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乳酸调控小鼠巨噬细胞M2型极化的关键靶点分子筛选

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中国免疫学杂志 2023年第10期39卷 2041-2048,I0001页

作者：杨颖颖黄瑾刘新宇邱炜贵州医科大学生物与工程学院贵阳550000 遵义市第一人民医院肿瘤科遵义563004

目的:乳酸堆积是肿瘤微环境(TME)呈酸性的主要原因之一,巨噬细胞是TME中的重要免疫细胞。本研究筛选乳酸调控小鼠腹腔巨噬细胞M2型极化的关键靶点分子,为巨噬细胞相关的肿瘤免疫治疗提供理论依据。方法:提取小鼠源腹腔巨噬细胞,通过流... 详细信息

目的:乳酸堆积是肿瘤微环境(TME)呈酸性的主要原因之一,巨噬细胞是TME中的重要免疫细胞。本研究筛选乳酸调控小鼠腹腔巨噬细胞M2型极化的关键靶点分子,为巨噬细胞相关的肿瘤免疫治疗提供理论依据。方法:提取小鼠源腹腔巨噬细胞,通过流式细胞术检测F4/80+及CD11b+细胞表达量;将巨噬细胞分为2组,分别用0 mmol/L(对照)、20 mmol/L乳酸的培养基处理24 h后收集细胞,qPCR法检测巨噬细胞IL-10、Arg-1、VEGF、HIF-1等基因的相对表达量;利用转录组测序技术筛选对照组和20 mmol/L乳酸组的差异表达基因(|log2(fold change)|>1),对差异表达基因进行GO及KEGG分析,并利用Cytoscape软件将筛选出的差异表达基因构建互作网络图,根据基因互作节点数筛选出tpt1及Malat1等关键调控基因。分别将tpt1、Malat1两个关键基因的siRNA转染至巨噬细胞,抑制两个基因的表达,利用qPCR法检测转染后巨噬细胞CD11c、Arg-1、VEGF等基因的相对表达量。结果:获得的小鼠腹腔细胞中F4/80+及CD11b+细胞的表达量均大于90%,表明成功获得高纯度的小鼠腹腔来源巨噬细胞。与对照组相比,经20 mmol/L乳酸处理后,Arg-1、HIF-1、IL-10和VEGF表达量增加,表明乳酸能促进巨噬细胞的M2型极化。转录组学研究结果发现,20 mmol/L乳酸处理24 h后使巨噬细胞的6 295个基因表达发生变化,差异表达基因主要参与细菌防御反应、胞质基因翻译、核糖体生物合成、胎盘发育等生物过程;涉及的信号通路包括MAPK、PI3KAkt、NOD样受体等。筛选出关键上调差异表达基因Malat1、tpt1、Fadd、Gm5900、Gipr等。Malat1或tpt1表达被抑制后,20 mmol/L乳酸均能上调巨噬细胞中CD11c表达,抑制VEGF、Arg-1表达。结论:乳酸可能通过上调Malat1及tpt1表达进而促进巨噬细胞的M2型极化。

关键词：巨噬细胞乳酸转录组学 Malat1 tpt1

肝细胞癌高表达基因tpt1转染对肝细胞系生物学行为的影响

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中华肿瘤杂志 2011年第3期33卷 183-187页

作者：高天慧段芳龄刘明月李晓燕河南省人民医院肿瘤科郑州450003 郑州大学消化疾病研究所

目的将tpt1转染肝癌细胞系SMMC-7721和肝细胞系L-02，观察肝细胞系生物学行为的变化。方法将连有tpt1的、带有绿色荧：圯蛋白标签的真核报告表达载体pEGFP-N3tpt1，通过Lipofectamine分别转染SMMC-7721和L-02细胞，同时设pEGFP—N3对照... 详细信息

目的将tpt1转染肝癌细胞系SMMC-7721和肝细胞系L-02，观察肝细胞系生物学行为的变化。方法将连有tpt1的、带有绿色荧：圯蛋白标签的真核报告表达载体pEGFP-N3tpt1，通过Lipofectamine分别转染SMMC-7721和L-02细胞，同时设pEGFP—N3对照。采用逆转录聚合酶链反应（RT-PCR）检测tpt1 mRNA水平，四甲基偶氮唑蓝（MTT）法、软琼脂克隆形成实验、细胞周期分析检测细胞增殖和致瘤性。结果pEGFP—N3tpt1转染后，SMMC-7721细胞tpt1 mRNA相对表达水平与对照组的比值为1．78，L-02细胞tpt1 mRNA相对表达水平与对照组的比值为2．59。pEGFP-N3tptI转染可明显增强肝细胞的增殖能力，转染SMMC-7721后24、48、72、96h的吸光度（A）值分别为0．80、1．56、2．69和2．94，均高于pEGFP-N3（分别为0．71、1．23、1．92和2．75）和脂质体对照（分别为0．76、1．27、1．89和2．78），差异均有统计学意义（均P〈0．05）。在接种500个和1000个细胞时，pEGFP—N3tpt1组软琼脂克隆形成数分别为（6．00±1．73）个和（12．00±2．65）个，pEGFP—N3组软琼脂克隆形成数分别为（1．00±1．00）个和（7．004-1．00）个（P〈0．05）。pEGFP—N3tptI转染后的SMMC-7721细胞增殖指数（PI）为40．9％，高于pEGFP—N3组（26．4％）。EGFP—N3tpt1转染正常肝细胞L-02后，24、48、72、96、120h测得的A值分别为0．87、1．11、1．55、2．12和2．42，均高于pEGFP—N3组（分别为0．65、0．79、1．02、1．49和1．96）和脂质体组（分别为0．67、0．82、0．89、1．56和1．85），差异有统计学意义（P〈0．05）；pEGFP—N3tpt1组平板克隆数为（18．00±2．00）个，pEGFP—N3组为（7．00±2．65）个（P〈0．05），但L-02细胞不能在软琼脂中形成克隆。pEGFP—N3tpt1转染后L-02细胞的PI为35．9％，高于pEGFP-N3组（26．1％）。结论tpt1转染可增强肝癌细胞SMMC一7721的恶性表型，促进正常肝细胞L-02的增殖能力，但不能使L-02发生恶性转化。

关键词：癌,肝细胞 tpt1 细胞增殖体外研究

翻译控制肿瘤蛋白tpt1的原核表达、纯化、抗体制备和初步应用

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细胞与分子免疫学杂志 2010年第3期26卷 246-249页

作者：赵一璠李海芳汤石明王萌吴海东刘民李欣汤华天津医科大学基础医学院生命科学中心实验室天津300070

目的:原核表达并纯化翻译控制蛋白tpt1,免疫日本大耳白兔制备其抗体。方法:构建原核表达质粒pRSE-TA2-tpt1,转化大肠杆菌BL21(DE3),tpt1蛋白经异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)诱导表达。融合蛋白通过Ni-NTA树脂亲和纯化后免疫兔子制备... 详细信息

目的:原核表达并纯化翻译控制蛋白tpt1,免疫日本大耳白兔制备其抗体。方法:构建原核表达质粒pRSE-TA2-tpt1,转化大肠杆菌BL21(DE3),tpt1蛋白经异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)诱导表达。融合蛋白通过Ni-NTA树脂亲和纯化后免疫兔子制备抗体血清。以间接ELISA法检测抗体效价,Western blot和免疫荧光染色鉴定抗体特异性。结果:在大肠埃希菌中诱导出高水平表达的tpt1融合蛋白,经亲和树脂纯化后免疫大白兔,获得了高特异性的抗tpt1抗血清。结论:成功构建原核表达质粒pRSETA2-tpt1,表达并纯化tpt1蛋白,制备出高滴度、高特异性的多克隆抗体.为进一步研究tpt1在肿瘤等疾病发生、发展过程及治疗中的作用奠定基础。

关键词： tpt1 原核表达纯化抗体肿瘤

tpt1在胃肠间质瘤耐药进化中的功能性研究

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浙江临床医学 2023年第2期25卷 163-166,F0004页

作者：闫竞一陈笑雷林季温州医科大学附属第一医院 325000

目的探讨野生型tpt1和突变型tpt1A52V在胃肠间质瘤中的生物学功能.方法生物信息学分析GEO数据库(GSE69465和GSE155800)中tpt1在胃肠间质瘤组织样本和肿瘤细胞中的表达情况.构建tpt1过表达质粒、突变质粒和tpt1-siRNA,转染胃肠间质瘤细... 详细信息

目的探讨野生型tpt1和突变型tpt1A52V在胃肠间质瘤中的生物学功能.方法生物信息学分析GEO数据库(GSE69465和GSE155800)中tpt1在胃肠间质瘤组织样本和肿瘤细胞中的表达情况.构建tpt1过表达质粒、突变质粒和tpt1-siRNA,转染胃肠间质瘤细胞,RT-PCR检测转染效率,CCK8实验检测细胞增殖能力,划痕实验检测细胞迁移能力,流式细胞仪检测细胞凋亡.结果生物信息分析显示完全耐药细胞以及伊马替尼长期处理的细胞中tpt1基因表达明显比未经过伊马替尼处理的细胞要高.tpt1在对伊马替尼耐药组织中的表达高于敏感样本中的表达量.敲减tpt1后肿瘤细胞的增殖和迁移能力明显下降(Ptpt1增加肿瘤细胞的增殖和迁移能力(Ptpt1A52V较野生型tpt1具有更强的增殖和迁移能力(Ptpt1的高表达和tpt的错义突变,突变型tpt1A52V具有更强的增殖和迁移能力.野生型和突变型tpt1有望成为预测胃肠间质瘤发生发展和耐药的潜在标志物或肿瘤治疗的潜在靶点.

关键词：胃肠间质瘤 tpt1 肿瘤进化癌基因

tpt1调控绵羊前体脂肪细胞分化的机制研究

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TPT1调控绵羊前体脂肪细胞分化的机制研究

作者：刘旭莹山西农业大学

学位级别：硕士

羊肉是一种高蛋白、低胆固醇的肉类,能补充人体所需要的氨基酸和维生素等物质,广受消费者喜欢。脂肪是维持机体能量代谢平衡的重要组织,但过多的脂肪沉积在尾部不利于羊肉产量的提高。tpt1是一种广泛表达于各种细胞类型的基因。此前研... 详细信息

羊肉是一种高蛋白、低胆固醇的肉类,能补充人体所需要的氨基酸和维生素等物质,广受消费者喜欢。脂肪是维持机体能量代谢平衡的重要组织,但过多的脂肪沉积在尾部不利于羊肉产量的提高。tpt1是一种广泛表达于各种细胞类型的基因。此前研究表明,在猪前体脂肪细胞分化过程中抑制tpt1的表达可以促进脂滴生成。然而,对于tpt1调控绵羊前体脂肪细胞分化的机制尚不清楚。本研究以绵羊7种组织为研究对象,用生物信息学分析软件,揭示tpt1的序列特征及其编码蛋白的结构与功能;用RT-q PCR检测tpt1的组织表达规律。以尾部、皮下和肾周脂肪为研究对象,用RT-q PCR检测tpt1在不同部位脂肪的表达量。以前体脂肪细胞为研究对象,用RT-q PCR检测tpt1的时序表达规律;用Western Blotting检测tpt1在绵羊前体脂肪细胞分化过程中的表达趋势;通过细胞免疫荧光蛋白试验,探究tpt1蛋白在前体脂肪细胞中的亚细胞定位;通过慢病毒包装试验介导的tpt1的过表达与抑制,探究tpt1在绵羊前体脂肪细胞中的功能;用RT-q PCR和Western Blotting检测tpt1对Fox O1表达的影响;通过PI3K/Akt通路抑制试验,探究该通路是否参与tpt1调控的分化过程。通过以上研究,旨在揭示tpt1在绵羊前体脂肪细胞分化过程中的功能及调控机制。主要结果如下:1.绵羊tpt1的生物信息学分析结果绵羊tpt1 CDS长660 bp,与山羊的相似性最高,为99.7%。说明,绵羊与山羊亲缘关系最近。tpt1编码219个氨基酸,蛋白总平均亲水性为-0.374。说明,该蛋白是一种亲水性蛋白。tpt1主要定位于线粒体和细胞核中。说明,tpt1可能在细胞内不同部位发挥功能。tpt1含有16个潜在的磷酸化位点。说明,该蛋白在细胞内可能通过蛋白质的磷酸化调控其功能。2.绵羊tpt1的时空表达规律与亚细胞定位绵羊tpt1 mRNA在肾脏中表达最高,其次是肌肉、肝和脂肪,心和脾中表达最低。说明,tpt1基因在不同组织中发挥不同的功能。在肾周、皮下和尾部脂肪中,tpt1在尾部脂肪中表达量最高。在前体脂肪细胞分化过程中,tpt1的表达量先上升后下降再上升。在绵羊前体脂肪细胞中,tpt1定位于细胞核中。说明,tpt1基因在前体脂肪细胞中主要在细胞核内发挥其功能。3.tpt1促进绵羊前体脂肪细胞的分化过表达tpt1后,一些调控成脂分化的关键基因PPARγ、Adipo Q、FABP4 m RNA的表达显著上调,但C/EBPα表达量没发生显著变化,脂滴生成增加;抑制tpt1后,这些基因的表达量下降,脂滴生成减少。说明,tpt1能调节成脂分化关键基因的表达,从而促进脂肪细胞的分化和脂滴的生成。4.tpt1通过FoxO1促进绵羊前体脂肪细胞分化过表达tpt1后,FoxO1及其编码蛋白的表达量都显著下调;相反,抑制tpt1后,Fox O1及其编码蛋白的表达量都显著上升。说明,tpt1基因可通过下调FoxO1的表达的促进绵羊前体脂肪细胞分化。5.tpt1通过PI3K/Akt通路促进绵羊前体脂肪细胞的分化过表达tpt1后,p-Akt的表达量显著上调,抑制tpt1后出现相反的结果;过表达tpt1的细胞经LY294002处理后,成脂分化关键基因PPARγ、C/EBPα、AdipoQ、FABP4的表达量显著下调,脂滴生成减少。说明,tpt1能通过激活PI3K/Akt通路促进绵羊前体脂肪细胞的分化。综上所述,tpt1对绵羊尾部脂肪细胞的分化不可或缺,通过调控Fox O1和PI3K/Akt通路参与脂肪分化过程。本研究为进一步探究tpt1对脂质沉积和脂肪生成提供了理论依据。

关键词： tpt1 绵羊前体脂肪细胞细胞分化 FoxO1 PI3K/Akt

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tpt1对OCT4基因表达调控的研究

TPT1对OCT4基因表达调控的研究

作者：李军华西北农林科技大学

学位级别：硕士

为了研究tpt1基因对干细胞特异性表达基因Oct4的调控作用,本实验以P19细胞为模型,通过双荧光素酶报告基因系统（dual-luciferase reporter assay systerm）和实时定量（Quantitative ）PCR等方法,进行了一系列验证。实验结果如下: ... 详细信息

为了研究tpt1基因对干细胞特异性表达基因Oct4的调控作用,本实验以P19细胞为模型,通过双荧光素酶报告基因系统（dual-luciferase reporter assay systerm）和实时定量（Quantitative ）PCR等方法,进行了一系列验证。实验结果如下: 1.本研究利用分子克隆的方法,克隆了小鼠Oct4启动子,并将其装入绿色荧光蛋白报告载体pEGFP-1,构建pOct4-EGFP。然后将该载体转染细胞对其组织特异性进行验证,结果证明该启动子在多能性细胞中特异表达,在成纤维细胞中不表达。最后,将该启动子亚克隆入双荧光素酶报告载体pGL3-Basic,构建双荧光素酶报告载体pOct4-luc。同时,以相同的方法克隆小鼠tpt1基因的编码区,并装入真核表达载体pcDNA3-FLAG和pEGFP-C1,分别构建了表达载体pcDNA3-tpt1和pEGFP-tpt1。最后将重组载体转染细胞,进行免疫印迹杂交,证明了外源导入的tpt1在细胞中能够表达。 2.本实验以P19细胞为模型,通过双荧光素酶检测系统证明,tpt1过表达时,Oct4的转录水平明显下降。为进一步研究tpt1对Oct4的影响,我们通过设计时间梯度来检测转染tpt1后不同时间段Oct4转录水平的变化,结果发现tpt1对Oct4的影响与时间呈线性关系。最后,为了验证tpt1的量与Oct4转录抑制的关系,我们把tpt1的转染量从0.1-0.5μg设5个梯度,转染24h后再检测Oct4的表达量。从结果中可以发现,tpt1对Oct4的抑制作用与tpt1的量呈线性关系,0.5μg的tpt1对Oct4的抑制作用最明显。另一方面,为从mRNA水平上进一步验证tpt1对Oct4转录的抑制作用,本研究又通过实时定量PCR进行了一系列检测。因为tpt1基因在真核细胞中是广泛表达的,所以有必要首先检测一下不同细胞内选性tpt1的表达水平,因此我们选择了3T3、C2C12两种成纤维细胞和P19、J1 ES细胞两种多能性细胞进行了检测。结果发现,在3T3细胞和C2C12细胞中tpt1的表达水平较高,是P19细胞和J1细胞的2-4倍。为了深入研究tpt1对Oct4转录的抑制作用,本实验在P19细胞中转染pcDNA3-tpt1质粒后检测,结果发现P19细胞中tpt1的表达量提高了近13倍,而Oct4的表达量下降了25倍,这充分说明了tpt1能够在一定水平上抑制Oct4的转录。为研究tpt1对胚胎干细胞生长的影响,本实验通过在小鼠ES细胞J1中转染pcDNA3-tpt1质粒,24 h后进行碱性磷酸酶染色,结果发现与对照组相比,转染了pcDNA3-tpt1的J1细胞从颜色上看呈弱阳性,从形态上来看细胞克隆变得松散,有分化的倾向。最后,利用GFP示踪技术,将tpt1与GFP融合的表达载体pEGFP-tpt1转染P19细胞和NIH3T3细胞,基本确定tpt1与Oct4不共定位。这提示,tpt1是间接抑制Oct4的表达的。

关键词： tpt1 Oct4 P19细胞双荧光素酶报告基因系统实时定量PCR

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风湿性心脏病关联基因的筛选鉴定与表达分析

风湿性心脏病关联基因的筛选鉴定与表达分析

作者：左佳琦哈尔滨工业大学

学位级别：硕士

风湿性心脏病是由于风湿热反复发作引起的心脏瓣膜损伤。每年约有1500万人感染该疾病,且有30万人因该疾病死亡。近年来,虽然有很多研究成果证明风湿性心脏病的成因与很多基因相关,并且关于风湿性心脏病流行病学和病理学方面的研究已比... 详细信息

风湿性心脏病是由于风湿热反复发作引起的心脏瓣膜损伤。每年约有1500万人感染该疾病,且有30万人因该疾病死亡。近年来,虽然有很多研究成果证明风湿性心脏病的成因与很多基因相关,并且关于风湿性心脏病流行病学和病理学方面的研究已比较深入,但是在分子生物学层面上还有待进一步的探索和研究。本研究通过风湿性心脏病各组样本RNA-seq转录组数据筛查和实验鉴定与风湿性心脏病相关联的基因,对其进行表达分析,为后续功能研究奠定基础。临床采集患者右心耳组织样本,区分为瓣膜病组和风湿性心脏病组,风湿性心脏病组又分为风心病无血栓组和风心病有血栓组,利用HE染色技术观察瓣膜病组和风湿性心脏病组样本病理学特点。将瓣膜病组、风心病无血栓组、风心病有血栓组样本分别进行转录组测序,解析数据信息,根据分析结果初步筛选出候选基因SCARNA21、ACTA1、TRO、UBAP2L、SNORD9、TNNT3、tpt1。经过半定量RT-PCR和qRT-PCR鉴定,SCARNA21、ACTA1、TRO、UBAP2L、SNORD9、TNNT3在瓣膜病组和风湿性心脏病组样本中表达没有显著统计学差异,不符合转录组测序的结果。而tpt1经q RT-PCR检测后,发现其在风湿性心脏病组中的表达相比于瓣膜病组上调37.0%,具有显著统计学差异,风湿性心脏病组内有血栓组tpt1的表达相比于无血栓组上调了35.3%,同样具有显著统计学差异,显示tpt1与风湿性心脏病相关。进一步明确tpt1基因的表达情况,荧光原位杂交结果显示,tpt1表达于细胞质中。荧光免疫组化结果发现tpt1是一个胞质蛋白,并且在风湿性心脏病组表达明显上升。综上所述,本课题基于RNA-seq数据筛选获得了一个与风湿性心脏病相关联基因tpt1,初步明确了tpt1在风心病的表达模式。为进一步研究该基因与风湿性心脏病的关系提供了实验基础和依据。

关键词：风湿性心脏病转录组测序 tpt1

细胞骨架相关蛋白在多潜能干细胞向前脂肪细胞定向中的作用研究

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细胞骨架相关蛋白在多潜能干细胞向前脂肪细胞定向中的作用研究

作者：胡玲玲复旦大学

学位级别：硕士

脂肪组织是人体重要的能量贮存器官。当能量摄取大于消耗时,就容易产生肥胖,导致脂肪组织体积的增大。脂肪组织体积的增大,一方面是由于脂肪细胞数目的增多;另一方面是由于脂肪细胞体积的增大。脂肪细胞起源于血管基质中多潜能干细胞,... 详细信息

脂肪组织是人体重要的能量贮存器官。当能量摄取大于消耗时,就容易产生肥胖,导致脂肪组织体积的增大。脂肪组织体积的增大,一方面是由于脂肪细胞数目的增多;另一方面是由于脂肪细胞体积的增大。脂肪细胞起源于血管基质中多潜能干细胞,这类干细胞具有自我更新和多向分化的潜能,在合适的条件下,可以分化为脂肪细胞、肌肉细胞、软骨细胞和成骨细胞等中胚层来源的细胞。从多潜能干细胞到脂肪细胞的发育可以分为三个阶段：1)向脂肪细胞系的定向;2)有丝分裂克隆扩增;3)终末分化。目前对于前脂肪细胞到成熟脂肪细胞的分化研究的比较深入,而对于多潜能干细胞向前脂肪细胞定向的过程了解甚少。在本课题中,我们主要通过蛋白质组学的方法来筛选在多潜能干细胞向前脂肪细胞定向过程发挥作用的关键因子并进行机制的研究,弥补这一部分研究的空白。 Tang等研究表明骨形成蛋白BMP2/4都能促进C3H10T1/2多潜能干细胞向前脂肪细胞定向,主要是通过与BMPR1A结合,激活Smad和p38信号通路从而导致多潜能干细胞向前脂肪细胞的定向。但是对于Smad和p38信号通路激活后调节哪些关键基因而导致多潜能干细胞向前脂肪细胞定向并不明确。通过蛋白质组学研究,我们发现与未处理的细胞相比,用BMP2诱导定向的C3H10T1/2细胞中有8个蛋白表达上调;用BMP4处理后有28个蛋白上调;而其中有5个蛋白是BMP2或者BMP4处理后表达皆上调10倍以上的蛋白质。在这5个蛋白质中有3个是细胞骨架相关蛋白：赖氨酰氧化酶（1ox）、晶体蛋白αB （crystallin alpha B）和肿瘤翻译调控蛋白1（tptl）。我们从蛋白质水平进行了验证,确认了这三个蛋白在BMP2/4诱导定向的C3H10T1/2细胞中表达明显增加。为了进一步研究筛选出的lox、tptl和（?）crystallinαB与BMP信号通路的关系,我们利用RNA干扰方法下调特定蛋白质（Smad4和P38 MAPK）阻断Smad和p38信号通路,观察Smad和p38信号通路对lox、tptl和crystallinαB三种骨架相关蛋白表达的影响。结果显示下调Smad4蛋白水平能够抑制lox和crystallinαB的表达,但p38下调以后对lox和crystallinαB的表达的抑制作用相对较弱。说明Smad信号通路在lox和crystallinαB的诱导表达中发挥更重要的作用。而对于tptl来说,Smad4和p38用RNAi敲低之后tptl的表达水平有着相同程度的下调。而同时敲低Smad4和p38几乎完全阻断了lox、tpt1和crystallinαB的表达。这些结果说明了lox、tpt1和crystallinαB是BMP信号通路的下游靶基因。为了进一步确定lox、tpt1和crystallinαB在C3H10T1/2多潜能干细胞向前脂肪细胞定向中的作用,我们利用RNA干扰的方法下调C3H10T1/2多潜能干细胞lox、tpt1和crystallinαB蛋白水平,再给予细胞BMP2/4处理维持至细胞接触抑制后2天,来观察lox, tpt1和crystallinαB对BMP引起的多潜能干细胞向前脂肪细胞定向的影响。我们发现lox下调后几乎完全抑制了BMP2/4引起的多潜能干细胞向前脂肪细胞的定向,而tptl或者crystallinαB下调也部分抑制了BMP2/4引起的多潜能干细胞向前脂肪细胞的定向。说明BMP2/4诱导C3H10T1/2细胞向前脂肪细胞定向过程中lox, tpt1和crystallinαB均发挥作用。而lox在这个过程的作用尤为重要。同时我们还采用逆转录病毒表达系统在C3H10T1/2细胞中过表达lox,细胞接触抑制2天后用脂肪细胞标准分化流程进行诱导分化,我们发现过表达lox的C3H10T1/2细胞不足以使多潜能干细胞向前脂肪细胞定向。这个结果表明,lox并不是C3H10T1/2多潜能干细胞向前脂肪定向的一个充分条件。有文献报道细胞的形态和细胞外基质的重塑在脂肪细胞系的定向和分化发育过程中起着重要作用,而细胞骨架在很大程度上影响着细胞形态的形成和维持。我们筛选出的三个骨架相关蛋白中lox能够将细胞外基质胶原和弹性蛋白的赖氨酸残基脱氨形成分子间的交联,稳定细胞外基质,保持细胞外基质内环境稳定。而tptl和crystallinαB则与细胞骨架有密切联系。在研究过程中,我们发现在BMP2/4诱导脂肪细胞系定向的过程中细胞的形态发生明显改变,细胞由纺锤形变为圆形且边缘变亮。因此我们用纤维形肌动蛋白F-actin特异性荧光染料鬼笔环肽来观察BMP2/4诱导定向的C3H10T1/2细胞中细胞骨架的排列情况。结果显示未定向的细胞中F-actin是以长线型的束状应力纤维的形式存在。而定向的细胞中F-actin形成的应力纤维明显降低,其束状排列也被打断,纤维丝成块或成堆围绕在细胞的

关键词：骨形成蛋白多潜能干细胞前脂肪细胞定向lox tpt1 crystallinαB

tpt1表达载体的构建及在肝细胞系L-02中的表达

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胃肠病学和肝病学杂志 2011年第7期20卷 659-662页

作者：高天慧段芳龄马军李晓燕刘明月河南省人民医院肿瘤科河南郑州450003 郑州大学消化疾病研究所

目的构建肝细胞癌高表达基因tpt1真核表达载体,并转导肝细胞系L-02,为进一步研究其在肝细胞癌发生、发展过程中的作用奠定基础。方法通过PCR方法在tpt1 ORF两侧添加EcoRⅠ和BamHⅠ的识别序列而将其定向插入真核报告表达载体pEGFP-N3中,... 详细信息

目的构建肝细胞癌高表达基因tpt1真核表达载体,并转导肝细胞系L-02,为进一步研究其在肝细胞癌发生、发展过程中的作用奠定基础。方法通过PCR方法在tpt1 ORF两侧添加EcoRⅠ和BamHⅠ的识别序列而将其定向插入真核报告表达载体pEGFP-N3中,构成pEGFP-N3tpt1重构体,卡那霉素筛选阳性克隆,碱裂解法抽提质粒,Sanger法测序,VecScreen和BLAST分析测序结果,lipofectAM INE转导肝细胞系L-02,荧光显微镜及RT-PCR方法检测表达情况。结果将tpt1成功插入pEGFP-N3中,转导L-02后,在荧光显微镜下,可见明亮的绿色荧光。pEGFP-N3tpt1转导的细胞,tpt1 mRNA水平较对照高1.59倍(Ptpt1的真核报告表达载体pEGFP-N3tpt1,pEGFP-N3tpt1可在L-02细胞内高效表达。

关键词：肝细胞株L-02 tpt1 真核表达