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tocp诱发OPIDN后鸡神经组织MAP-2的变化

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毒理学杂志 2005年第1期19卷 23-25页

作者：韩晓英程东赵秀兰崔宁李闪霞谢克勤于丽华朱振平山东大学公共卫生学院毒理学研究所山东济南250012 山东省疾病预防控制中心

目的　探讨微管相关蛋白 2 (MAP -2 )在三邻甲苯磷酸酯 (tocp)诱发的迟发性神经毒性 (OPIDN)中的含量变化及OPIDN的发病机制。方法　成年罗曼母鸡 18只 ,经口 1次给予tocp 3 75和 75 0mg kg ,第 2 2天处死动物 ,冷环境下取出大脑、脊髓... 详细信息

目的　探讨微管相关蛋白 2 (MAP -2 )在三邻甲苯磷酸酯 (tocp)诱发的迟发性神经毒性 (OPIDN)中的含量变化及OPIDN的发病机制。方法　成年罗曼母鸡 18只 ,经口 1次给予tocp 3 75和 75 0mg kg ,第 2 2天处死动物 ,冷环境下取出大脑、脊髓和坐骨神经 ,匀浆后WesternBlot方法测定MAP 2的含量。结果　tocp使鸡大脑沉淀中MAP -2在 3 75和 75 0mg/kg组分别升高 2 82 %和 3 60 % ,上清中分别升高 160 %和 2 0 4% ,与对照组相比 ,差异均有显著性 (P tocp中毒性可引起鸡神经组织中的MAP 2含量发生不同程度改变 ,这种改变可能与tocp引起的迟发性神经毒性有关。

关键词： MAP-2 OPIDN tocp 神经组织诱发迟发性神经毒性三邻甲苯磷酸酯 Western 微管相关蛋白坐骨神经发病机制含量变化罗曼母鸡 Blot 不同程度冷环境脊髓升高沉淀上清对照组显著性中毒性大脑

tocp对SK-N-SH细胞miRNA表达谱的影响及自噬相关基因的预测

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TOCP对SK-N-SH细胞miRNA表达谱的影响及自噬相关基因的预测

作者：唐乖南华大学

学位级别：硕士

目的鉴定来源于三邻甲苯基磷酸酯(Tri-ortho-cresyl phosphate,tocp)诱导人神经母细胞瘤细胞SK-N-SH细胞自噬中的micro RNA(mi RNA)表达谱,获得tocp诱导神经细胞自噬差异表达的mi RNA信息;初步探讨mi RNA在tocp诱导SK-N-SH细胞自噬中的... 详细信息

目的鉴定来源于三邻甲苯基磷酸酯(Tri-ortho-cresyl phosphate,tocp)诱导人神经母细胞瘤细胞SK-N-SH细胞自噬中的micro RNA(mi RNA)表达谱,获得tocp诱导神经细胞自噬差异表达的mi RNA信息;初步探讨mi RNA在tocp诱导SK-N-SH细胞自噬中的作用与机制,进一步阐明mi RNA与细胞自噬的关系,为更深层研究tocp诱导的细胞自噬提供实验及理论依据。方法1.体外培养人神经母细胞瘤细胞SK-N-SH细胞株,MTT法检测不同浓度tocp(0、0.25、0.5、0.75、1.0 m M)对SK-N-SH细胞增殖的影响,确定自噬细胞模型中tocp染毒剂量。2.用0、0.25、0.5 m M tocp处理SK-N-SH细胞24 h收获细胞作为实验组,以HBSS处理细胞10 h为对照组,分别提取总RNA进行小RNA测序,获得tocp诱导SK-N-SH细胞自噬的mi RNA表达谱。3.应用生物信息学软件筛选差异倍数较大(前20位)的mi RNA进行靶基因网络分析,预测与关键自噬基因相关的mi RNA,再用q RT-PCR实验验证小RNA测序结果。4.采用生物信息学方法预测mi R-381-3P的靶基因,采用PCR方法调取靶基因3?UTR片段,基因工程方法构建双荧光素酶表达载体。双荧光素酶实验验证目的hsa-mi R-381-3p与靶基因3?UTR之间的靶向关系。结果***法检测结果显示,tocp染毒处理24 h,细胞增殖受到明显的抑制,并呈现一定的剂量依赖关系,其24 h半数抑制浓度(IC50)为0.65 m M。2.通过小RNA测序筛查发现,与0 m M组相比,tocp和Hank’s液处理组细胞的mi RNA表达谱发生明显改变。其中0.25 m M组中表达上调超过2倍以上差异的mi RNA有10个,如hsa-mi R-1285-5p、hsa-mi R-192-3p、hsa-mi R-7976等;表达下调超过2倍以上差异的mi RNA有25个,如hsa-mi R-326、hsa-mi R-4448、hsa-mi R-31-3p等。0.5 m M组中表达上调超过2倍以上差异的mi RNA有19个,如hsa-mi R-2355-3p、hsa-mi R-127-3p、hsa-mi R-7978等;表达下调超过2倍以上差异的mi RNA有22个,如hsa-mi R-362-3p、hsa-mi R-153-5p、hsa-mi R-6866-5p等。HBSS组表达上调超过2倍以上差异的mi RNA有45个,如hsa-mi R-1468-5p、hsa-mi R-20a-3p、hsa-mi R-7978等。表达下调超过2倍以上差异的mi RNA有44个,如hsa-mi R-122-5p、hsa-mi R-3195、hsa-mi R-148a-3p等。3.经靶基因网络功能分析以及结合既往报道过的自噬相关的明确的关键靶基因,选取显著差异表达的mi R-1285-5p、mi R-20a-3p、mi R-210-5p、mi R-155-5p、mi R-6866-3p、mi R-381-3p进行q RT-PCR验证,证明测序结果基本可信,其中mi R-381-3p在0.25 m M和0.5m M tocp处理后出现表达持续下调,可初步作为下一步研究的目标mi RNA。4.应用mi RNA生物信息学预测工具(Target Scan、mi RDB、mi Randa、CLIP-seq和mi RBase)初步预测,自噬相关基因RPS6KA33?UTR与mi R-381-3p的seed部位有着互补结合。应用PCR方法调取RPS6KA3基因3?UTR序列,构建到荧光素酶表达载体上。构建的载体经测序和比对分析确认位置和序列的正确性。分别将RPS6KA3的野生型、突变型以及PC-mi R-424 inhibit sponge克隆到载体pmir Glo中,与mi R-381-3p mimic或NC共同转染进入239T。结果发现,共转染后RPS6KA3的荧光值活性降低到54%(P?0.05)。而共转染mi R-381-3p mimic与突变体荧光素酶载体,荧光素酶的活性无改变。结论***可诱导SK-N-SH细胞mi RNA的表达谱发生显著改变。***6KA3是mi R-381-3p的靶基因之一,其可能作为一种自噬相关基因参与tocp诱发的SK-N-SH细胞自噬的发生和发展过程。

关键词： SK-N-SH细胞 tocp miRNA 自噬 RPS6KA3

tocp对人成神经瘤SH-SY5Y细胞PKC活性及转位的影响

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TOCP对人成神经瘤SH-SY5Y细胞PKC活性及转位的影响

作者：江岚南华大学

学位级别：硕士

目的：研究三邻甲苯基磷酸酯（Tri-ortho-cresyl phosphate，tocp）同时结合应用工具药蛋白激酶C（Protein kinase C，PKC）激活剂佛波酯（phorbol12-myristate13-acetate，PMA）和PKC抑制剂星胞菌素（staurosporine，SP）处理人成神经瘤细胞SH-SY5Y不同时间后，观察细胞中PKC的活性、PKC转位及表达的影响，为解释tocp毒害作用奠定基础，拓宽对tocp致神经毒性的认识，而且有助于进一步理解和揭示神经退行性病变的机理具有重要的理论意义。方法： 1.以人成神经瘤细胞系SH-SY5Y细胞为实验材料进行培养，使用tocp（0，0.25，0.5，1.0mmol/L）进行染毒，染毒时间12，24和48小时。通过普洛麦格公司的PKC活性检测试剂盒检测PKC的活性。根据PKC活性的检测结果，进一步结合使用工具药PKC激活剂PMA（0，25，100nmol/L）和PKC抑制剂SP（100nmol/L）作用SH-SY5Y细胞，染毒12，24和48小时后分别检测细胞内PKC的活性。 2．同上条件，以tocp及工具药PMA和SP作用SH-SY5Y细胞后，间接免疫荧光技术检测PKC在细胞内的定位，荧光倒置显微镜观察结果。 3．同上条件，以tocp及工具药PMA和SP作用SH-SY5Y细胞后，Westernblotting检测胞膜PKCα、PKCβI、PKCβⅡ、总PKC和总PKC磷酸化蛋白的表达。结果： 1.0.5mmol/L tocp作用于SH-SY5Y细胞24小时，PKC蛋白磷酸化水平发生变化，磷酸化PKC蛋白增多;1.0mmol/L作用细胞12小时和24小时，随着tocp染毒时间的延长，磷酸化PKC蛋白逐渐增多;对凝胶电泳条带进行灰度扫描并进行统计学分析，结果发现，0.5mmol/L tocp染毒24小时以及1.0mmol/Ltocp染毒12和24小时，细胞内磷酸化PKC/非磷酸化PKC（p-PKC/PKC）灰度比值与对照组比较有统计学意义（Ptocp染毒浓度高，染毒时间长均可见p-PKC/PKC增加。提示，在实验组的染毒剂量中，1.0mmol/L tocp作用SH-SY5Y细胞24h诱导PKC活性最强。100noml/L PMA作用SH-SY5Y细胞12小时，100noml/L SP作用SH-SY5Y细胞12小时，PKC蛋白磷酸化水平发生变化，磷酸化PKC蛋白增多;100noml/L PMA作用SH-SY5Y细胞24小时和48小时，100noml/L SP作用SH-SY5Y细胞24小时和48小时，随着PMA作用时间的延长，磷酸化PKC蛋白逐渐增多;对凝胶电泳条带进行灰度扫描并进行统计学分析，结果发现，25noml/L PMA作用SH-SY5Y细胞24小时和48小时以及100noml/L PMA作用SH-SY5Y细胞12、24小时和48小时，和100noml/L SP作用SH-SY5Y细胞12小时、24小时和48小时，细胞内磷酸化PKC/非磷酸化PKC（p-PKC/PKC）灰度比值与对照组比较有统计学意义（Ptocp作用SH-SY5Y细胞24小时后，细胞形状改变由梭形和多角形变成圆形，绿色荧光由细胞质向细胞膜周边转位，膜荧光强度增强。 3.应用100noml/L PMA和100noml/L SP预处理，tocp作用SH-SY5Y细胞24小时后，tocp与PMA共同作用，tocp与PMA分别作用SH-SY5Y细胞24小时，PKC各种异构体蛋白表达增强。SP与tocp共同作用和SP单独作用SH-SY5Y细胞24小时，PKC各种异构体蛋白表达下降。结论： 1.1.0mmol/Ltocp作用SH-SY5Y细胞24小时能激活细胞内PKC活性，并促进PKCα、βI和βⅡ的膜转位。 2. PKC激活剂佛波酯（PMA）和PKC抑制剂星胞菌素（SP）分别能够增强和抑制tocp诱导的PKC激活和膜转位效应。

关键词： tocp PKC SH-SY5Y细胞 PMA SP

PKCα在tocp抑制SK-N-SH细胞自噬中的作用及机制研究

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PKCα在TOCP抑制SK-N-SH细胞自噬中的作用及机制研究

作者：邓强南华大学

学位级别：硕士

目的:探讨PKCα在tocp影响SK-N-SH神经细胞自噬的作用及机制。方法:***-N-SH细胞经tocp(0 mmol/L)染毒,通过MTT法测定该化合物对细胞增殖的影响,并利用SPSS软件算出SK-N-SH细胞暴露于tocp(48 h)的半数抑制浓度(IC50),并确定后期实验的... 详细信息

目的:探讨PKCα在tocp影响SK-N-SH神经细胞自噬的作用及机制。方法:***-N-SH细胞经tocp(0 mmol/L)染毒,通过MTT法测定该化合物对细胞增殖的影响,并利用SPSS软件算出SK-N-SH细胞暴露于tocp(48 h)的半数抑制浓度(IC50),并确定后期实验的染毒剂量。***-N-SH细胞经tocp(0 mmol/L)染毒,通过荧光分光光度仪测定细胞内蛋白酶体活性,Western blot检测PKCα蛋白、pPKCα蛋白、自噬蛋白(P62、Beclin 1、LC3II/LC3I)、自噬受体蛋白(OPTN、NBR1)、细胞骨架蛋白(p-Tau、NF-H、MAP2)和泛素化蛋白(Ub)表达水平。使用了透射电子显微镜观察自噬体的生成情况。***-N-SH细胞经PKCα激活剂(PMA)和抑制剂(SP)预处理0.5 h后,0.75 mmol/L tocp染毒48 h,过荧光分光光度仪测定细胞内蛋白酶体活性,Western blot检测PKCα蛋白、p-PKCα蛋白、自噬蛋白(P62、Beclin 1、LC3II/LC3I)、自噬受体蛋白(OPTN、NBR1)、细胞骨架蛋白(p-Tau、NF-H、MAP2)和泛素化蛋白(Ub)表达水平。免疫荧光法测定PKCα蛋白和自噬相关蛋白(LC3和P62)的蛋白表达水平来进一步验证WB的结果;结果:***数据表明,当SK-N-SH细胞暴露于tocp(48 h)后,细胞生长形态发生改变以及增殖速度显著减慢。***-N-SH细胞暴露于tocp(48 h)后,细胞内PKCα活性显著增加;用PKCα激活剂(PMA)和抑制剂(SP)预处理后再经tocp染毒,发现激活剂能使tocp所诱导的细胞内PKCα活性上升(Ptocp、PMA和PMA+tocp三组细胞内PKCα活性(p-PKCα/PKCα)、自噬蛋白(LC3Ⅱ/LC3I和P62)水平增加(Ptocp两组细胞内PKCα活性(p-PKCα/PKCα)、自噬蛋白(LC3Ⅱ/LC3I和P62)水平(Ptocp、PMA和PMA+tocp三组处理能够抑制细胞内蛋白酶体活性,泛素化蛋白(Ub)积累(P<0.05)。结论:***能够使细胞内PKCα活性增加。***通过激活PKCα活性,增加自噬蛋白(LC3II/LC3I、P62)表达水平,降解OPTN,并累积了NBR1蛋白,从而抑制细胞自噬流。***通过激活PKCα活性降解骨架相关蛋白NF-H和p-Tau的累积。***通过激活PKCα使SK-N-SH细胞中蛋白酶体(Proteasome)活性降低,泛素化蛋白积聚,使泛素-蛋白酶体系统(UPS)受损,UPS功能障碍可以刺激自噬作为补偿途径。

关键词： SK-N-SH PKCα tocp 蛋白酶体 UPS 自噬

自噬在tocp诱发成年母鸡迟发性神经毒性中的作用探讨

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自噬在TOCP诱发成年母鸡迟发性神经毒性中的作用探讨

作者：贺丽南华大学

学位级别：硕士

目的：利用三邻甲苯基磷酸酯（Tri-ortho-cresyl phosphate, tocp）诱导建立成年母鸡迟发性神经病（OPIDN）的模型，观察细胞自噬在tocp诱发的迟发性神经毒性发生、发展过程中的变化，揭示自噬与tocp诱发OPIDN的联系，探索OPIDN发生的... 详细信息

目的：利用三邻甲苯基磷酸酯（Tri-ortho-cresyl phosphate, tocp）诱导建立成年母鸡迟发性神经病（OPIDN）的模型，观察细胞自噬在tocp诱发的迟发性神经毒性发生、发展过程中的变化，揭示自噬与tocp诱发OPIDN的联系，探索OPIDN发生的可能机制。为进一步了解和揭示神经退行性病变的机理提供理论依据。方法：将实验母鸡随机分为对照组和实验组，实验组35只，对照组7只。实验组喂以装有tocp（剂量为750mg/kg）的医用胶囊，进行一次染毒,对照组则喂以装有等量植物油的胶囊，观察实验鸡的迟发性神经毒性的发生情况，分别在不同时间点（染毒1d、3d、5d、7d、10d、14d、21d）处死动物，分离脊髓与坐骨神经，Western blot法测定自噬相关蛋白LC3的表达，取部分新鲜脊髓与坐骨神经组织固定供作制备石蜡切片和电镜切片，光镜下观察常规病理学改变，免疫组织化学法检测溶酶体相关膜糖蛋白LAMP-1的表达，透射电镜技术观察组织的超微结构。结果：1.一般情况：染毒后实验鸡活动减少，食量减退，于染毒第三天后活动和食量恢复到染毒前水平,第7天开始出现OPIDN症状，实验组第14天、第21天母鸡体重增长率与对照组比较下降（Ptocp染毒后第7天左右出现肢体活动减少、下肢行走轻微不协调;第10天时出现共济失调，好蹲坐，双下肢无力，行走不稳，症状随时间延长呈进行性加重，第15天，行走极不协调，经常跌倒，并逐渐加重，第18天，症状严重的动物出现瘫痪，不能站立，直至第21天实验结束，期间动物正常进食及饮水。对照组动物未观察到任何OPIDN症状。3. HE染色结果：脊髓神经元细胞较对照组明显肿胀，部分细胞胞浆淡染，胞核模糊不清;神经元细胞出现核固缩和细胞胞浆空泡化;坐骨神经纤维排列稀疏、肿胀，着色变淡和结构紊乱。4.电镜结果：正常的神经组织中小胶质细胞和神经元形态正常，髓鞘紧密，板层清晰。坐骨神经的髓鞘葱管样改变明显且模糊不清晰，多处板层松散、破裂甚至崩解。5.随着染毒时间的延长，实验鸡的OPIDN症状加重，分别用Western blot、免疫组化法检测鸡脊髓、坐骨神经自噬相关蛋白LC3-Ⅱ的表达，随着染毒时间的延长，蛋白表达增多，说明tocp诱发的OPIDN可能跟自噬有关。6.免疫组化法检测实验鸡脊髓、坐骨神经LAMP-1的表达，随着染毒时间的延长，蛋白表达增多，存在一定的时效关系。结论：1. tocp（750mg/kg）一次性胶囊喂饲法染毒成年母鸡21天，实验母鸡出现迟发性神经毒性，受试动物脊髓、坐骨神经出现中毒表现，染毒时间越长，中毒表现越严重。***对实验母鸡脊髓、坐骨神经中的自噬相关蛋白LC3和溶酶体相关膜糖蛋白（LAMP-1）的表达有影响，随着染毒时间的延长，蛋白表达均增多;tocp诱发的成年母鸡OPIDN可能与自噬的发生有关。

关键词： tocp OPIDN 成年母鸡自噬 LC3 LAMP-1

SIRT1在tocp致SK-N-SH细胞G1期阻滞中的保护作用及机制研究

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SIRT1在TOCP致SK-N-SH细胞G1期阻滞中的保护作用及机制研究

作者：石晟源南华大学

学位级别：硕士

目的:三邻甲苯磷酸酯(Tri-ortho-cresyl phosphate,tocp)作为一种应用广泛的化工原料,在工业生产中发挥重要作用。由于公众对其认识不足,在世界各地均有报道由tocp引发的毒作用事件。人成神经母瘤SK-N-SH细胞系因其代谢特点、超微结构... 详细信息

目的:三邻甲苯磷酸酯(Tri-ortho-cresyl phosphate,tocp)作为一种应用广泛的化工原料,在工业生产中发挥重要作用。由于公众对其认识不足,在世界各地均有报道由tocp引发的毒作用事件。人成神经母瘤SK-N-SH细胞系因其代谢特点、超微结构和生化反应与正常神经细胞类似,可无限传代且易于复制神经细胞的病理状态,弥补了终末分化神经细胞在体外培养过程中的缺点,因而常被用作神经细胞模型。为预防tocp的毒性效应,我们以体外实验为基础探究沉默信息调节因子2同源蛋白1(Silent information regulator 2 homolog 1,SIRT1)对tocp导致的G1期阻滞的保护机制,期望为tocp中毒的防治提供新的思路。方法:***终浓度为0,0.25,0.5,0.75,1.0 mmol/L处理48 h和tocp终浓度为0.75 mmol/L处理0,12,24,36,48 h后用流式细胞术检测SK-N-SH细胞周期阻滞情况;2.0.75 mmol/L tocp处理48 h后用Western Blot检测内质网应激相关蛋白的表达水平;3.抑制C/EBP同源蛋白(C/EBP homologous protein,CHOP)后,0.75 mmol/L tocp处理48 h后用流式细胞术检测SK-N-SH细胞G1期阻滞情况,Western Blot检测与G1期阻滞相关蛋白的表达水平;4.抑制基质相互作用分子1(Stromal interactive molecules 1,STIM1)后,0.75 mmol/L tocp处理48 h后用流式细胞术检测SKN-SH细胞G1期阻滞情况,Western Blot检测与G1期阻滞和内质网应激相关蛋白的表达水平;5.过表达SIRT1后,0.75 mmol/L tocp处理48 h后用流式细胞术检测SK-N-SH细胞G1期阻滞情况,Western Blot检测与G1期阻滞、内质网应激和SOCE相关蛋白的表达水平。结果:1.0.75 mmol/L tocp处理48 h后,SK-N-SH细胞阻滞在G1期,STIM1、P21和内质网应激相关蛋白表达增加,ORAI1、SERCA2和SIRT1蛋白表达降低;2.抑制CHOP表达缓解tocp导致的SK-N-SH细胞G1期阻滞,抑制STIM1表达缓解tocp导致的SK-N-SH细胞内质网应激和G1期阻滞;3.过表达SIRT1下调tocp导致的SK-N-SH细胞STIM1、P21和内质网应激相关蛋白表达,恢复SERCA2表达并缓解G1期阻滞。结论:***通过影响SOCE导致内质网应激进而诱导SK-N-SH细胞G1期阻滞;2.过表达SIRT1通过调节SOCE和内质网应激缓解tocp诱导的SK-N-SH细胞G1期阻滞。

关键词： tocp SOCE 内质网应激 SIRT1 细胞周期阻滞

IP3R在tocp调节的神经细胞自噬中的作用与机制

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IP3R在TOCP调节的神经细胞自噬中的作用与机制

作者：杨越南华大学

学位级别：硕士

目的:本研究拟通过体外细胞实验,对神经细胞中肌醇1,4,5三磷酸受体（Inositol 1,4,5-trisphosphate receptor,IP3R）在三邻甲苯基磷酸酯（Tri-ortho-cresyl phosphate,tocp）调节的神经细胞自噬中的作用开展研究,以揭示与自噬发生所相... 详细信息

目的:本研究拟通过体外细胞实验,对神经细胞中肌醇1,4,5三磷酸受体（Inositol 1,4,5-trisphosphate receptor,IP3R）在三邻甲苯基磷酸酯（Tri-ortho-cresyl phosphate,tocp）调节的神经细胞自噬中的作用开展研究,以揭示与自噬发生所相关的调节机制。方法:应用人神经母细胞瘤SK-N-SH和小鼠成神经瘤细胞N2a为体外模型进行实验。1、不同浓度的tocp（0 mmol/L、0.25 mmol/L、0.50 mmol/L、0.75mmol/L、1.00 mmol/L）处理SK-N-SH细胞48 h、不同浓度的tocp（0μmol/L、25μmol/L、50μmol/L、75μmol/L、100μmol/L）处理N2a细胞24 h,MTT法检测细胞存活率,Western Blotting检测自噬相关蛋白P62和LC3 II/LC3 I蛋白表达。2、tocp（0.75 mmol/L）处理SK-N-SH细胞48 h、tocp（75μmol/L）处理N2a细胞24 h（后续实验中,tocp均使用此处理浓度及时间）,间接免疫荧光法检测细胞内LC3荧光斑点累积情况,透射电子显微镜观察两种细胞内自噬体数量。3、细胞磷脂酶C（Phospholipase C,PLC）抑制剂U73122预处理两种细胞30min后与tocp共处理细胞,比色法检测细胞内PLC活性,竞争抑制酶联免疫吸附试验检测细胞内游离肌醇1,4,5三磷酸（Inositol1,4,5-trisphosphate,IP3）水平,Western Blotting检测IP3R三种亚型蛋白、自噬相关蛋白P62和LC3 II/LC3 I蛋白表达。4、IP3R抑制剂Xestospongia C和兰尼碱受体（Ryanodine receptor,RyR）抑制剂Ryanodine预处理细胞30min后与tocp共处理两种细胞,应用荧光分光光度计检测细胞内游离钙离子浓度,通过Western Blotting检测RyR蛋白、IP3R三种亚型蛋白、自噬相关蛋白P62和LC3 II/LC3 I蛋白表达。5、单独使用tocp处理两种细胞,免疫荧光双标记法观察IP3R和Beclin 1共定位情况,免疫共沉淀观察IP3R和Beclin 1的相互作用。结果:1、不同浓度tocp处理SK-N-SH细胞及N2a细胞后,两种细胞存活率随着tocp浓度的增加明显降低（Ptocp处理两种细胞后,相对于对照组,两种细胞内LC3累积水平（Ptocp共处理两种细胞,tocp处理组相对于对照组,两种细胞中PLC活性明显升高（Ptocp处理组,PLC活性有所下降（Ptocp共处理两种细胞,tocp处理组相对于对照组,细胞内游离钙离子浓度升高（Ptocp处理组,细胞内游离钙离子浓度有所下降（Ptocp处理两种细胞后,相对于对照组,IP3R三种亚型蛋白与Beclin 1蛋白共定位情况明显减少,相互作用明显降低（Ptocp可降低SK-N-SH细胞及N2a细胞存活率,抑制SK-N-SH细胞及N2a细胞内自噬流,引起自噬体累积现象。2、tocp可介导PLC-IP3-IP3R通路,引起IP3R和RyR钙离子通道开放,介导细胞内钙离子紊乱并抑制SK-N-SH

关键词： tocp 肌醇1,4,5三磷酸受体自噬流细胞磷脂酶C

铁死亡在tocp诱导人成神经母瘤SK-N-SH细胞毒性中的作用及分子机制研究

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铁死亡在TOCP诱导人成神经母瘤SK-N-SH细胞毒性中的作用及分子机...

作者：宋晓华南华大学

学位级别：硕士

目的:结合细胞实验,探究铁死亡在tocp诱发神经细胞毒性中的作用和机制。方法:1.以人成神经母瘤SK-N-SH细胞为研究模型,经梯度浓度tocp染毒48h或经铁死亡抑制剂DFO(100μM)、Fer-1(10μM)预处理6 h后再经tocp(0.75 m M)处理48 h,CCK-8检... 详细信息

目的:结合细胞实验,探究铁死亡在tocp诱发神经细胞毒性中的作用和机制。方法:1.以人成神经母瘤SK-N-SH细胞为研究模型,经梯度浓度tocp染毒48h或经铁死亡抑制剂DFO(100μM)、Fer-1(10μM)预处理6 h后再经tocp(0.75 m M)处理48 h,CCK-8检测细胞活性;2.采用流式细胞术结合倒置荧光显微镜检测tocp染毒后SK-N-SH细胞中脂质过氧化状况及线粒体膜电位;3.利用荧光分光光度计检测tocp处理后SK-N-SH细胞中MDA含量,微孔板酶标法测定SOD、GSH-GSSG含量;*** Blot结合免疫荧光检测SLC7A11、GPX4、ACSL4、FTH1、NCOA4、LC3 II/I、P62等蛋白表达;5.采用Giemsa染色观察tocp处理后细胞形态,透射电子显微镜观察细胞及线粒体超微结构。结果:1.相比于对照组,铁死亡抑制剂DFO(100μM)、Fer-1(10μM)能够阻止tocp诱导的SK-N-SH细胞活性降低;***暴露能够使SK-N-SH细胞形态改变,胞质收缩,胞核减小,损伤线粒体形态和功能,造成线粒体皱缩变圆、嵴消失或减少、电子致密团块形成、膜破裂及线粒体膜电位降低;***能够诱导SK-N-SH细胞发生脂质过氧化,使SOD、GSH/GSSG比例降低,MDA含量升高,铁死亡抑制剂DFO(100μM)、Fer-1(10μM)预处理能够减轻其脂质过氧化程度;4、tocp暴露后能产生大量ROS并攻击膜上的PUFAs,使PUFAs发生脂质过氧化,同时tocp能够激活ACSL4,合成更多的PUFAs,促进SK-N-SH细胞脂质过氧化物的形成,铁死亡抑制剂DFO(100μM)、Fer-1(10μM)预处理能够减少ACSL4的表达;5、tocp激活NCOA4和P62,促使FTH1与LC3II结合并转移至自噬体和溶酶体,发生铁蛋白自噬降解,释放出储存的亚铁离子破坏SK-N-SH细胞铁稳态平衡,加剧细胞内氧化应激和脂质过氧化,铁死亡抑制剂DFO(100μM)、Fer-1(10μM)预处理能够减轻铁蛋白自噬;6、tocp通过抑制SLC7A11表达阻碍x CT转运胱氨酸,使合成GSH和GPX4原料不足,引起GPX4清除脂质过氧化物的能力下降,导致SK-N-SH细胞发生铁死亡,铁死亡抑制剂DFO(100μM)、Fer-1(10μM)预处理能够抑制该趋势。结论:tocp可通过促进铁蛋白自噬途径诱发SK-N-SH细胞铁死亡。

关键词： tocp 脂质过氧化铁死亡铁蛋白自噬

钙信号转导在tocp诱导SH-SY5Y细胞自噬中的作用

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钙信号转导在TOCP诱导SH-SY5Y细胞自噬中的作用

作者：肖双南华大学

学位级别：硕士

目的研究三邻甲苯基磷酸酯（Tri-ortho-cresyl phosphate，tocp）的神经毒性机制，观察tocp对calpain和蛋白酶体活性的影响，研究细胞内钙紊乱与钙信号转导对tocp诱导SH-SY5Y细胞产生自噬的作用机制，以及探讨磷酸化和泛素化蛋白的降解... 详细信息

目的研究三邻甲苯基磷酸酯（Tri-ortho-cresyl phosphate，tocp）的神经毒性机制，观察tocp对calpain和蛋白酶体活性的影响，研究细胞内钙紊乱与钙信号转导对tocp诱导SH-SY5Y细胞产生自噬的作用机制，以及探讨磷酸化和泛素化蛋白的降解机制。方法1.以RA诱导SH-SY5Y细胞分化，tocp（0、0.25、0.5、1.0mM）染毒未分化与已分化的SH-SY5Y细胞12h、24h和48h，以DMSO为对照组，采用20μM verapamil、100μM2-APB、20μM verapamil合并100μM2-APB分别预处理未分化与已分化的SH-SY5Y细胞15min再染毒1.0mM tocp48h，荧光分光光度计测calpain活性变化，并用Western Blot测钙通道抑制后LC3-II/I蛋白表达。2．500nM Calpastatin peptide ac184-210和自噬抑制剂3-MA（1.0mM）分别预处理未分化与已分化的SH-SY5Y细胞6h和4h后染毒1.0mM tocp48h，DMSO为对照组，收集细胞，Western Blot测LC3II/I和Beclin1蛋白的表达。3．不同浓度tocp染毒未分化与已分化的SH-SY5Y细胞48h，Western Blot测MAP2、p62和Ub蛋白的表达。4.培养未分化的SH-SY5Y细胞，用tocp（0、0.25、0.5、1.0mM）进行染毒，染毒时间分别为6h、12h、24h、48h和72h，荧光分光光度计测定20S和26S蛋白酶体活性变化。结果1. calpain活性变化：随着tocp染毒浓度和染毒时间增加，已分化与未分化的SH-SY5Y细胞内calpain活性升高（Ptocp发现，tocp诱导的calpain活性均一定程度地受到抑制（Ptocp染毒组LC3-Ⅱ的表达均显著增高（Ptocp染毒组比较，verapamil预处理组抑制tocp诱导的LC3-Ⅱ表达（P0.05，分化组：Ptocp诱导的LC3-Ⅱ表达，与对照组无差异（P>0.05），部分抑制Beclin1表达（Ptocp组LC3-Ⅱ和Beclin1均发生明显的抑制作用（Ptocp浓度增高，MAP-2和p62表达降低（Ptocp染毒未分化的SH-SY5Y细胞不同时间，与对照组比较，20S proteasome CT-L、T-L、PGPH和26S proteasomeCT-L、PGPH活性在不同染毒浓度和时间出现不同程度的升高，26S proteasomeT-L活性随着染毒浓度的增加和染毒时间的延长呈降低趋势，差异均有统计学意义（Ptocp能诱导已分化与未分化的SH-SY5Y细胞calpain活性，T/L-型钙离子通道和内质网上的IP3R参与细胞内钙信号转导。2. T/L-型钙离子通道造成细胞内calpain活性改变是tocp诱导自噬的重要原因。3. tocp能造成已分化与未分化的SH-SY5Y细胞泛素化积聚，抑制p62的表达，泛素化蛋白可能通过p62介导进入自噬溶酶体途径降解。

关键词： tocp calpain SH-SY5Y细胞自噬蛋白酶体