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trpv4参与急慢性瘙痒及升麻素止痒机制研究

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TRPV4参与急慢性瘙痒及升麻素止痒机制研究

作者：严津津南京中医药大学

学位级别：硕士

研究背景:瘙痒是一种令人不快的皮肤感觉,常伴发抓挠行为。从啮齿动物、鸟类到人类,广泛的物种都存在瘙痒感和抓挠行为。虽然急性瘙痒具有清除刺激性物质以避免进一步损伤的保护作用,但慢性瘙痒往往作为全身疾病伴随的症状,严重影响人... 详细信息

研究背景:瘙痒是一种令人不快的皮肤感觉,常伴发抓挠行为。从啮齿动物、鸟类到人类,广泛的物种都存在瘙痒感和抓挠行为。虽然急性瘙痒具有清除刺激性物质以避免进一步损伤的保护作用,但慢性瘙痒往往作为全身疾病伴随的症状,严重影响人们生活质量。它与许多疾病有关,包括特应性湿疹、银屑病、炎症性皮肤病、慢性肾功能衰竭、胆汁淤积症等。目前,慢性瘙痒仍然缺乏普遍有效的治疗方法,过去的二十年中,人们致力于在分子、细胞和动物水平上阐明瘙痒的机制。有越来越多的证据表明,瞬时受体电位（Transient Receptor Potential,TRP）通道在瘙痒信号传递中起着重要作用。在TRP家族中,除了已被广泛研究的与瘙痒密切相关的瞬时感受器香草酸受体1（Transient Receptor Potential Vaniloid 1,trpv1）和瞬时感受器电位锚蛋白 1（Transient Receptor Potential Ankyrin 1,TRPA1）,还存在其他的通道在急慢性瘙痒中起着不可或缺的作用,瞬时感受器香草酸受体4（Transient Receptor Potential Vaniloid 4,trpv4）就是其中一员。有报道称trpv4参与急慢性瘙痒,但对参与瘙痒的途径仍存在争议,如何参与痒觉传递亟需进一步探索。升麻素（cimifugin）为常用止痒中药防风的色原酮类成分,防风具有祛风解表、胜湿解痉等功效,可治外感表征、风疹瘙痒等病症。而升麻素作为其活性成分,也被报道有抑菌、抗病毒等作用。本课题主要通过检测到人类皮肤中trpv4表达水平与银屑病的严重程度密切相关,建立小鼠急慢性瘙痒模型进一步探索trpv4通道在痒觉发生中的作用,并观察升麻素对其介导的瘙痒模型的止痒效果,为临床提供有效的潜在止痒药物靶点和潜在止痒药物。研究目的:探究trpv4如何参与急慢性瘙痒及升麻素止痒作用机制研究。研究方法:1.临床银屑病患者瘙痒皮肤病理切片经HE染色后,观察表皮增生的情况,免疫荧光染色实验检测trpv4的表达情况。2.行为学实验:（1）在WT小鼠和trpv4-/-小鼠颈背部皮内注射致痒源,探究trpv4参与瘙痒的途径及升麻素的止痒作用。（2）在小鼠剃毛的背部皮肤上局部施用5%咪喹莫特乳膏,连续5天,诱导银屑病模型,探究trpv4在慢性瘙痒中的作用及升麻素对银屑病瘙痒的治疗作用。3.机制研究:使用实时定量PCR技术、免疫荧光染色实验及Western Blot实验,检测trpv4在小鼠银屑病造模区皮肤和DGR中的表达情况。5.细胞实验:（1）利用传代培养的人角质形成（HaCaT）细胞,通过钙成像技术研究升麻素对人角质形成细胞中trpv4离子通道活性的作用。（2）利用WT小鼠急性培养的DRG神经元,通过钙成像技术研究升麻素对小鼠DRG中trpv4离子通道活性的作用。（3）在HEK293细胞中转染trpv4的质粒,通过钙成像技术研究升麻素对trpv4离子通道是否直接作用。（4）在HEK293细胞中转染trpv4的质粒,通过全细胞膜片钳技术研究升麻素对trpv4离子通道活性的作用。研究结果:（1）银屑病患者瘙痒皮肤组织病理学观察显示皮肤屏障功能障碍和角质形成细胞增殖的特征,人类皮肤中trpv4的表达水平与银屑病的严重程度密切相关。（2）trpv4是痒觉发生所必需的,它参与五羟色胺依赖的瘙痒,也参与组胺依赖的瘙痒,但与氯喹介导的瘙痒无关。（3）trpv4与小鼠银屑病慢性模型中的瘙痒行为的发生密切相关,trpv4-/-小鼠银屑病造模后,抓挠行为显著减少。（4）小鼠银屑病慢性模型中,造模区所对应的皮肤和DRG中trpv4表达增加。（5）升麻素能抑制trpv4介导的急性瘙痒行为,但不能抑制五羟色胺或组胺介导的急性瘙痒行为。（6）升麻素能缓解小鼠银屑病慢性模型中的瘙痒行为,也能抑制银屑病引起的trpv4的表达增加。（7）升麻素能抑制人角质形成细胞以及小鼠DRG神经元中trpv4的功能;升麻素能抑制转染trpv4质粒的HEK293细胞中GSK101引起的钙离子内流和内向电流;其对trpv4的抑制作用是直接的。研究结论:1.人类皮肤中trpv4的表达水平与银屑病的严重程度密切相关。2.trpv4参与小鼠急慢性瘙痒。3.升麻素抑制trpv4介导的小鼠急性瘙痒。4.升麻素可以抑制小鼠银屑病慢性模型诱导的瘙痒行为并抑制银屑病慢性模型引起的trpv4的表达升高。5.升麻素对可以抑制HaCaT细胞及小鼠DRG中trpv4的活性并直接抑制HEK293T转染细胞的trpv4活性。

关键词： trpv4 银屑病升麻素人角质形成细胞背根神经节

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trpv4对脑血管平滑肌增殖及凋亡的影响

中风与神经疾病杂志 2017年第8期34卷 721-724页

作者：冯辉臧莉赵振霞新乡医学院第一附属医院神经内五科河南新乡453100

目的探究新型钙离子通道香草醛受体4(transient receptor potential vanilloid receptor,trpv4)对自发性高血压(spontaneously hypertensive rats,SHR)大鼠脑血管平滑肌增殖及凋亡的影响。方法分离并培养大鼠脑基底动脉平滑肌细胞(basilar arterial smooth muscle cells,BASMCs),采用实时定量聚合酶链式反应(qRT-PCR)及免疫印迹(Western blot)法检测细胞中trpv4的表达。转染trpv4 siRNA沉默trpv4基因,CCK-8检测细胞增殖、流式细胞术检测细胞周期及凋亡;Western blot检测cyclin D1、p-Rb、Bcl-2、cleaved-caspase-3/caspase-3、p-AKT/AKT、p-GSK3β/GSK3β蛋白表达。结果 qRT-PCR及Western blot结果显示自发性高血压大鼠BASMCs中trpv4的表达明显高于对照组大鼠。而在自发性高血压大鼠BASMCs中,沉默trpv4可抑制细胞增殖,阻滞细胞周期并诱导其凋亡;此外还可下调cyclin D1、p-Rb、Bcl-2、p-AKT、p-GSK3β蛋白的表达,同时上调cleaved-caspase-3蛋白的表达。结论沉默trpv4能够抑制自发性高血压大鼠BASMCs细胞增殖,同时促进细胞凋亡,机制可能与抑制AKT/GSK3β信号通路的激活有关,所以新型钙离子通道trpv4可为今后靶向诊疗高血压脑血管疾病提供依据。

关键词： trpv4 脑血管平滑肌细胞细胞增殖及凋亡 AKT/GSK3β信号通路

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trpv4通道及其与疾病关系的研究进展

生命的化学 2018年第6期38卷 809-814页

作者：吴静程全艺杨梦成张世忠三峡大学医学院宜昌443002

瞬时受体电位香草素受体4型通道蛋白(transient receptor potential vanilloid 4, trpv4)是瞬时受体电位离子通道的成员之一,属于非选择性阳离子通道。trpv4广泛分布于心、大脑、肾、肝、肺、胰腺、卵巢、骨组织以及皮肤表面,可被机械... 详细信息

瞬时受体电位香草素受体4型通道蛋白(transient receptor potential vanilloid 4, trpv4)是瞬时受体电位离子通道的成员之一,属于非选择性阳离子通道。trpv4广泛分布于心、大脑、肾、肝、肺、胰腺、卵巢、骨组织以及皮肤表面,可被机械刺激、低渗透压、佛波酯衍生物等理化刺激激活,并参与体内多种疾病的病理生理过程。文章主要介绍了trpv4的结构特点、生理功能及其与心血管、呼吸、消化、运动及肿瘤等相关疾病的关系的最新进展。

关键词： trpv4 心血管疾病呼吸系统疾病消化系统疾病运动系统疾病肿瘤

trpv4在肝脏肿瘤中的表达及其与肝癌发展关系的研究

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TRPV4在肝脏肿瘤中的表达及其与肝癌发展关系的研究

作者：霍天宇山西医科大学

学位级别：硕士

目的:在我国原发性肝癌是一种常见的恶性程度较高的肿瘤,其高发病率和低生存率的特点严重危害了我国人民的生命财产安全。因此通过探索原发性肝癌发生发展的机理,从中选择关键位点可能为今后的治疗提供选择。本实验旨在通过分析trpv4通... 详细信息

目的:在我国原发性肝癌是一种常见的恶性程度较高的肿瘤,其高发病率和低生存率的特点严重危害了我国人民的生命财产安全。因此通过探索原发性肝癌发生发展的机理,从中选择关键位点可能为今后的治疗提供选择。本实验旨在通过分析trpv4通道蛋白在肝脏常见的良恶性疾病中的表达情况,研究其不同程度的表达对肝癌细胞肿瘤学特性的影响,揭示其在肝细胞癌发展中可能存在的作用。方法:1、收集自2012年8月至2017年8月于山西医科大学第一医院因各种疾病行肝脏手术的病理标本及临床资料。通过免疫组化方法研究trpv4在肝脏常见的良恶性疾病中的表达情况,并分析其表达情况与对应患者病例资料间的关系。2、在肝癌Huh-7、HepG-2细胞株中进一步检测trpv4基因及蛋白表达情况并与正常人肝细胞LO2细胞株中对比;在肝癌细胞株细胞株中利用小干扰RNA（si-trpv4）转染及非选择性阻滞剂钌红阻滞等技术调控、消耗蛋白的表达,进一步检测低蛋白表达的肝癌细胞株其增殖、侵袭迁移等方面的变化,并与未处理肝癌细胞株对比。结果:1、免疫组化显示trpv4在肝血管瘤与肝硬化的表达差异（c~2=10.407,P=0.001）、trpv4在肝血管瘤与肝细胞癌（c~2=14.005,P＜0.001）的表达差异有统计学意义,提示trpv4对肝脏良恶性疾病的发生过程中可能存在不同程度或不同机制的作用;结果显示trpv4通道蛋白在肝细胞癌与癌旁肝组织的表达差异有统计学意义（c~2=5.082,P=0.024）,提示其在肝癌发生过程中可能存在作用。免疫组化结果结合临床资料数据分析显示:trpv4的表达差异可能与肿瘤分化程度有关（P=0.025）,trpv4表达差异可能与肝血管瘤大小有关（P=0.019）,由于数据较少,还需要进一步验证。2、对肝癌Huh7、HepG-2细胞株分别进行小干扰RNA（si-trpv4）转染及钌红（RuR）阻滞,经Western blot检测结果可以看出,两种技术都抑制了trpv4通道蛋白的表达;通过CKK-8、Transwell试验,提示trpv4蛋白通道的表达差异可能在肝癌增殖、迁移的过程中起作用,对肝癌细胞的迁移作用尤为明显。结论:trpv4通道蛋白在肝脏不同的良恶性疾病在有着不同程度的表达,且在肝脏恶性肿瘤与癌旁组织中的表达差异有统计学意义,提示其在肝癌发生过程中可能存在作用。对Huh7、HepG-2两种肝癌细胞株的实验提示trpv4蛋白通道的表达差异可能在肝癌增殖、迁移的过程中起作用。trpv4通道蛋白的差异表达可能推进了肝癌的发生与发展,明确trpv4的表达在肝癌发生发展过程中所起的作用可能有助于原发性肝癌的治疗及预后,但仍然需要进一步的蛋白质组学、基因组学、动物及临床试验等证实trpv4通道蛋白在肝细胞癌中可能发挥的作用。

关键词： trpv4 肝细胞癌阻滞迁移

Phosphorylation on trpv4 Serine Residue 824 Enhances Its Association with PGM1

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American Journal of Molecular Biology 2016年第1期6卷 33-44页

作者： Sung Hwa Shin Eun Jeoung Lee Sunghee Hyun Sang Sun Kang Department of Biology Education Chungbuk National University Cheongju Republic of Korea Department of Internal Medicine Chungbuk National University Cheongju Republic of Korea Department of Biomedical Laboratory Science Eulji University Daejeon Republic of Korea

The trpv4 cation channel is expressed in a broad range of tissues and participates in the generation of a Ca2+ signal and/or depolarization of membrane potential. Here, human phosphoglucomutase- 1 (PGM1), an enzyme that converts glucose-6 phosphate to glucose-1 phosphate in the glycolysis pathway, as the first auxiliary protein of trpv4 Ca2+ channels, is identified with yeast two hybrid system, coimmunoprecipitation, confocal microscopy, and GST pull-down assays. trpv4 forms a complex with PGM1 through its C-terminal cytoplasmic domain. Because it is demonstrated that trpv4 serine residue 824 (S824) is phosphorylated by serum/glucocorticoid regulated kinase 1, we elucidate the effect of trpv4 S824 phosphorylation on trpv association with PGM1. Even an inactivated mutant version of trpv4, S824A, exhibited a decreased ability to bind PGM1, an activated phosphomimetic mutant version of trpv4, S824D, exhibited enhanced binding to PGM1. Thus, formation of the trpv4/PGM1 complex and localization of this complex to the plasma membrane appear to be regulated by the phosphorylation status of residue S824 in trpv4. The newly identified interactor of trpv4 may help the molecular pathways modulating transport activity or glucose metabolism, respectively.

关键词： Membrane Localization Phosphoglucomutase1 Phosphorylation Protein-Protein Interaction trpv4

trpv4对结肠上皮屏障功能的影响及其机制研究

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TRPV4对结肠上皮屏障功能的影响及其机制研究

作者：李静安徽医科大学

学位级别：硕士

背景溃疡性结肠炎(Ulcerative colitis,UC)是以免疫反应和黏膜损伤为特征的肠道炎症性疾病。有研究表明,肠屏障功能损伤是UC发生发展过程中的重要因素,可导致细胞间隙通透性增加,细菌、内毒素及大分子物质容易穿过粘膜屏障诱导局部免疫... 详细信息

背景溃疡性结肠炎(Ulcerative colitis,UC)是以免疫反应和黏膜损伤为特征的肠道炎症性疾病。有研究表明,肠屏障功能损伤是UC发生发展过程中的重要因素,可导致细胞间隙通透性增加,细菌、内毒素及大分子物质容易穿过粘膜屏障诱导局部免疫功能紊乱,从而加重病理损伤。紧密连接蛋白的差异表达可导致紧密连接功能的障碍。最近研究发现在实验性结肠炎中Claudin-1、Claudin-3、Claudin-4、Claudin-5、Claudin-7和Claudin-8的表达下调。然而,这些研究都不足以证实Claudin表达的下调是导致UC产生的原因还是UC病变导致的结果。最近有文献报道,上皮细胞的屏障功能不仅与某些紧密连接蛋白的差异表达有关,其磷酸化修饰所导致的紧密连接蛋白变构、胞吞和极性改变也是影响其功能的重要因素。其中,紧密连接蛋白某些基团适度的磷酸化是维持其功能的必要条件,但异常的磷酸化会改变它们之间的结合方式,影响聚集和结构稳定性,导致跨上皮阻抗和上皮间隙通透性的改变,从而影响上皮屏障功能。国内外研究也表明,肠粘膜屏障功能与某些紧密连接蛋白的磷酸化修饰改变有关。脂多糖(Lipopolysaccharide,LPS)是免疫细胞的激活剂,能够导致急性肺损伤,同时伴随着Claudin-4的表达下调。有文献报道,在胆管上皮细胞单层中,LPS引起Claudin-1和Claudin-4的再分布。目前,很少有文献报道在结肠上皮细胞中LPS对Claudin磷酸化的影响。在本研究中,我们探讨了在葡聚糖硫酸钠(Dextran Sulfate Sodium 5000,DSS)诱导的结肠炎大鼠结肠中Claudin磷酸化状态的改变;同时评估了结肠形态学指标、黏膜通透性和血清C-反应蛋白(C-Reactive protein,CRP)的改变。此外,我们还检测了LPS对T84细胞中Claudin及其磷酸化水平的影响。目的1.探讨在DSS诱导的大鼠结肠炎中结肠Claudin的磷酸化状态的改变。2.探讨LPS对结肠上皮细胞中Claudin磷酸化的影响。方法1.制备结肠炎模型实验采用健康雌性SD大鼠,随机分为正常对照组(6只)和DSS结肠炎模型组(18只)。正常组饮用蒸馏水7天作为对照,DSS结肠炎模型组自由饮用4%DSS水,于造模的第5、7、9天,分段收取大鼠的标本,观察相关指标。2.酶联免疫吸附测定(Enzyme Linked Immunosorbent Assay,ELISA)利用ELISA法检测实验大鼠血清中CRP水平。3.免疫组织化学染色利用免疫组化方法分别检测磷酸化Claudin-3、磷酸化Claudin-5、磷酸化Claudin-6、磷酸化Claudin-7在实验大鼠结肠上皮中的定位与表达。4.蛋白免疫印迹用Western Blotting检测实验大鼠结肠上皮中磷酸化Claudin的表达水平;在细胞水平,用Western Blotting检测了LPS对T84细胞中Claudin磷酸化水平的影响。结果1.DSS诱导的结肠炎模型大鼠结肠损伤程度明显高于正常对照组;且随着DSS刺激时间的延长,损伤程度加重,黏膜通透性逐渐增加。2.炎症因子CRP随着DSS刺激的延长而呈现出先高后低的规律。3.磷酸化Claudin-3和磷酸化Claudin-6免疫组化染色分布在结肠上皮隐窝的侧面和腺管腔中。磷酸化Claudin-5免疫组化染色主要分布在肠上皮隐窝的顶端、侧面和腺管腔。磷酸化Claudin-7分布在结肠上皮隐窝的顶端和腺管腔。4.磷酸化Claudin-4和磷酸化Claudin-7的表达水平在DSS实验性结肠炎的第6天和第8天增加,磷酸化Claudin-6的表达水平在第4天和第8天增加。磷酸化Claudin-5的表达水平在第4天减少,却在第8天增加。5.与对照组相比,LPS干预T84细胞48 h后,磷酸化Claudin-3的表达水平明显增加;72小时后,与对照组相比,磷酸化Claudin-3的表达水平明显降低,磷酸化Claudin-6表达增加,磷酸化Claudin-5表达降低,与体内研究结果相符。结论1.DSS诱导的结肠炎模型大鼠随着病情进展,结肠黏膜通透性逐渐增加,Claudin-4、Claudin-6、Claudin-7磷酸化水平升高,Claudin-5磷酸化水平呈现先高后低的趋势;2.LPS干预结肠上皮细胞引起Claudin磷酸化水平升高,长时间干预可诱导Claudin磷酸化水平下降。背景溃疡性结肠炎(ulcerative colitis,UC)是结肠慢性非特异性炎症,临床上主要表现为反复发作的粘液脓血便和腹痛腹泻,发病机制不明,病理损伤主要位于粘膜层与粘膜下层。结肠上皮的屏障功能障碍是导致炎症发生及加重的重要因素,其中,结肠上皮细胞间紧密连接是维系肠道屏障功能的重要结构,组成蛋白Claudin某些基团的适度磷酸化是维持其功能的必要条件,异常的磷酸

关键词：紧密连接蛋白磷酸化溃疡性结肠炎黏膜屏障功能脂多糖 trpv4

trpv4在大鼠脑中的表达及在次声损伤中的作用

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TRPV4在大鼠脑中的表达及在次声损伤中的作用

作者：刘扬第四军医大学

学位级别：硕士

研究背景：次声是指频率小于20Hz的声波。次声暴露可引起多种组织器官损害，是一种公认的环境污染因素，并被认为具有潜在军事用途。次声来源广泛，穿透性很强，防护比较困难，因此有必要深入研究其作用机制。研究目的：次声频率与组... 详细信息

研究背景：次声是指频率小于20Hz的声波。次声暴露可引起多种组织器官损害，是一种公认的环境污染因素，并被认为具有潜在军事用途。次声来源广泛，穿透性很强，防护比较困难，因此有必要深入研究其作用机制。研究目的：次声频率与组织器官固有频率一致，二者发生共振被认为是次声损伤的始动因素。但振动做为一种机械刺激，如何转变成生物信号并不清楚。trpv是近年研究较多的一类通道蛋白，其不少成员能感受机械刺激，并调节组织细胞的活动。据此，我们假设，次声可能激活某些机械感受分子，以此引起组织损伤。为给该假设提供证据支持，深入了解次声损伤的机制，我们进行本研究。研究内容：（1）16Hz/130db次声处理大鼠2h，之后立即提取大鼠脑组织RNA并反转录，设计trpv1-trpv4的特异性引物，用RT-PCR的方法对各自mRNA含量进行定量分析，比较次声处理对trpv转录的影响;（2）用WB的方法检测大鼠次声暴露后急性期不同时间点，trpv4表达的变化趋势;（3）在体外培养的大鼠皮质神经元、星形胶质细胞和小胶质细胞中，用免疫荧光染色、WB和RT-PCR的方法，确定trpv4的细胞定位;（4）构建trpv4特异的RNAi表达载体，并用脂质体瞬时转染U87细胞，验证转染效率;（5）6Hz/130dB次声处理U87细胞，在急性期的不同时间点检测U87细胞上清液MDA含量、裂解液SOD活性和裂解液GSH含量，研究次声对U87的过氧化损伤;（6）用trpv4特异的RNAi载体瞬转U87细胞，再次观察上述指标，研究RNAi对次声引起的过氧化损伤有无保护作用。研究结果：（1）16Hz/130db次声处理能显著提高大鼠脑组织trpv4mRNA量（;2）16Hz/130db次声处理大鼠2h，在终止次声0.5h时间点trpv4表达即可达到峰值，之后轻度下降，但到2h时间点时仍高于正常（;3）trpv4在大鼠皮层神经元、星形胶质细胞和小胶质细胞都有表达，其中以星形胶质细胞表达水平最高;（4）构建的trpv4特异的RNAi载体能有效地下调U87细胞trpv4的表达，为下一步实验打下基础;（5）6Hz/130dB次声处理U87细胞后，在1-4h时间点，上清液MDA含量都有明显上升，裂解液SOD活性和裂解液GSH含量都有明显下降，提示次声对U87细胞的过氧化损伤;（6）下调U87细胞trpv4的表达，对次声过氧化损伤有一定的保护作用。结论：trpv4做为一种近年研究较多的机械刺激感受分子，在大鼠皮层神经元、星形胶质细胞和小胶质细胞都有表达,其中以星形胶质细胞表达水平最高;6Hz/130dB次声处理U87细胞可引起明显的过氧化损伤，而下调U87细胞trpv4的表达，对次声过氧化损伤有一定的而保护作用，提示trpv4参与了次声引起的组织损伤。

关键词：次声机械感受分子 trpv4 过氧化损伤 RNAi

trpv4调节中性粒细胞活化介导心肌缺血再灌注损伤机制的初步研究

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TRPV4调节中性粒细胞活化介导心肌缺血再灌注损伤机制的初步研究

作者：卢凯华中科技大学

学位级别：硕士

目的:中性粒细胞(PMN)活化是启动和加剧心肌缺血再灌注损伤(MIRI)的重要机制。我们前期研究发现阻断/基因敲除trpv4后可明显减少小鼠MIRI后心脏组织中PMN的浸润,并减轻心肌损伤。多项研究表明trpv4参与多种疾病的炎症反应过程,但trpv4... 详细信息

目的:中性粒细胞(PMN)活化是启动和加剧心肌缺血再灌注损伤(MIRI)的重要机制。我们前期研究发现阻断/基因敲除trpv4后可明显减少小鼠MIRI后心脏组织中PMN的浸润,并减轻心肌损伤。多项研究表明trpv4参与多种疾病的炎症反应过程,但trpv4是否通过调节PMN活化参与MIRI仍不清楚。在本研究中,我们探讨了trpv4是否参与调节PMN的活化并初步研究了PMN上trpv4参与小鼠MIRI的机制。方法:分离小鼠骨髓PMN,采用Western blot和免疫荧光的方法检测PMN上trpv4的表达和分布,膜片钳记录PMN上trpv4电流,并利用钙荧光染料Fluo-4/AM检测细胞内Ca浓度([Ca])改变。利用Transwell检测PMN的趋化能力,利用活性氧(ROS)染料Luminol和DCFH-DA检测ROS的生成,利用Sytox Green染料检测中性粒细胞外诱捕网(NETs)的释放,髓过氧化物酶(MPO)试剂盒检测MPO的活力。我们利用HL-1细胞缺氧/复氧(H/R)模拟在体MIRI过程,用乳酸脱氢酶(LDH)试剂盒检测心肌细胞的损伤水平。结果:小鼠PMN上有trpv4的蛋白表达,trpv4主要表达于PMN细胞膜表面。PMN细胞膜上可记录到GSK790A诱导的trpv4电流,且细胞钙荧光显示GSK790A可浓度依赖性的诱导PMN[Ca]增加。同时,这些效应可被trpv4阻断剂或trpv4基因敲除所减轻或消除。我们发现trpv4阻断剂或trpv4基因敲除可以减少PMN向fMLP的趋化反应。与常见的PMN活化剂fMLP和PMA类似,trpv4激动剂GSK790A可以增加PMN的ROS水平、促进NETs的释放以及MPO的分泌等,且这些效应可被trpv4阻断剂或trpv4基因敲除所抑制。有意思的是,我们发现阻断trpv4可减少fMLP介导的Ca内流,而PMA却不引起PMN[Ca]改变。此外,我们发现阻断trpv4可减少PMN向H/R上清的趋化。活化trpv4后的PMN上清可使心肌细胞释放的LDH进一步增加。结论:小鼠PMN上存在trpv4的功能性表达,且trpv4参与调节PMN的趋化、ROS和NETs生成、MPO的释放等多个活化过程。有意思的是,阻断trpv4可减少H/R过程中PMN向损伤心肌的趋化,激活trpv4后则可进一步加重PMN对心肌细胞的损伤效应。因此,PMN上的trpv4参与MIRI的发病过程,有望成为MIRI新的有效治疗靶点。

关键词： trpv4 中性粒细胞活化缺血再灌注损伤

胆汁酸通过激活trpv4通道蛋白介导阻塞性黄疸血管低反应的研究

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胆汁酸通过激活TRPV4通道蛋白介导阻塞性黄疸血管低反应的研究

作者：孟笑炎中国人民解放军海军军医大学

学位级别：硕士

研究目的阻塞性黄疸(obstructive jaundice,OJ)是一种由于胆道、胰头病变,引起肝内或者肝外胆管发生阻塞,导致胆汁排出不畅、淤积反流所引发的一种临床症状。该患者通常存在不同程度的心血管功能损害,手术麻醉中通常表现为患者血压偏低... 详细信息

研究目的阻塞性黄疸(obstructive jaundice,OJ)是一种由于胆道、胰头病变,引起肝内或者肝外胆管发生阻塞,导致胆汁排出不畅、淤积反流所引发的一种临床症状。该患者通常存在不同程度的心血管功能损害,手术麻醉中通常表现为患者血压偏低以及对血管活性药物反应性减弱,称为阻塞性黄疸的血管低反应。对于血管反应性的研究已超过半个世纪,其中血管内皮细胞的活性及通透性改变的调节机制受到大量的研究关注。然而,胆汁淤积患者出现心血管反应性受损的病因机制仍然不确定。据报道,瞬时受体电位阳离子通道V4(trpv4)在心血管系统中,特别是在内皮细胞上广泛表达,并且其可以调节下游多种细胞因子释放与改变细胞对Ca离子的通透性,广泛参与到各种病理生理情况下心血管系统的调节。目前,尚无研究报道过阻塞性黄疸时,trpv4通道蛋白在血管反应性的改变中是否发挥作用。本课题的目的是探索黄疸患者外周循环中增高的胆汁酸(Bile acids,BAs)通过调节大血管内皮细胞上的trpv4通道蛋白表达,引起内皮细胞Ca离子内流、激活环氧合酶2(Cyclooxygenase 2,COX2)等改变,介导阻塞性黄疸的血管低反应性发生。研究方法1、通过大鼠胆管结扎术(bile duct ligation,BDL)创建阻塞性黄疸的实验动物模型。获取不同时间点的Sprague-Dawley(SD)模型大鼠胸主动脉段,并修剪至3-4毫米血管环,在血管张力仪下测得其血管张力与收缩力,对比分析。检测不同时间点胸主动脉血管中trpv4蛋白及其mRNA表达情况。对张力仪下的血管使用trpv4激动剂GSK1016790A,进一步分析、验证trpv4筒灯蛋白表达与BDL时间、血管张力之间的相关性。2、检测BDL大鼠血清中胆汁主要成分胆汁酸、胆红素的水平。体外培养大鼠胸主动脉内皮细胞,分别向培养基中加入胆汁酸、胆红素,设置对照组加入等体积的培养基,共同培养细胞。通过测定不同因素刺激下内皮细胞内trpv4蛋白、mRNA表达情况,以及观察trpv4蛋白与内皮细胞质膜上的Dil蛋白免疫荧光共标情况,探究阻塞性黄疸时,影响trpv4蛋白表达改变的主要原因,以及trpv4蛋白的表达部位。3、在不同数量级的浓度梯度的血管活性药物乙酰胆碱和去甲肾上腺素的作用下,观察BDL大鼠胸主动脉血管环收缩、舒张状态,以及观察BDL模型动物同时给予trpv4抑制剂HC-067047后血管收缩、舒张恢复情况,分析阻塞性黄疸血管活性药物低反应性的机制。进一步探索trpv4蛋白激活后的下游机制,使用药物吲哚美辛、L-NAME和塞来昔布分别抑制非选择性环氧化酶(即COX)、一氧化氮合成酶(即NOS)和选择性环氧化酶COX2,观察大鼠胸主动脉环在不同浓度血管收缩药物作用下的收缩情况,并检测BDL、BDL同时给予HC-067047后下游COX蛋白、mRNA表达情况。结果1、通过观察判断模型创建成功,获取目标血管。在含有KCL(60mM)的收缩溶液中,大鼠胸主动脉环的收缩张力随着BDL时间呈递减趋势;胸主动脉环细胞中的trpv4蛋白、mRNA表达呈时间依赖的递增趋势,均在第五天达到显著差异。使用trpv4蛋白激动剂GSK1016790A,胸主动脉环的舒张程度呈药物浓度依赖性与模型创建时间依赖性的递增趋势。2、BDL模型大鼠血清中胆汁酸、胆红素水平在第三天后均明显增加并维持在较高水平。与对照组比较,胆汁酸培养基中的内皮细胞trpv4蛋白与mRNA表达显著增加,而胆红素培养基中的内皮细胞trpv4则无明显的改变。免疫荧光显示,trpv4蛋白与内皮细胞质膜Dil蛋白完全共标。细胞内钙显示,胆汁酸培养基中的内皮细胞内钙离子集聚较为明显。3、大鼠胸主动脉环舒张程度随乙酰胆碱浓度增加呈明显递增趋势,使用HC-067047不能明显减低血管环扩张程度。血管环收缩程度亦随去甲肾上腺素的药物浓度呈递增趋势,使用HC-067047可以显著抑制剂血管收缩。针对trpv4下游分子使用不同抑制剂,结果显示COX抑制剂对血管环收缩剂的血管收缩反应的逆转作用较为明显,NOS抑制剂L-NAME则不会对血管收缩产生影响。进一步实验发现,使用HC-067047可以显著降低COX2蛋白、mRNA的表达。结论本研究可得出如下结论:1、阻塞性黄疸trpv4蛋白表达增高与血管反应性下降相关。BDL后大鼠血管环收缩张力下降;该下降程度与胸主动脉中的trpv4蛋白升高趋势相符,提示二者可能存在相关性;药理学激活trpv4蛋白后引起胸主动脉呈现药物浓度依赖性舒张反应,明确了trpv4蛋白的过表达参与BDL大鼠胸主动脉收缩张力的调节。2、胆汁酸介导主动脉血管内皮细胞trpv4蛋白表达增高。阻塞性黄疸时,个体外周血中胆汁酸、胆红素水平明显增高。细胞培养时加入胆汁酸刺激可以引起trpv4的过表达,且这种现象在胆红素培养时不明显,提示胆汁酸是胆汁淤积时引起血管张力改变的关键分子TRP

关键词：阻塞性黄疸血管低反应 trpv4 胆汁酸