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茉莉转录因子JsMYC2和JsbHLH13的克隆及其对tps基因的调控研究

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茉莉转录因子JsMYC2和JsbHLH13的克隆及其对TPS基因的调控研究

作者：万超福建农林大学

学位级别：硕士

茉莉花[Jasminum sambac(L.)Ait.]为木犀科素馨属常绿灌木,其香气馥郁,广泛应用于特色花茶“茉莉花茶”窨制、香料和食品、化妆品等制作方面,具有重要经济价值。茉莉花香气的合成及释放是受到调控的。本研究在明晰双瓣茉莉开放48 h过程... 详细信息

茉莉花[Jasminum sambac(L.)Ait.]为木犀科素馨属常绿灌木,其香气馥郁,广泛应用于特色花茶“茉莉花茶”窨制、香料和食品、化妆品等制作方面,具有重要经济价值。茉莉花香气的合成及释放是受到调控的。本研究在明晰双瓣茉莉开放48 h过程中香气成分及其变化规律的基础上,基于花、叶不同时间点转录组筛选出2个花中高表达且与香气释放规律一致的bHLH转录因子。探究bHLH转录因子对萜烯合成酶基因tps的调控,主要研究结果如下:(1)使用GC-MS测定了双瓣茉莉花开放48小时过程中主要香气组分以及变化规律。茉莉花随着花朵开放释放香气,夜间释放量高,白昼释放量低。顶空测定的香气成分中以芳樟醇、α-法尼烯、乙酸苄酯含量最高。在液体提取鉴定的香气成分中,以α-法尼烯含量占比最大。两种香气测定结果表明,萜类物质为茉莉花主要香气物质,茉莉花总香气物质和主要香气物质的释放均具有昼夜规律。(2)基于茉莉花、叶不同时间点转录组,筛选克隆了2个可能和香气释放相关的bHLH基因,编码序列长度分别为2025 bp和1713 bp,分别与近缘种油橄榄中的MYC2和bHLH13相似性最高,分别命名为JsMYC2和JsbHLH13。遗传进化分析表明JsMYC2与番茄Sl MYC1和神农香菊Ci MYC2同源性最高,JsbHLH13与拟南芥At MYC2同源性最高。(3)利用茉莉茎段愈伤组织遗传转化体系分析了JsMYC2和JsbHLH13对4个茉莉花tps基因的体内激活作用。与未转化的愈伤组织相比,转化了JsMYC2的愈伤组织中Js tps3和Js tps4基因的表达水平提高了6.09和2.02倍。转化了JsbHLH13的愈伤组织中Js tps3和Js tps4基因的表达水平提高了2.17和4.87倍。表明JsMYC2和JsbHLH13可以激活茉莉中Js tps3和Js tps4基因的转录表达。(4)利用烟草瞬时转化系统分析了JsMYC2和JsbHLH13对tps基因启动子(前期已获得)的激活强度。叶片GUS染色和活性检测结果表明JsMYC2可激活Js tps3和Js tps4启动子活性,较对照启动子活性分别提高了2.2和1.37倍。JsbHLH13使Js tps3基因启动子活性为对照的1.65倍。(5)通过酵母单杂交实验分析了JsMYC2和JsbHLH13与tps基因启动子的结合作用。缺陷培养基和Ab A筛选结果表明JsMYC2可以与Js tps3和Js tps4基因启动子结合,JsbHLH13可以与Js tps3基因启动子结合。(6)利用烟草瞬时转化系统、酵母双杂交系统及双分子荧光互补(BIFC)分析了JsMYC2与Js MYB305转录因子(前期课题组获得的可调控tps基因表达)在Js tps基因的调控上是否存在互作。烟草共注射及GUS活性测定结果显示,Js MYB305使Js tps3启动子活性相比对照提高了1.57倍,而JsMYC2与Js MYB305共注射烟草后,Js tps3启动子活性相比对照提高了3.05倍,表明JsMYC2能与Js MYB305协同激活Js tps3启动子活性。而JsbHLH13与Js MYB305无协同作用。酵母双杂结果显示JsMYC2与Js MYB305存在互作关系。但BIFC结果未发现JsMYC2与Js MYB305在烟草中能互作。(7)为进一步通过pull-down分析JsMYC2和Js MYB305体外互作关系,尝试利用原核表达系统异源表达JsMYC2和Js MYB305蛋白。Js MYB305可成功表达,但诱导JsMYC2表达时,发现蛋白主要存在于包涵体中或无法表达,可能通过原核表达系统较难获得JsMYC2异源蛋白。

关键词：茉莉花 bHLH转录因子香气 tps基因

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番茄tps基因家族鉴定与分析

分子植物育种 2019年第16期17卷 5215-5223页

作者：杨仕梅张天缘丘日光宋莉沈奇贵州大学生命科学学院农业生物工程研究院山地植物资源保护与种质创新省部共建教育部重点实验室贵州省农业生物工程重点实验室贵阳550025 贵州省农业科学院油菜所贵阳550008

萜类合成酶(terpenoid synthase, tps)是植物中催化萜类物质合成的关键酶,在植物的生长发育及抗性调节中发挥着重要作用。本研究旨在对番茄萜类合成酶基因家族进行系统的鉴定及分析,为tps基因的功能研究和利用提供数据参考。基于番茄的... 详细信息

萜类合成酶(terpenoid synthase, tps)是植物中催化萜类物质合成的关键酶,在植物的生长发育及抗性调节中发挥着重要作用。本研究旨在对番茄萜类合成酶基因家族进行系统的鉴定及分析,为tps基因的功能研究和利用提供数据参考。基于番茄的全基因组测序结果鉴定tps基因家族,运用生物信息学方法构建系统发育树,对其基因结构、染色体定位及进化选择压力等进行分析。共鉴定获得31条番茄tps基因,包括7条未报道基因。系统发育树分析表明其分为5个亚族,且不均匀分布在11条染色体上,呈现串联重复。蛋白理化性质分析表明,番茄tps基因为酸性的亲水性蛋白。对来源于tps-a亚家族基因进行Ka/Ks分析,结果表明番茄tps基因间在进化时主要受纯化选择作用。顺式作用元件分析表明其主要含有光响应,水杨酸响应及防御和应激反应顺式作用元件。通过对基因表达分析发现有18条tps可表达,其中部分基因在根,茎,叶中均有上调表达。本研究对番茄tps家族基因进行系统鉴定,预测及进化分析,对萜类合成及调控的研究具有重要的意义。

关键词：番茄(Lycopersicon esculentum Mill.) tps基因基因家族系统发育表达分析

茉莉花JsMYB108和JsMYB305基因的克隆及其对tps基因的激活作用

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热带作物学报 2021年第6期42卷 1539-1548页

作者：张月袁媛何弦王宇婷吕美玲伍炳华陈清西福建农林大学园艺学院福建福州350002

基于茉莉花叶转录组(GenBank登录号为GHOY00000000)筛选了2个在花瓣中及夜间优势表达,且与其他物种中香气调控转录因子同源度高的MYB基因进行克隆并分析了它们在花朵开放中的表达模式。2个MYB基因编码序列长度分别为864 bp和588 bp,编码... 详细信息

基于茉莉花叶转录组(GenBank登录号为GHOY00000000)筛选了2个在花瓣中及夜间优势表达,且与其他物种中香气调控转录因子同源度高的MYB基因进行克隆并分析了它们在花朵开放中的表达模式。2个MYB基因编码序列长度分别为864 bp和588 bp,编码287 aa和195 aa个氨基酸残基。分别与拟南芥AtMYB108及AtMYB24亲缘关系相近,与油橄榄(Olea europaea var.sylvestris)MYB108-like protein和MYB305-like protein相似度最高,分别命名为JsMYB108和JsMYB305。JsMYB108和JsMYB305在夜间表达量显著高于白天,与4个茉莉花萜类合成酶基因Jstps表达特征一致。为探究JsMYB108和JsMYB305是否参与萜类香气调控,将其构建至植物表达载体pK7FWG2.0(35 S启动子,GFP报告基因)中,利用茉莉花茎段愈伤组织遗传转化体系检测其对愈伤组织中4个Jstps基因表达水平的影响。结果显示:转化了JsMYB108和JsMYB305的愈伤组织内能检测到GFP荧光和2个MYB基因转录本;JsMYB108可显著提高Jstps2表达水平,JsMYB305可显著提高4个Jstps基因的表达,暗示JsMYB108和JsMYB305可能不同程度地参与了萜类合成的调控。该研究结果为今后茉莉花香气调控的深入研究提供参考。

关键词：茉莉花 MYB转录因子 tps基因愈伤组织遗传转化

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坛紫菜tps基因的克隆及其原核表达

华北农学报 2013年第5期28卷 66-73页

作者：邓淑贞王斌高磊牛倩雅刘涛翁曼丽郭宝太青岛农业大学生命科学学院山东省植物生物技术高校重点实验室山东青岛266109 中国海洋大学海洋生命学院山东青岛266100 中国科学院遗传与发育学研究所北京100101

以叶状体总DNA为模板,用3对DNA引物进行PCR扩增,获得了坛紫菜6-磷酸海藻糖合成酶基因(Phtps)3个重叠的片段,大小分别为1.3,1.1,0.7 kb。用pMD18-T载体克隆这些片段,经测序与序列拼接获得了该基因完整的ORF序列,其长度为2 727 bp。在已... 详细信息

以叶状体总DNA为模板,用3对DNA引物进行PCR扩增,获得了坛紫菜6-磷酸海藻糖合成酶基因(Phtps)3个重叠的片段,大小分别为1.3,1.1,0.7 kb。用pMD18-T载体克隆这些片段,经测序与序列拼接获得了该基因完整的ORF序列,其长度为2 727 bp。在已经构建条斑紫菜tps基因原核表达载体pET22b-Pytps的基础上,用Phtps基因替代该表达载体中的Pytps基因,获得了Phtps基因的原核表达载体pET22b-Phtps。重组菌BL21(pET22b-Phtps)经IPTG诱导,SDS-PAGE显示获得了约100 kDa的特异性蛋白条带;目测及OD600的测定结果表明重组菌的耐盐性明显高于对照菌,即Phtps基因的表达提高了重组菌的耐盐性。为利用Phtps基因进行作物耐盐等抗逆转基因改良提供了依据。

关键词：坛紫菜 tps基因原核表达重组菌耐盐性

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紫苏tps基因鉴定及功能分析

紫苏TPS基因鉴定及功能分析

作者：杨仕梅贵州大学

学位级别：硕士

萜类挥发油是植物体的重要组成物质,参与植物生长发育、逆境胁迫响应、香味和口感形成等的调控。紫苏是一种富含挥发油的重要油料作物,其萜类挥发油合成调控关键基因的发掘和功能分析,可为高产、抗逆、高品质作物新种质创制提供重要的... 详细信息

萜类挥发油是植物体的重要组成物质,参与植物生长发育、逆境胁迫响应、香味和口感形成等的调控。紫苏是一种富含挥发油的重要油料作物,其萜类挥发油合成调控关键基因的发掘和功能分析,可为高产、抗逆、高品质作物新种质创制提供重要的基因来源。本研究在对紫苏挥发油化学类型鉴定基础之上,利用转录组测序技术对紫苏萜类挥发油调控关键基因进行筛选分析,并通过模式植物拟南芥遗传转化分析候选基因功能。主要研究内容和结果如下:1.紫苏挥发油化学类型。通过GC-MS技术对4个不同品种的紫苏叶片进行挥发油检测,发现挥发油成分在不同品种中的相对含量存在较大差异,据此将它们分为紫苏醛型、紫苏酮型、紫苏烯型和薄荷酮型4种挥发油化学型,所含典型物质分别是紫苏醛68.01μg·ml、紫苏酮88.76μg·ml、紫苏烯71.65μg·ml、薄荷酮为61.20μg·ml。2.萜类挥发油合成调控关键基因。构建4个化学型紫苏的叶片cDNA文库和进行转录组测序,分析挥发油形成调控网络和发掘关键基因。发现在萜类挥发油形成过程中上调表达基因在紫苏醛型中为834条、紫苏酮型中373条、紫苏烯型中329条,薄荷酮型中542条,以紫苏醛型中参与萜类挥发油调控过程的基因最多,包括在该化学型中上调表达并存在于异戊二烯途径中,且和该途径其它基因共表达的萜类合成酶基因Pftps86。GO和KEGG富集分析发现,上述差异基因主要富集在异戊二烯途径,有78条基因参与该调控途径。基因组预测分析发现紫苏有3195条转录因子,其中75条上调并与异戊二烯途径中的15条Pftps基因共表达。根据上述结果得到萜类挥发油调控候选关键基因Pftps86,qRT-PCR分析证实该基因的表达一致性。3.Pftps基因家族特性。为探明Pftps86基因可能的性质和生物学作用,对其所在紫苏Pftps基因家族进行生物信息学分析。研究发现紫苏Pftps基因家族成员共有118条,分属5个亚族,以Pftps-a亚族最大,有64个家族成员,而Pftps86属于b亚族,其存在光响应、水杨酸等启动子元件。Pftps家族成员在系统发育、基因结构、表达特性、理化性质和顺式作用元件组成等方面均存在差异,表明Pftps基因家族较为复杂,功能丰富。4.Pftps基因的克隆。通过同源克隆技术从醛型紫苏中克隆了Pftps86基因,生物信息学分析表明该基因具有明显萜类合成酶保守结构域,ORF为1758bp,编码586个氨基酸,分子质量为68.18532 KDa,等电点(pI)为5.09,亲疏水性(GRAVY)为-0.347,编码蛋白为酸性亲水性蛋白。Pftps86基因与野生型紫苏的同源性最高,系统发育树发现其同野生型紫苏划分为一类。5.Pftps基因的生物学功能。构建以35S为启动子和GUS为报告基因的Pftps基因植物过表达载体pCambia2301-35S-Pftps,通过菌落PCR和Sal I/Bam H I双酶切进行载体构建验证。利用沾花法将Pftps基因遗传转化模式植物拟南芥开展基因功能研究。经GUS组织化学检测和基因组PCR鉴定,获得12株T代独立转基因植株。对T代进行qRT-PCR检测和生长发育观察,发现TP植株各生育期的发育比野生型(WT)快2-3d,植株高、种子大粒;TP拟南芥的叶脉和叶柄出现淡紫色变化。Pftps基因表达对受体植物的生长发育具有一定的促进作用。

关键词：紫苏转录组测序 tps基因萜类挥发油生长发育分子育种

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条斑紫菜tps基因TPP结构域的缺失突变

青岛农业大学学报（自然科学版） 2017年第3期34卷 196-199,215页

作者：王晓杰栾淑莉李怡君牛倩雅郭宝太青岛农业大学生命科学学院山东青岛266109 青岛欧易生物科技有限公司山东青岛266001

条斑紫菜6-磷酸海藻糖合成酶(tps)基因(Pytps)具有tps及TPP双结构域,以该基因的原核表达载体pET22b-Pytps为材料,利用双酶切片段替换法对该基因TPP结构域磷酸酶基序的编码框Box1与Box2进行了缺失突变。第一,用715bp缺失Box1的KpnI-EcoR... 详细信息

条斑紫菜6-磷酸海藻糖合成酶(tps)基因(Pytps)具有tps及TPP双结构域,以该基因的原核表达载体pET22b-Pytps为材料,利用双酶切片段替换法对该基因TPP结构域磷酸酶基序的编码框Box1与Box2进行了缺失突变。第一,用715bp缺失Box1的KpnI-EcoRI人工合成片段替换pET22b-Pytps中相应的片段,获得了缺失Box1的突变基因Pytps-Box1。第二,用661bp缺失Box2的EcoRI-HindII片段进行替换,获得了缺失Box2的突变基因Pytps-Box2。第三,在缺失Box1后,再通过替换缺失Box2,获得了同时缺失Box1与Box2的突变基因Pytps-Box1-Box2。本研究既获得了三种突变基因,又获得了其原核表达载体,为研究Pytps基因的编码活性提供了材料,奠定了基础。

关键词：条斑紫菜 tps基因 TPP结构域缺失突变

檀香单倍型基因组组装和萜类合成酶基因家族分析

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檀香单倍型基因组组装和萜类合成酶基因家族分析

作者：韩婉欣华中农业大学

学位级别：硕士

檀香(Santalum album L.)是一种生长缓慢、具有半寄生性根的热带树种,其心材和檀香油具有极高的经济价值和医用价值。檀香油中主要芳香物质是α-檀香醇和β-檀香醇,属于倍半萜物质,萜类合成酶(tps)是其合成通路中的关键酶。本研究结合... 详细信息

檀香(Santalum album L.)是一种生长缓慢、具有半寄生性根的热带树种,其心材和檀香油具有极高的经济价值和医用价值。檀香油中主要芳香物质是α-檀香醇和β-檀香醇,属于倍半萜物质,萜类合成酶(tps)是其合成通路中的关键酶。本研究结合多种测序技术构建檀香染色体级别的单倍型基因组,探究檀香基因组的序列特征,并着重对檀香tps基因家族进行生物信息学分析。(1)基于对檀香样品进行全基因组测序得到的Pac Bio CCS数据、Hi-C数据和Illumina数据进行分型组装,成功构建了檀香高质量的两个单倍型基因组。单倍型1/2基因组的大小分别为223.94 Mb和219.63 Mb,各自挂载到10条染色体上,scaffold N50分别为26.74 Mb和25.75 Mb。质量评估结果表明,单倍型1/2基因组具有较高的完整性,分别为98.10%、98.00%。(2)基因组从头注释结果表明,单倍型1/2基因组的重复序列占比分别为35.69%和34.21%,其以长末端重复(LTR)元件为主,GC含量分别为38.02%、34.83%。此外,串联重复序列(TR)分析结果表明,Cent S(单体为150 bp的TR)是檀香着丝粒区域的特征序列。同时结合LTR元件的密度分布发现,Copia型LTR的富集区域与Cent S在染色体上的位置相吻合,辅助验证了这一结果。(3)基于已报道檀香tps基因,分别在单倍型1/2基因组中同源搜索到50个同源基因。并结合纯/杂合区域分布地图发现,其多数属于杂合基因型。系统发育分析表明,檀香tps基因分为两个亚组,其中tps-a亚家族是檀香最大的tps基因家族。保守基序分析表明,Motif1和Motif6分别是hap1＿tps和hap2＿tps中最保守的基序。同时结合进化关系发现,tps-a家族成员在檀香中是相对保守的。染色体定位分析表明,檀香tps基因集中分布在基因组的少数位点,并呈现大量复制现象,说明其在进化过程中发生了扩张,助力了檀香香气物质的形成。综上,本研究首次构建檀香染色体级别基因组,为檀香科物种提供了良好的基因组资源;初次探究檀香着丝粒特征序列,为深入研究功能着丝粒提供了明确方向;系统解析檀香tps基因家族特征,为未来设计体外合成檀香醇工艺提供了重要参考,为解析檀香醇生物合成机制提供了有用信息。

关键词：单倍型基因组组装着丝粒 tps基因檀香醇檀香

茉莉酸甲酯诱导西瓜Cltps1基因的表达特性及其生物学信息分析

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分子植物育种 2016年第12期14卷 3299-3307页

作者：龙娅丽徐子健朱白婢江雪飞张文热带作物种质资源保护与开发利用教育部重点实验室(海南大学)/海南大学园艺园林学院海口570228 海南省农业科学院蔬菜研究所/海南省蔬菜生物学重点实验室海口571100

tps基因在海藻糖的积累过程中具有决定性作用,目前对tps亚家族Ⅰ型基因研究比较多,而对tps亚家族Ⅱ型基因研究较少。我们选取了西瓜Ⅱ型tps亚家族基因中的一个tps基因,命名为Cl tps1,对该基因进行了生物信息学分析。并进一步以二倍体西... 详细信息

tps基因在海藻糖的积累过程中具有决定性作用,目前对tps亚家族Ⅰ型基因研究比较多,而对tps亚家族Ⅱ型基因研究较少。我们选取了西瓜Ⅱ型tps亚家族基因中的一个tps基因,命名为Cl tps1,对该基因进行了生物信息学分析。并进一步以二倍体西瓜细胞为材料,利用q RT-PCR技术对Cl tps1基因在茉莉酸甲酯诱导下的表达特性进行了研究。结果表明Cl tps1基因的转录起始位点位于起始密码子上游1 332 bp处,启动子区域包含多个激素响应元件和逆境胁迫响应元件等;该基因编码的蛋白含有831个氨基酸,分子量为94 104.2 Da,理论等电点为5.57。该基因与拟南芥tps7基因同源性最高。而蛋白结构分析进一步暗示了该基因可能兼备tps活性和TPP活性。在茉莉酸甲酯施加了4 h后Cl tps1基因的表达量达到最高,整体变化呈现出先上升后下降的趋势。以上结果表明Cl tps1基因能迅速响应逆境胁迫,并通过促进海藻糖生物合成抵御逆境。本研究不仅为利用茉莉酸甲酯提高西瓜抗逆性提供了理论支持,而且为以后深入研究植物中Ⅱ型tps亚家族基因奠定基础。

关键词：西瓜 tps基因茉莉酸甲酯表达特性

不同温度驯化策略诱导优雅蝈螽海藻糖合成酶基因表达及血淋巴糖类含量变化

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应用昆虫学报 2017年第1期54卷 56-67页

作者：骞蕾阳寇晓艳董泽华常岩林周志军河北大学生命科学学院河北省无脊椎动物系统学与应用重点实验室保定071002

[目的]研究模拟野外温度骤变和缓慢升降温驯化对优雅蝈螽Gampsocleis gratiosa海藻糖合成酶(Trehalose-6-phosphate synthase,tps)基因表达量、血淋巴海藻糖及总糖含量的影响以及三者间的相关性。[方法]通过高通量转录组数据筛选,从优... 详细信息

[目的]研究模拟野外温度骤变和缓慢升降温驯化对优雅蝈螽Gampsocleis gratiosa海藻糖合成酶(Trehalose-6-phosphate synthase,tps)基因表达量、血淋巴海藻糖及总糖含量的影响以及三者间的相关性。[方法]通过高通量转录组数据筛选,从优雅蝈螽中克隆tps基因cDNA全长。采取模拟野外温度骤变和缓慢升降温两种温度驯化策略,以热电偶温度计测得优雅蝈螽体温与环境温度最为接近的温度值作为最适温度,实时荧光定量PCR测定优雅蝈螽tps表达,硫酸蒽酮法测定血淋巴海藻糖和总糖含量(以25℃最适温度作为对照)。[结果]克隆得到的tps基因命名为Ggtps(GenBank登录号:KU578006),全长3 225bp,包含2 430bp的开放阅读框,5'-非编码区(5'-untranslated region,5'-UTR)153 bp和3'-非编码区(3'-untranslated region,3'-UTR)642 bp。共编码809个氨基酸,预测的蛋白分子量(Mw)91.35 ku,理论等电点(pI)6.28。骤然降温阶段tps相对表达量呈先升高后降低的变化趋势,在15℃最高,与最适温度25℃差异显著。海藻糖相对含量在0℃显著高于25℃。总糖相对含量在0℃和10℃显著高于25℃。骤然升温阶段,tps相对表达量呈先降低后升高,再降低的变化趋势,40℃达到最高且与25℃差异显著。缓慢降温阶段tps相对表达量呈先升高后降低的变化趋势,在15℃和20℃显著高于25℃;海藻糖含量表现出先降低后升高的变化趋势,0℃显著高于25℃,总糖含量在0℃、10℃和20℃与25℃差异显著。缓慢升温阶段tps相对表达量先降低后升高,30℃和45℃显著低于25℃。海藻糖相对含量在40℃显著低于25℃。总糖相对含量呈先升高后降低的变化趋势,40℃和45℃显著高于25℃。不同温度驯化策略比较tps相对表达量在15℃、40℃差异显著;海藻糖相对含量在40℃和45℃差异显著;总糖相对含量在10℃和20℃差异显著;体温在30℃差异显著。[结论]温度驯化能够提高昆虫的抗逆能力,昆虫体内tps表达量和海藻糖合成量与其所处环境温度及作用时间密切相关。低、高温条件下tps的表达和海藻糖的积累模式不同。

关键词： tps基因海藻糖总糖温度实时荧光定量PCR