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trim69可抑制紫外线和依托泊苷刺激时HeLa和HEK293T细胞系内活化型caspase7和剪切型PARP的表达

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基础医学与临床 2016年第7期36卷 956-961页

作者：姚荣彦韩永卿缪时英王琳芳宋伟中国医学科学院基础医学研究所北京协和医学院基础学院医学分子生物学国家重点实验室北京100005

目的验证trim69蛋白是否能够抑制He La和HEK293T细胞系内活化型caspase7(cleaved caspase7)和剪切型PARP(cleaved PARP)的蛋白水平。方法构建含人源trim69的真核表达质粒,转染He La细胞和HEK293T细胞,筛选稳定表达trim69的细胞系,通过... 详细信息

目的验证trim69蛋白是否能够抑制He La和HEK293T细胞系内活化型caspase7(cleaved caspase7)和剪切型PARP(cleaved PARP)的蛋白水平。方法构建含人源trim69的真核表达质粒,转染He La细胞和HEK293T细胞,筛选稳定表达trim69的细胞系,通过紫外线照射和凋亡诱导剂依托泊苷(etoposide)刺激处理,Western blot检测细胞内trim69蛋白、活化型caspase7和剪切型PARP蛋白水平的变化。结果紫外线照射和依托泊苷刺激后,与对照组相比,trim69过表达的细胞内活化型caspase7和剪切型PARP的蛋白水平均下降(Ptrim69蛋白的表达可抑制紫外线或依托泊苷刺激时He La和HEK293T细胞内凋亡相关蛋白活化型caspase7和剪切型PARP的蛋白水平。

关键词： trim69 E3泛素连接酶 DNA损伤 caspase7 PARP

Study on the role of trim69 in lymphocytes development and macrophage function

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Study on the role of TRIM69 in lymphocytes development and m...

睾丸组织高表达蛋白trim69在精子发生中的功能研究

第九届全国免疫学学术大会

作者： Ji Xu He Kangxia Zhang Siya Zhang Jianmin He Wei Department of Immunology State Key Laboratory of Medical Molecular BiologySchool of Basic MedicinePeking Union Medical College Institute of Basic Medical Sciences

Background:trim69,an E3 ubiquitin ligase which contains classical RBCC domians,is a canonical tripartite motif containing protein and could induce apoptosis in cells when *** trim69 has a role in lymphocytes development and macrophage function remains ***:Examine the role of trim69 in lymphocytes development and macrophage function in ***:Single cell suspension was isolated from lymphoid nodes(LNs),spleens and thymuses from trim69 knocked out(KO)as well as wild type(WT)mice by passing through 40μm cell *** cytometry was employed to test the subgroup *** macrophage was isolated from WT and KO mice and was seeded in 24 well plates(3×10/well)and 6 well plates(1×10/well)and stimulated with 100ng/ml LPS,and the cell lysate and culture supernatant were collected and tested by WB and ***:(1)We found the trim69mice has the normal breed capacity,and the sizes and proportion of B cells,T cells,CD4,CD8T cells in spleens,thymuses and LNs were normal compared with the WT mice;(2)the proportion of CD25CD44T cells in the thymus of trim69mice were much higher than WT mice;(3)the phospho-NF-KB in macrophage stimulated with LPS were much more in trim69mice than that in WT ***:trim69mice displayed normal proportions of T cells,B cells,αβT cells andγδT cells in spleens,LNs and IELs,but had much more CD25CD44T cells in thymuses,suggesting a regulatory role in T cell development As many other Tripartite motif containing proteins,trim69 may have a negative role in innate immunity.

关键词： trim69 T cell development Intestinal intraepithelial lymphocytes

来源： cnki会议评论

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睾丸组织高表达蛋白TRIM69在精子发生中的功能研究

作者：姚荣彦北京协和医学院

学位级别：硕士

细胞凋亡是维持机体组织平衡的重要生物学过程,泛素化介导的蛋白质降解与修饰在细胞凋亡调控中发挥着十分关键的作用。trim家族;tripartite motif,三结构域蛋白)是含有RING-finger结构域的蛋白家族,是E3泛素连接酶的最大亚家族之一,该... 详细信息

细胞凋亡是维持机体组织平衡的重要生物学过程,泛素化介导的蛋白质降解与修饰在细胞凋亡调控中发挥着十分关键的作用。trim家族;tripartite motif,三结构域蛋白)是含有RING-finger结构域的蛋白家族,是E3泛素连接酶的最大亚家族之一,该家族蛋白参与非常广泛的细胞生理病理进程,调节多种生物学过程。trim69是我室从人睾丸cDNA文库中分离并鉴定的trim家族的新成员,本实验室前期的工作发现,trim69在小鼠睾丸组织中特异性高表达,可能与精子发生有一定关系。迄今为止,关于trim69在生殖中的功能报道很少。为了研究trim69在哺乳动物精子发生过程中的功能,我们利用Lox-Cre同源重组系统构建了trim69 RING-finger结构域特异性敲除的小鼠。经过一系列实验检测发现,与正常小鼠相比,trim69 RING-finger结构域敲除后小鼠的精子发生和生殖细胞凋亡情况未受到明显影响,在给予外界刺激如低压低氧时,依然未表现出明显的生理差异。之后,我们又利用CRISPR-Cas9系统构建了trim69全基因敲除鼠,结果发现将trim69完全敲除后小鼠确实存在不育现象,但仍需进一步确定其不育是否是由于trim69的缺失而导致。此外,为了研究trim69在生精细胞凋亡调控中的作用,我们在体外构建并筛选了过表达人源trim69的稳定细胞系,经过DNA损伤诱导处理(紫外线照射和药物刺激)后发现,与对照组相比,过表达trim69的细胞表现出较明显的抗凋亡特征。而内源性trim69敲低后,细胞在经过DNA损伤诱导处理时比正常细胞表现出更为明显的凋亡现象。因此,我们认为,trim69 RING-finger结构域可能不是小鼠精子发生过程中所必需的,但将trim69完整敲除后可能导致小鼠不育;在体外细胞受到UV或药物刺激而引发细胞凋亡时,trim69蛋白的表达可抑制其凋亡。

关键词： trim69 E3泛素连接酶精子发生细胞凋亡基因敲除小鼠

过表达trim69抑制细胞内源c-Jun蛋白的表达

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基础医学与临床 2016年第6期36卷 767-771页

作者：王任先李凯姚荣彦缪时英王琳芳宋伟北京积水潭医院北京市创伤骨科研究所骨组织工程研究室北京100035 中国医学科学院基础医学研究所北京协和医学院基础学院医学分子生物学国家重点实验室北京100005

目的探索trim69负调控AP1信号通路及抑制内源c-Jun蛋白表达的分子机制。方法在子宫颈癌细胞He La细胞或人胚肾细胞HEK293T细胞共转染荧光素酶报告基因质粒和空载体或trim69,共转空载体组作为对照,通过双荧光素酶报告基因实验检测了trim6... 详细信息

目的探索trim69负调控AP1信号通路及抑制内源c-Jun蛋白表达的分子机制。方法在子宫颈癌细胞He La细胞或人胚肾细胞HEK293T细胞共转染荧光素酶报告基因质粒和空载体或trim69,共转空载体组作为对照,通过双荧光素酶报告基因实验检测了trim69对8条关键信号通路的影响;在HEK293T细胞过表达trim69全长及各个结构域的截短体,通过Western blot实验检测了trim69抑制细胞内源c-Jun蛋白表达的关键结构域;在HEK293T细胞过表达trim69,利用cycloheximide(CHX)、MG132或chloroquine分别处理细胞,通过蛋白稳定性实验探讨了trim69负调控内源c-Jun蛋白表达的分子机制。结果 trim69可以特异负调控AP1信号通路(Ptrim69对内源c-Jun蛋白表达的抑制作用依赖于其RBCC结构域(Ptrim69通过蛋白酶体途径影响内源c-Jun蛋白的稳定性(Ptrim69负调控AP1信号通路并通过蛋白酶体途径影响内源c-Jun蛋白的降解。

关键词： trim69 AP1信号通路转录因子c-Jun

慢病毒介导的稳定表达人睾丸组织泛素连接酶trim69基因的细胞系的建立

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医学研究杂志 2013年第11期42卷 23-26页

作者：吴为李琴山宋伟缪时英王琳芳中国医学科学院/北京协和医学院基础医学研究所医学分子生物学国家重点实验室 100005

目的利用改造的慢病毒表达系统构建表达人睾丸组织新的泛素连接酶trim69基因的稳定细胞系。方法采用RT-PCR方法从人胚肾细胞系HEK293T cDNA中扩增trim69基因及其缺失RING结构域的突变体,将其克隆至改造的plentilox3.7慢病毒载体中。将... 详细信息

目的利用改造的慢病毒表达系统构建表达人睾丸组织新的泛素连接酶trim69基因的稳定细胞系。方法采用RT-PCR方法从人胚肾细胞系HEK293T cDNA中扩增trim69基因及其缺失RING结构域的突变体,将其克隆至改造的plentilox3.7慢病毒载体中。将慢病毒质粒pLenti-trim69或其突变体与慢病毒辅助质粒(plp1,plp2,VSVG)共转染HEK293T包装细胞,产生有活性的病毒。包装后的重组慢病毒感染HEK293细胞,Western blot检测确认trim69及其突变体蛋白的表达。结果经Western blot检测证实,成功建立了稳定表达trim69基因及其突变体的293细胞系。结论利用慢病毒成功制备稳定表达trim69基因及其突变体的293细胞系,这些细胞为trim69生物学功能的研究提供了平台。

关键词： trim69 慢病毒稳定细胞株