白水平;而过表达tufm产生相反效果。tufm对BACE1的调控作用分别被翻译抑制剂环己酰亚胺（CHX）和α-[2-[4-（3,4-二氯苯基）-2-噻唑基]肼基亚叉]-2-硝基苯丙酸（4EGI1）所阻断,并依赖于BACE1 5’非翻译区（5’UTR）。另外,沉默tufm增加了BACE1 m RNA半衰期,提示tufm影响BACE1m RNA的稳定性。tufm对m RNA稳定性的影响不受转录抑制剂Actinomycin D（Act D）和沉默核因子κB（NFκB）调控,进一步提示翻译机制。鉴于tufm影响线粒体功能和细胞内活性氧（ROS）水平,我们进一步验证了靶向于线粒体的抗氧化剂TEMPO的干预效果。在TEMPO处理的细胞中,tufm对BACE1的影响受到抑制;并与细胞内沉默或过表达tufm后观察到的ROS的水平一致。TEMPO还抑制了tufm对凋亡和磷酸化Tau的调节。概括起来,本研究在验证APP/PS1小鼠中tufm蛋白水平降低的基础上,发现tufm通过调控BACE1翻译、细胞凋亡和Tau磷酸化参与了AD的病理过程,其中ROS发挥了重要作用。

关键词： tufm BACE1翻译活性氧 β-淀粉样蛋白 Tau

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