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植物雷帕霉素靶标蛋白（tor）激酶活性检测系统的构建及其底物筛选与鉴定

植物雷帕霉素靶标蛋白（TOR）激酶活性检测系统的构建及其底物筛...

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作者：段小莉福建农林大学

学位级别：硕士

雷帕霉素靶标激酶（Target of Rapamycin,tor）是真核生物中一类保守的丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶,作为一个分子开关能响应营养激素胁迫等信号调控蛋白翻译,细胞分裂与分化,细胞代谢,细胞自噬,细胞衰老,器官发育等众多生物学过程。这对固着... 详细信息

雷帕霉素靶标激酶（Target of Rapamycin,tor）是真核生物中一类保守的丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶,作为一个分子开关能响应营养激素胁迫等信号调控蛋白翻译,细胞分裂与分化,细胞代谢,细胞自噬,细胞衰老,器官发育等众多生物学过程。这对固着生长的植物来说极其重要,能帮助植物迅速对内外源信号做出反应以适应环境生存,所以植物tor激酶一直是植物领域研究热点。由于传统的体外或半体外tor激酶活性的检测方式依赖特异灵敏的磷酸化抗体且无法实时监测其时空变化阻碍了tor上游信号通路组分及机制的研究同时有限的下游组分限制了我们对tor蛋白生物学功能的认知。因此,本研究以拟南芥为材料,通过基因工程技术并结合细胞生物学方法初步建立了一套能快速高效检测植物体内tor激酶活性的监测系统,并利用正向遗传学等方法筛选到了两个tor下游信号通路成员。前期实验发现NIA1的核定位变化与tor的活性相关。在此基础上,利用原生质体系统和植物系统分别证明了tor激酶活性可以通过NR蛋白的细胞核-细胞质穿梭来表征。为构建一个纯粹的tor激酶检测系统,利用基因工程技术对NIA1蛋白中的关键结构域:Mo和NO结合位点以及核定位序列进行了改造。利用细胞生物学方法在原生质体系统对这些改造进行了验证,发现tor调控的NIA1的定位变化不依赖酶活功能,并且同时成功构建了额外添加的NLS（入核信号）或NES（出核信号）形式的NIA1基因作为本系统的阳性对照组,并证明NLS-NIA1的添加促使NIA1全部聚集在细胞核使我们直接观察到了NIA1的定位,而NES-NIA1也大部分富集于细胞质中,细胞核中富集量减少。总之,基于以上改造,本研究第一部分初步构建了以NIA1的核-质穿梭事件作为体内表征tor激酶活性强弱的检测体系,并为稳定体系的构建奠定了基础。正向遗传学等方法筛选到了tor下游信号组分。以根毛、根、叶、茎等表型为筛选模型,利用正向遗传学手段,通过前期大量筛选XVE-tor背景下的EMS突变体库并通过重鉴定最终获得了2个既能拮抗est又能拮抗tor的抑制剂Rap和torin2的突变体torsr9和torsr11,这两个突变体都表现为根生长被促进。回交实验表明torsr9和torsr11为隐性突变且为单基因控制符合孟德尔遗传定律。利用全基因组测序及生物信息方法对这两个突变体进行了SNPs测序及分析,torsr9最终定位了2个候选基因GLUTAMYL/GLUTAMINYL-TRNA SYNTHETASE和SK11,torsr11最终定位了7个候选基因,ATVT-1,AIR9,ZW10,GA2OX3,WRKY33,ROS1,LOS2以及DUF827。进一步利用分子检测和生物化学方法对候选基因进行初步鉴定,torsr9突变体中的2个侯选基因均被检测到,torsr11突变体中仅检测到ATVT-1,AIR9,ROS1,LOS2这4个候选基因。T-DNA插入突变体atvt-1,air9,zw10,ga2ox3对Rap和torin2的响应实验表明,atvt-1能拮抗Rap和torin2,根生长被促进,而air9,zw10和ga2ox3不能拮抗Rap和torin2,根生长被抑制。两者结果进一步说明ATVT-1是torsr11的候选基因,同时可初步确定候选基因AIR9,ZW10和GA2OX3表型的出现可能不是通过基因失活来实现的。除此之外利用生物化学方法初步探索了torsr9和torsr11对tor的上游营养信号糖和氮饥饿的响应,torsr9对糖和氮饥饿不敏感,torsr11仅对氮饥饿不敏感。总之本研究第二部分通过正向遗传筛选,鉴定到了两个tor下游信号通路新组分,它们可能参与到营养（碳,氮）-tor信号通路中并调控植物根,茎相关生长表型。这无疑将促进我们对tor激酶全新的研究和认知。

关键词：基因改造 tor激酶体内活性监测系统正向遗传筛选

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油菜素内酯和糖信号交叉调控植物干细胞命运决定机理研究

油菜素内酯和糖信号交叉调控植物干细胞命运决定机理研究

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作者：苏鑫山东大学

学位级别：硕士

植物干细胞与动物干细胞类似,调控着生命个体的形态建成。但不同之处在于植物采用了胚胎后形态建成模式,通过感知外界环境来调节自己器官的发生、发育、休眠和衰老等过程去适应环境。因此对植物来说,其干细胞的功能更为直接和重要。按... 详细信息

植物干细胞与动物干细胞类似,调控着生命个体的形态建成。但不同之处在于植物采用了胚胎后形态建成模式,通过感知外界环境来调节自己器官的发生、发育、休眠和衰老等过程去适应环境。因此对植物来说,其干细胞的功能更为直接和重要。按照个体发育的先后顺序,植物干细胞包括胚胎期的顶端干细胞、胚胎后期的侧生干细胞和再生过程中体细胞命运转变所建立的再生干细胞。这些不同类型的干细胞调控了植物的形态建成以及对环境的适应性。因此,为了进一步研究植物干细胞命运决定的分子机理,本论文主要围绕油菜素内酯（BR）和糖信号两种信号通路,以BR下游转录因子BRASSINAZOLE-RESISTANT1（BZR1）和糖信号下游重要激酶Target of Rapamycin（tor）为重点研究分子,以主根和不定根为研究对象,阐明二中信号分子调控干细胞命运决定的分子机制。实验结果包括以下两个方面:1,糖信号和油菜素内酯协同调控根尖静止中心（QC）细胞分裂:研究发现糖促进QC分裂。无糖条件下,QC分裂率为4%,而在1%、3%和5%蔗糖浓度下,QC分裂率明显增加,依次为35%、48%和60%。同样浓度的非代谢糖对QC分裂率无影响。说明糖分子参与QC干细胞分裂活性的调控并非由渗透作用引起,而与糖信号通路有关。进一步发现tor激酶突变体tor中QC分裂率降低50%左右,HXK1激酶突变体gin2-1中QC分裂率仅降低20%左右,说明糖促进QC分裂需要tor和HXK1激酶,且tor激酶更为重要。用外源BL处理发现其可恢复tor少QC分裂表型,进一步将BR信号增强突变体bzr1-1D杂交到tor中,同样可以恢复tor少QC分裂表型。而且发现BR受体缺失突变体bril-301对糖不敏感,而bzr1-1D对糖超敏感,进一步证实糖信号调控QC干细胞分裂活性依赖于BR信号。在分子水平,发现糖可以抑制BZR1蛋白在根尖干细胞中降解。tor激酶抑制剂AZD处理,WOX5的表达量降低,说明tor的激酶活性可以促进WOX5表达;且在同样处理的条件下,bzr1-1D中WOX5的表达量要高于野生型中WOX5的表达,暗示在tor激酶失活时,虽然自噬途径打开,但bzr1-1D中的BZR1蛋白由于位于核内而不被降解,仍能促进WOX5表达。说明糖信号通过下游tor激酶,抑制BR下游BZR1蛋白降解,提高QC细胞中WOX5的表达,从而促进QC分裂。该研究首次阐明糖作为信号分子促进根尖干细胞的分裂依赖于BR信号,为根尖干细胞活性的研究提供了新的线索。2,糖信号和油菜素内酯都调控不定根形成:不定根是植物在离体受伤后,体内具有干细胞活性的原形成层细胞经过分裂分化在伤口处形成的根器官。研究发现糖信号促进不定根形成需要tor和HXK1激酶;而高浓度BL以及BR下游转录因子BZR1明显延迟和抑制不定根形成。在分子水平,发现BZR1抑制不定根起始基因WOX11及WOX12的表达。在遗传学上观察到35S::WOX11部分恢复bzr1-1D少不定根形成的表型,说明BZR1位于WOX11上游调控不定根形成。通过SEM扫描电镜观察及WIND家族基因qRT-PCR分析,目前认为bzr1-1D伤口处的白色细胞团可能不是愈伤组织。但是,关于BR和糖信号是否相互协调共同参与不定根的形成还有待进一步验证。此研究是在体外离体的条件下进行的,表明BZR1转录因子参与了体外离体再生过程,而且是负调控因子。

关键词： QC(静止中心) BZR1 tor激酶不定根 WOX11

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拟南芥MDN1突变引发的核糖体应激响应机制探究

拟南芥MDN1突变引发的核糖体应激响应机制探究

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作者：王静文山东师范大学

学位级别：硕士

细胞应激反应对植物的生长发育至关重要。当植物面对外界刺激或内源压力时,细胞应激系统首先使细胞适应特定的刺激并修复损伤,一旦刺激性损伤无法被消除,将触发细胞死亡信号通路。核糖体是细胞内具有翻译功能的核糖核蛋白颗粒,其生物合... 详细信息

细胞应激反应对植物的生长发育至关重要。当植物面对外界刺激或内源压力时,细胞应激系统首先使细胞适应特定的刺激并修复损伤,一旦刺激性损伤无法被消除,将触发细胞死亡信号通路。核糖体是细胞内具有翻译功能的核糖核蛋白颗粒,其生物合成过程复杂而有序,涉及大量核糖体组装因子。核糖体的合成过程对植物的生长发育十分重要,该过程一旦出现异常,会触发核糖体应激反应。核糖体应激抑制m RNA的翻译,导致全局蛋白质合成下降,从而通过负反馈机制控制基因的表达。植物核糖体应激通常使植株表现典型的生长缺陷,例如:主根变短、叶片变尖变窄、育性降低等。尽管动物细胞中的核糖体应激信号通路已经得到深入研究,但植物细胞中的具体机制尚不清楚。AAA-ATPase Midasin1(MDN1)是拟南芥中重要的pre-60S核糖体生物发生因子,在60S核糖体亚基的成熟过程中发挥作用并参与其核输出。mdn1-1是MDN1功能降低突变体,该突变体的MDN1基因发生错义突变,表现典型的核糖体应激表型。RNA-seq分析结果显示,mdn1-1突变体中NAC转录因子NAC044、NAC085以及NAC103相关基因表达上调,本研究以此为背景,探究了转录因子NAC044、NAC085以及NAC103在MDN1突变引发的核糖体应激中的作用。主要研究结果如下:1、本研究通过分析转录组数据,鉴定到mdn1-1突变体中NAC转录因子NAC044、NAC085以及NAC103相关基因的表达显著上调。为了直观地了解相关基因在mdn1-1突变体中的表达情况,本研究将ProNAC044:GUS报告株系与mdn1-1杂交,通过GUS染色法观察野生型及mdn1-1背景下NAC044启动子信号的分布,发现NAC044在mdn1-1突变体根尖、茎尖以及RAM等细胞分裂旺盛区域强烈表达。2、在mdn1-1背景下分别敲除NAC044、NAC085或NAC103的功能,突变体的根部缺陷以及植株半不育表型得到明显缓解,其中nac085-1/mdn1-1突变体的表型变化最明显,表明NAC044、NAC085和NAC103均在mdn1-1突变体的根发育缺陷以及育性降低中发挥作用,并且NAC085的作用效果最显著。3、为了探究NAC044、NAC085以及NAC103在mdn1-1突变体中是否存在功能冗余现象,本研究对杂交得到的三重突变体044-1/085-1/mdn1-1和044-1/103-11/mdn1-1进行表型分析,结果发现同时敲除两个转录因子后,突变体的表型与双突相比没有显著差异,这表明NAC044、NAC085、NAC103在mdn1-1突变体中各自发挥作用。另外,本研究在获得突变体的过程中发现,同时突变NAC103和NAC085会导致雄性不育。据此初步推测,NAC085可能与NAC103结合形成异源二聚体从而激活下游相关基因的表达。4、在植物DNA损伤反应中,NAC044、NAC085和NAC103均受SOG1的调控。为了探究mdn1-1突变体对核糖体应激的响应是否依赖DNA损伤信号通路,对突变体sog1-1/mdn1-1和atm-2/mdn1-1的表型进行观察,结果表明,sog1-1/mdn1-1和atm-2/mdn1-1的主根表型以及根尖结构与mdn1-1突变体相比没有显著差异。另外RNA-seq分析发现,在mdn1-1背景中,NAC044、NAC085和NAC103的表达不受SOG1的介导。以上结果说明MDN1突变引发的核糖体应激响应不依赖SOG1介导的DNA损伤信号通路。5、NAC044、NAC085和NAC103在mdn1-1突变体中发挥作用导致根尖分生区细胞数目减少,为了探究这一现象的具体机制,本研究通过EdU染色观察不同突变体根尖分生区进入S期的细胞密度。结果发现与野生型相比,mdn1-1以及sog1-1/mdn1-1突变体根尖分生区进入S期的细胞密度减小;而在nac085-1/mdn1-1突变体中,多数根尖分生区细胞进入S期,这表明mdn1-1突变体根尖分生区细胞数目减少是由于细胞周期进程受到影响,NAC085在mdn1-1根尖细胞的G1/S阻滞中发挥重要作用。将SMR5:NLS-GFP导入野生型及mdn1-1突变体,观察不同株系根尖细胞中SMR5启动子活性,结果发现由于核糖体合成缺陷,mdn1-1突变体根尖处SMR5的启动子活性显著提高,而RNA-seq分析表明,在nac044-1/mdn1-1、nac085-1/mdn1-1、nac103-11/mdn1-1和sog1-1/mdn1-1突变体中,NAC044、NAC085、NAC103以及SOG1功能的丧失均显著降低SMR5的表达。上述结果表明,NAC044、NAC085、NAC103以及SOG1参与mdn1-1突变体根尖细胞的细胞周期调

关键词：拟南芥核糖体应激 MDN1 NAC085 tor激酶

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