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LINC00858通过miR-92a-3p/tram2轴激活PI3K/AKT通路促进胰腺癌增殖和侵袭转移

LINC00858通过miR-92a-3p/TRAM2轴激活PI3K/AKT通路促进胰腺癌增...

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作者：谢华华贵州医科大学

学位级别：硕士

目的:探索LINC00858在胰腺癌中的表达及临床意义,验证LINC00858对胰腺癌增殖、侵袭及迁移能力的影响及其作用机制。方法:通过下载公共数据库TCGA-PAAD,运用生物信息学方法分析筛选出在胰腺癌中有差异表达的lnc RNA,结合文献挑选出表达... 详细信息

目的:探索LINC00858在胰腺癌中的表达及临床意义,验证LINC00858对胰腺癌增殖、侵袭及迁移能力的影响及其作用机制。方法:通过下载公共数据库TCGA-PAAD,运用生物信息学方法分析筛选出在胰腺癌中有差异表达的lnc RNA,结合文献挑选出表达差异高的基因——LINC00858。通过收集贵州医科大学附属医院肝胆外科胰腺癌和匹配的癌旁组织,采用实时荧光定量PCR(q RT-PCR)实验检测LINC00858在胰腺癌组织及胰腺癌细胞系中的表达情况。统计胰腺癌患者临床病理资料,分析LINC00858的表达与患者临床预后及临床病理资料的相关性。进一步利用RNA核浆分离及RNA-FISH(RNA荧光原位杂交)实验确定LINC00858在胰腺癌细胞中的亚细胞分布。构建LINC00858小干扰RNA三条,转染胰腺癌细胞PANC-1和MIA Pa Ca-2验证其转染效率;构建阴性对照、过表达及下调慢病毒稳转株,并验证其感染效率。通过CCK-8细胞增殖实验、克隆平板实验和Ed U实验检测LINC00858对胰腺癌细胞增殖能力的影响;通过Transwell实验、伤口愈合实验检测LINC00858对胰腺癌细胞侵袭转移能力的影响;Western Blot实验检测周期相关蛋白、侵袭转移相关蛋白变化。随后通过生物信息学网站mi RDB、mi RTarget数据库预测LINC00858的下游调控机制,筛选出LINC00858通过海绵化吸附作用可结合的mi RNA及下游靶蛋白。并通过预实验(q RT-PCR/Western Blot)及查阅文献,最终确定LINC00858可结合的mi R-92a-3p以及下游靶蛋白tram2。利用双荧光素酶报告基因实验、q RT-PCR实验验证LINC00858和mi R-92a-3p的关系。同时进行Spearman相关系数分析LINC00858与mi R-92a-3p的相关性。将过表达LINC00858与mi R-92a-3p mimics共转染后,通过q RT-PCR检测mi R-92a-3p的表达情况。使用体外实验(如CCK-8实验、平板克隆实验、Ed U实验、Transwell实验、伤口愈合实验、Western Blot实验)检测细胞增殖和侵袭转移能力的变化,进一步验证mi R-92a-3p是LINC00858的直接靶标。利用mi RNA靶基因数据库mi RDB、mi RTarget、ENCORI预测靶基因tram2。Western Blot实验检测敲低tram2后AKT-m TOR通路蛋白的变化。将mi R-92a-3p mimics与tram2过表达共转染,进行体外回复实验,进一步验证tram2是mi R-92a-3p的直接靶蛋白。最后通过体内实验(裸鼠皮下成瘤实验)验证LINC00858对胰腺癌细胞增殖能力的影响。结果:通过TCGA-PAAD数据库和结合文献筛选出在胰腺癌中差异表达倍数最高的lnc RNA为LINC00858,其主要定位于细胞质中;LINC00858在胰腺癌组织中的表达明显高于癌旁组织;LINC00858在胰腺癌细胞中的表达明显高于正常胰腺上皮细胞,其中以PANC-1和MIA Pa Ca-2细胞最为显著。LINC00858表达与胰腺癌患者生存预后、淋巴转移、TNM分期及临床病理分期相关。实验结果发现:过表达LINC00858后细胞的增殖、侵袭、迁移能力较对照组显著增加;下调LINC00858后,上述体外实验则出现相反结果。过表达LINC00858后,Western Blot实验显示LINC00858能够促进Cyclin E1、CDK2、N-cadherin、Vimentin蛋白的表达,抑制P27、E-cadherin蛋白的表达,其结果是加快细胞周期G1/S期转换,诱导EMT发生,细胞增殖和侵袭转移增加;下调LINC00858后,上述实验则出现相反结果。根据mi RTarget等数据库预测发现LINC00858的下游调控机制可能与mi R-92a-3p相关。双荧光素酶报告实验结果显示:共转染了mi R-92a-3p mimics的LINC00858-WT组的荧光素酶活性较对照组表达减少,而LINC00858-MT组荧光素酶活性没有明显差异。Spearman等级相关性结果显示LINC00858与mi R-92a-3p表达呈负相关。mi R-92a-3p mimics能够逆转LINC00858促进胰腺癌细胞增殖和侵袭转移效应。双荧光素酶报告实验结果提示:共转染了mi R-92a-3p mimics的tram2-WT-3’-UTR组的荧光素酶活性较对照组表达减少,而tram2-MT-3’-UTR组荧光素酶活性没有明显差异。Spearman等级相关性结果显示mi R-92a-3p与tram2表达呈负相关。Western Blot实验结果显示敲低tram2后磷酸化的AKT、m TOR的蛋白表

关键词：胰腺癌 LINC00858 miR-92a-3p tram2 增殖侵袭转移

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