检索结果-南通市图书馆

作者：张娜山东大学

学位级别：硕士

目的近年来,越来越多的国家面临肝纤维化的困扰,肝纤维化已成为一个重要的全球卫生问题,研究并揭示其发生的确切分子机制成为防治该疾病的重要课题。肝纤维化的形成是一个动态过程,各种损伤因子刺激机体以后首先引起机体肝组织的炎症反... 详细信息

目的近年来,越来越多的国家面临肝纤维化的困扰,肝纤维化已成为一个重要的全球卫生问题,研究并揭示其发生的确切分子机制成为防治该疾病的重要课题。肝纤维化的形成是一个动态过程,各种损伤因子刺激机体以后首先引起机体肝组织的炎症反应,之后炎症反应激活免疫细胞分泌趋化因子、TGF-β1等细胞因子作用于人的肝星状细胞,使肝星状细胞转变成为活化状态的肌纤维母细胞,最终使其纤维Ⅰ型和Ⅲ胶原蛋白,蛋白聚糖和糖蛋白等细胞外基质增多,形成肝纤维化。现研究已知,TGF-β1激活的Smad信号通路是引起肝纤维化的经典通路,抑制Smad信号通路可以有效阻断该疾病的发生。研究并发现新的调控肝纤维化的分子,对揭示肝纤维化形成的分子机制及干预肝纤维化的进展与疾病转归意义重大。TIPE2 (Tumor necrosis factor-α-induced protein-8-like-2, tnfaip8l2)即肿瘤坏死因子a诱导蛋白8型2,与TIPE1 (tnfaip8l1, TNF-α-induced protein 8-like 1)、TIPE (tnfaip8)、TIPE3 (tnfaip8l3)同为肿瘤坏死因子α诱导蛋白8家族(tnfaip8)成员,结构上具有一定的同源序列。作为一个新型的抑炎分子,TIPE2在抑制炎症反应、维持机体免疫系统的平衡中发挥着重要的调节作用。各种原因造成的炎症反应是引起肝纤维化的病理基础,因而炎症反应往往在该疾病中发挥至关重要的作用。而TIPE2作为一个新型的抑炎分子,是否在肝纤维化过程中发挥一定的作用,其作用机制如何,目前尚未有文献报道。为此,本课题利用CCl4诱导TIPE2敲基因(TIPE2-/-)小鼠与野生型C57小鼠建立肝纤维化动物模型,对比研究TIPE2在肝纤维化中的作用,进而利用TGF-β1刺激肝星状细胞系lX-2细胞,研究TIPE2调控肝纤维化的分子机制,并探讨TIPE2调控肝纤维化的细胞信号通路,以期明确TIPE2在该疾病中的作用并揭示其机制,为阐明该疾病的发生机制及临床利用免疫调控分子干预治疗该疾病奠定一定的实验基础。研究方法1.体内实验研究TIPE2在肝纤维化模型中的作用1.1建立肝纤维化模型取6-8周的C57雄性小鼠,将其随机分为两组,模型组(n=20)每周两次腹腔注射给药(20%四氯化碳溶液,每g体重注射5μl),对照组(n=20)每周两次腹腔注射给药(橄榄油,每g体重注射5μl)。在第四周时,眼球取血4000 r/min离心10分钟后取上清,用流式细胞仪检测小鼠血清中MCP-1、TNF-α与Il-6等细胞因子的表达水平,用酶标仪与分光光度计检测AST与AlT的表达,ElISA方法检测TGF-β1的表达。在第二周与第四周时,小鼠常规方法处死后PBS灌流,取一份新鲜肝组织留待分子生物学检测,一份肝组织(经福尔马林固定)制备成病理切片后用HE染色、Masson染色的方法分析其胶原沉淀形成情况,并综合判断肝纤维化形成情况。1.2肝纤维化模型组织中TIPE2的表达检测上述肝组织切片以TIPE2 (JinSiTe,1:200), α-actin (Abcam,1:200), TGF-β1 (Abcam,5μg/ml)为一抗;SP-9000 (ZSGB-BIO)为二抗,免疫组化检测TIPE2、 α-actin、TGF-β的表达,新鲜肝组织用于western blot检测TIPE2的表达,统计分析TIPE2表达强度与肝纤维化程度之间的相关性。1.3利用TIPE2-/-小鼠诱导模型验证TIPE2在肝纤维化中的作用取6-8周龄TIPE2-/-(n=10)小鼠,每周一次腹腔注射5%四氯化碳溶液(每g体重注射10μl)诱导肝纤维化模型,并以野生型C57小鼠为对照。第四周时,眼球取血后离心获得血清,检测血清中的MCP-1、TNF-α与Il-6等细胞因子;小鼠常规方法处死后PBS灌流,将肝组织(经福尔马林固定)制备成病理切片后用Masson染色的方法分析其胶原沉淀形成情况。1.4生存率分析取6-8周龄TIPE2-/-(n=10)小鼠与C57小鼠(n=10),每周两次腹腔注射给药(20%四氯化碳溶液,每g体重注射20μl),动态观察其生活状态,并记录其体重变化及死亡情况,至12周时常规方法处死小鼠,绘制生存曲线。2.体外实验2.1 lX-2细胞培养人肝星状细胞系lX-2细胞(广州Jennio生物科技有限公司)培养于含10%血清的RIPA1640培养基中,培养条件为37℃、5%二氧化碳、湿润空气。2.2检测TIPE2在lX-2细胞中的表达将lX2铺到6孔板中(4×105个细胞/孔)培养14个小时后对lX2细胞进行不同浓度、不同时间的TGF-β1刺激。以不同浓度(0,2.5,5,10,20ng/ml)的TGF-β1刺激一定时间后,用we

关键词：肝纤维化 tnfaip8l2 lX-2 TGF-β1 Smad

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中国老年学杂志 2019年第11期39卷 2709-2713页

作者：曲强纪禄风伊琳甘肃中医药大学中西医结合学院甘肃兰州730000 甘肃省人民医院急诊科

目的研究当归挥发油对自发性高血压大鼠(SHR)肝脏组织形态学的影响及肝脏脂质代谢相关基因肿瘤坏死因子α诱导8样分子2(tnfaip8l2)、血清胎球蛋白A(Ahsg)表达的影响,探讨当归挥发油对SHR脂代谢的影响及其机制。方法将24只8周龄雄性SHR... 详细信息

目的研究当归挥发油对自发性高血压大鼠(SHR)肝脏组织形态学的影响及肝脏脂质代谢相关基因肿瘤坏死因子α诱导8样分子2(tnfaip8l2)、血清胎球蛋白A(Ahsg)表达的影响,探讨当归挥发油对SHR脂代谢的影响及其机制。方法将24只8周龄雄性SHR随机分为模型组、当归挥发油组和阿托伐他汀钙组,并用同周龄的Wistar大鼠作为对照组。每周监测各组大鼠血压。分别灌胃4 w后,取大鼠肝脏组织,HE染色观察肝脏组织形态学的变化,免疫印迹法检测tnfaip8l2、Ahsg蛋白水平的表达。qRT-PCR检测tnfaip8l2、Ahsg mRNA的表达。结果 HE染色显示,与模型组比较,当归挥发油组病变有所减轻,阿托伐他汀钙组未见明显异常。与模型组比较,tnfaip8l2、Ahsg蛋白在各用药组表达上调。结论当归挥发油对肝脏组织有保护作用,并且能降低SHR的血压。当归挥发油对SHR血脂有调节作用。当归挥发油可能通过上调tnfaip8l2、Ahsg基因的表达水平、抑制动脉粥样硬化而降压,并且影响脂代谢。

关键词：当归挥发油脂代谢 tnfaip8l2 Ahsg

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作者：曲强甘肃中医药大学

学位级别：硕士

目的:本课题通过研究当归挥发油对自发性高血压大鼠(SHR)肝脏组织形态学的影响以及肝脏脂质代谢相关基因tnfaip8l2,Tlr3表达的影响,从而探讨当归挥发油对SHR脂代谢的影响及其机理。方法:取8周龄雄性SHR大鼠和相同周龄的Wistar大鼠,正式... 详细信息

目的:本课题通过研究当归挥发油对自发性高血压大鼠(SHR)肝脏组织形态学的影响以及肝脏脂质代谢相关基因tnfaip8l2,Tlr3表达的影响,从而探讨当归挥发油对SHR脂代谢的影响及其机理。方法:取8周龄雄性SHR大鼠和相同周龄的Wistar大鼠,正式实验前每天测压训练一次,连续7d,待大鼠适应环境,血压稳定后,将SHR随机分为3组,模型组,阿托伐他汀钙组和当归挥发油治疗组,Wistar大鼠作为正常对照组,每组5只。模型组和正常对照组每天给予喂食生理盐水,不给任何药物。当归挥发油组、阿托伐他汀钙组根据实验大鼠体表面积换算公式计算给药剂量,并根据体重的变化随时调节给药剂量。采取灌胃的给药方式,给药周期4周,每周给药7天,每天按时给药。抽血后处死大鼠后,切取肝脏采用HE染色发观察肝脏组织病理学切片变化。应用q RT-PCR法检测当归处理后大鼠肝脏tnfaip8l2及Tlr3 m RNA表达水平的变化。应用Western-blot检测当归处理后大鼠肝脏tnfaip8l2及Tlr3蛋白表达水平的变化。数据处理采用SPSS20.0软件进行分析。结果:1.各组用药前后血压的变化:给药四周后,当归挥发油组SHR血压低于模型组(P0.05)。2.当归挥发油对SHR血脂水平的影响:与模型组比较,各用药组的TC、TG、lDl-C水平低于模型组,HDl-C高于模型组,各用药组经过治疗后,血脂水平有所改变,但差别无统计学意义(P>0.05)。3.当归挥发油对SHR肝脏组织形态学的影响:模型组可见脂肪变性,肝细胞内有小泡。与模型组相比较,当归挥发油组可见糖原分解,脂肪变性消失。阿托伐他汀钙组未见明显异常。4.当归挥发油对SHR肝脏tnfaip8l2,Tlr3基因的m RNA及蛋白水平表达的影响:结果显示,与模型组相比较,tnfaip8l2,Tlr3在当归组,阿托伐他汀钙组表达上调,且均差异性表达上调,差别具有统计学意义(Ptnfaip8l2,Tlr3基因水平在各用药组表达上调,且呈差异性表达。当归挥发油可能通过上调了tnfaip8l2,Tlr3基因的表达水平,抑制了动脉粥样硬化而降压,并且影响了脂代谢。

关键词：当归挥发油脂代谢 tnfaip8l2 Tlr3

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tnfaip8l2/TIPE2通过RAC1-MTOR轴调控自噬溶酶体再生的机制研究

TNFAIP8L2/TIPE2通过RAC1-MTOR轴调控自噬溶酶体再生的机制研究

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第十四届全国免疫学学术大会

作者：李文山东第一医科大学

自噬是一个进化上保守的过程,在营养物质缺乏时溶酶体选择性降解细胞质组分以维持细胞及机体稳态。自噬是一种古老的防御机制,与免疫系统密切联系,对固有免疫和适应性免疫具有多重作用。促炎细胞因子和抗炎细胞因子可分别激活和抑制自噬... 详细信息

自噬是一个进化上保守的过程,在营养物质缺乏时溶酶体选择性降解细胞质组分以维持细胞及机体稳态。自噬是一种古老的防御机制,与免疫系统密切联系,对固有免疫和适应性免疫具有多重作用。促炎细胞因子和抗炎细胞因子可分别激活和抑制自噬。tnfaip8l2/TIPE2 (tumor necrosis factor,alpha-induced protein 8-like 2)是一种新发现的固有和适应性免疫的负调节因子,在免疫稳态中发挥重要作用。然而,tnfaip8l2是否以及如何控制自噬尚不清楚。小鼠tnfaip8l2可直接结合并阻断RAC1 GTPase活性,调节先天免疫。RAC1还可以与MTOR结合并调节其活性。我们发现tnfaip8l2通过与MTOR竞争结合RAC1-GTP形式,负调控MTORC1活性。有趣的是,在谷氨酰胺和血清饥饿条件下,过表达tnfaip8l2不能通过抑制MTOR活性来诱导自噬通量。而是在长期饥饿期时损伤自噬溶酶体再生(AlR)。最后,我们证明了过表达tnfaip8l2抑制MTOR再激活,并损伤自噬通流,从而导致细胞死亡。此外,在lPS诱导的小鼠内毒素血症模型中,tnfaip8l2缺失可通过调控MTOR活性加重炎症反应和肺损伤。我们的研究揭示了tnfaip8l2通过调节RAC1-MTORC1轴在自噬中的新作用,这将为以tnfaip8l2作为免疫系统系统及肿瘤治疗靶点提供有力证据。

关键词： tnfaip8l2 RAC1 MTORC1 自噬溶酶体再生细胞死亡炎症

来源： cnki会议评论

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miR-2904在BVDV复制过程中的调控机制

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中国兽医学报 2021年第9期41卷 1687-1696页

作者：高亚桃任志军李妍关一凡陈颖彬常丽云王晓芳秦建华赵月兰河北农业大学动物医学院河北保定071001 河北省畜牧兽医研究所河北保定071000

为研究microRNA在致细胞病变型牛病毒性腹泻病毒(cpBVDV)感染过程中对病毒复制和调控炎症反应的作用机制,本研究以MDBK细胞为模型,通过对cpBVDV感染MDBK前后的总RNA进行microRNA芯片反应,筛选与炎症反应相关的显著差异性microRNA,并预... 详细信息

为研究microRNA在致细胞病变型牛病毒性腹泻病毒(cpBVDV)感染过程中对病毒复制和调控炎症反应的作用机制,本研究以MDBK细胞为模型,通过对cpBVDV感染MDBK前后的总RNA进行microRNA芯片反应,筛选与炎症反应相关的显著差异性microRNA,并预测出其靶基因。通过将miR-2904转染至MDBK细胞,探索其在BVDV感染MDBK细胞过程中的调控作用,并验证其靶基因;利用qRT-PCR检测miR-2904、BVDV 5′UTR及相关炎症因子mRNA的表达水平,利用Western blot检测靶基因tnfaip8l2蛋白表达水平。结果显示,miR-2904是microRNA的候选基因之一,荧光素酶报告结果显示tnfaip8l2为其潜在的靶基因;炎症反应表明,BVDV感染MDBK细胞后,miR2904的表达水平显著上升(Ptnfaip8l2的表达水平;MDBK细胞转染miR-2904mimic后,炎症因子COX-2、Il-8、tnfaip8l2mRNA以及tnfaip8l2蛋白的表达水平明显升高(P2904mimic,能显著降低BVDV 5′UTR的表达水平(P2904可以抑制tnfaip8l2的翻译,增强cpBVDV感染MDBK细胞中的炎症反应以及降低BVDV的复制水平。

关键词： BVDV microRNA芯片 miR-2904 tnfaip8l2 炎症反应病毒复制

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新型抗炎蛋白TIPE2调控CD8+T细胞功能在HBV感染中的作用

新型抗炎蛋白TIPE2调控CD8+T细胞功能在HBV感染中的作用

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作者：张文倩山东大学

学位级别：硕士

研究目的乙型肝炎病毒（Hepatitis B Virus, HBV）感染所致的乙型肝炎是一个世界性的难题,全世界有数亿人口被乙肝病毒所感染,其中每年有数十万病人死于由此引发的相关肝脏疾病。部分乙肝病毒感染者可以通过机体较强的免疫反应将病... 详细信息

研究目的乙型肝炎病毒（Hepatitis B Virus, HBV）感染所致的乙型肝炎是一个世界性的难题,全世界有数亿人口被乙肝病毒所感染,其中每年有数十万病人死于由此引发的相关肝脏疾病。部分乙肝病毒感染者可以通过机体较强的免疫反应将病毒完全清除,但也有部分感染者以及大多数垂直传播所致的感染者,不能及时清除病毒,造成持续的慢性病毒感染。这种慢性感染引起的持续性肝炎不仅使被感染者身心倍受折磨,也是肝癌和肝硬化的重要诱因。因此,深入研究机体抵抗HBV感染的免疫反应机制并筛选潜在的免疫治疗靶点,具有重要的临床意义和社会价值。现有研究指出,乙肝病毒侵入人体后,CD8+T细胞在病毒的清除中发挥着重要的作用。CD8+T细胞能够识别病毒多肽-MHCI类分子复合体,增殖活化并分泌IFN-γ TNF-α等细胞因子,释放颗粒酶、穿孔素等,同时增强Fasl的表达,通过这些途径作用于病毒感染细胞,抑制病毒复制或引起病毒感染细胞的凋亡或裂解,最终达到清除病毒的目的。尽管CD8+T细胞在HBV感染过程中的免疫防御功能已经比较清楚,但是关于其在HBV感染的特定疾病环境下细胞行为调控尚待探讨,深入这一领域研究并基于此开发CD8+T细胞功能人为干预技术可能是免疫治疗HBV感染的一个突破口。 TIPE2（Tumor necrosis factor-alpha induced protein8like-2, tnfaip8l2）分子是2008年发现的新型抗炎蛋白,主要表达于各类淋巴组织及免疫细胞的表面。TIPE2分子通过对T细胞表面受体和Toll样受体负调控维持免疫系统稳态,在免疫系统中发挥重要作用。本课题组前期研究证实,TIPE2基因缺陷小鼠更容易诱发HBV所致的肝脏炎症。多数文献报道指出,HBV感染所致的肝脏炎症主要是由病毒特异性的CD8+T细胞对病毒感染细胞的杀伤所致。为此,本课题从小鼠模型和慢性乙肝病人外周血标本两个方面入手,研究TIPE2分子对HBV感染过程中CD8+T细胞功能的调控作用,不仅为进一步研究HBV感染的分子机制提供实验依据和理论基础,并且为乙肝的临床治疗提供研究方向和潜在靶点。材料方法 ***2在HBV感染小鼠模型中的研究 1.1HBV致敏小鼠脾淋巴细胞的获取取8周龄雄性C57Bl/6野生型小鼠和相同背景的TIPE2基因敲除小鼠TIPE2腿部肌肉注射HBV表达质粒（100μg/只）,两周后加强一次。二次免疫10天后,将小鼠处死,无菌取脾,200目铜网研磨制成单细胞悬液。 1.2HBV致敏脾淋巴细胞体外杀伤检测致敏脾细胞悬液与转染HBV质粒的Hepal-6细胞以效靶比50：1共培养,24h后CCK-8法检测细胞活性。 1.3HBV致敏脾淋巴细胞的过继转输致敏脾淋巴细胞悬液过继转输到8周龄C57Bl/6背景的转HBV全基因组小鼠体内,48h后处死小鼠,取肝脏,HE染色观察肝脏炎症。 2.乙型肝炎患者外周血标本检测 2.1HBV感染者外周血CD8+T细胞TIPE2分子表达检测取健康对照和HBV感染者外周血,流式抗体胞内标记TIPE2分子,流式细胞仪检测HBV感染者外周血CD8+T细胞TIPE2分子的表达变化,并分析TIPE2分子表达水平与血清AlT、AST、HBV DNA载量之间的相关性,根据结果将乙肝患者分为TIPE2高水平组与低水平组,分析TIPE2表达水平对CD8+T细胞功能的影响。 2.2HBV感染者外周血CD8+T细胞活化检测取健康对照和HBV感染者外周血,流式抗体标记T细胞活化标志分子HlA-DR和CD38,流式细胞仪检测阳性细胞的数量变化。 2.3HBV感染者外周血CD8+T细胞功能检测取健康对照和HBV感染者外周血,无菌分离PBMC,培养于含10%FBS的RPMI1640培养基,加HBC18-27特异性肽刺激,6h后收取细胞。流式抗体标记胞内分子perforin、Granzyme B和IFN-y,流式仪检测阳性细胞的数目变化。 2.4HBV感染者外周血CD8+T细胞凋亡检测分离健康对照和乙肝病毒感染者外周血单个核细胞,Annexin V流式抗体以及抗人CD3、CD8抗体孵育,流式细胞仪检测CD8+T细胞凋亡。 2.5HBC18-27短肽对健康人外周血PBMC的TIPE2分子表达的影响抽取健康人外周血于抗凝管,无菌分离PBMC,用含10%human AB serum的RPMI1640培养基调细胞密度至6×105/ml,加终浓度为10μg/ml HBc18-27短肽和终浓度30U/ml hrIl-2,于37℃5%CO2细胞培养箱培养。每三天补加一次hrIl-2（终浓度30U/m1）,1

关键词： tnfaip8l2 HBV 外周血单个核细胞(PBMC) CD8+T细胞细胞免疫

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参与调控牛病毒性腹泻病毒感染宿主细胞关键microRNA的筛选与靶基因鉴定

参与调控牛病毒性腹泻病毒感染宿主细胞关键microRNA的筛选与靶基...

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作者：任志军河北农业大学

学位级别：硕士

牛病毒性腹泻病毒(BVDV)是一种有囊膜的单链RNA病毒,属于瘟病毒属黄病毒科。BVDV在牛中引起许多疾病,包括腹泻,粘膜病,持续感染,出血综合征以及生殖和呼吸疾病,导致养牛业的巨大经济损失。对于该病目前尚无有效的治疗方法,因此加强对本... 详细信息

牛病毒性腹泻病毒(BVDV)是一种有囊膜的单链RNA病毒,属于瘟病毒属黄病毒科。BVDV在牛中引起许多疾病,包括腹泻,粘膜病,持续感染,出血综合征以及生殖和呼吸疾病,导致养牛业的巨大经济损失。对于该病目前尚无有效的治疗方法,因此加强对本病的研究就显得尤为重要。MicroRNAs(miRNAs)是一类小的非编码RNA,其与多个靶mRNA的3’非编码区(UTR)中的互补序列结合;尽管miRNA的序列短小,但其在信号转导途径中起重要作用。现有越来越多的研究结果均表明miRNA与病毒感染密切相关,从miRNA方向研究BVDV调控宿主的机制可为BVDV的防控提供理论依据。本试验以MDBK和家兔为宿主,通过设计炎症反应关键酶COX-2和炎症因子如Il-8、MIP-3α、GRO-α的特异性引物,分别从MDBK、家兔脾脏组织和小肠上皮组织中分别扩增目的片段,建立实时荧光相对定量PCR方法检测感染前后COX-2和Il-8、MIP-3α、GRO-αmRNA的相对表达变化。结果表明在BVDV感染MDBK细胞后,COX-2和Il-8、GRO-αmRNA表达量均显著高于未感染前(Pl-8、GRO-α表达量均显著高于未感染前(Pl-8、GRO-α基因表达量的升高,推测MIP-3α在脾脏中抗BVDV感染过程中发挥着重要的作用。本试验利用100TCID的BVDV感染MDBK细胞,感染12h后收集细胞,提取总RNA进行microRNA高通量测序;10TCIDBVDV感染家兔,感染8d后处死家兔,分离收集感染前后的家兔小肠和脾细胞,提取总RNA进行microRNA高通量测序。高通量测序技术对感染牛病毒性腹泻病毒感染MDBK细胞、家兔脾细胞与小肠细胞前后进行microRNA转录组学分析,筛选出差异miRNA,并进行靶基因预测。通过信号通路数据库及基因功能对靶基因进行功能的注释和富集分析。结果显示,BVDV感染MDBK细胞与正常MDBK细胞相比,45个miRNAs表达量显著上调,63个miRNAs表达量显著下调,BVDV感染家兔脾细胞与健康家兔脾细胞相比,16个miRNAs表达量显著上调,23个miRNAs表达量显著下调,BVDV感染家兔小肠细胞与健康小肠细胞相比,15个miRNAs表达量显著上调,16个miRNAs表达量显著下调。BVDV感染MDBK细胞差异miRNAs靶基因KEGG分析发现,基因主要富集到Ras signaling pathway、Rap1 signaling pathwa、PI3K-Akt signaling pathway、MAPK signaling pathway,GO分析发现差异miRNAs靶基因显著富集在nucleus、extracellular vesicular exosome、cytoplasm;BVDV感染家兔脾肠细胞差异靶基因KEGG分析发现,基因主要富集在p53 signaling pathway、MAPK signaling pathway、ErbB signaling pathway,GO分析发现差异miRNAs靶基因显著富集在protein binding、nucleus、cytoplasm。通过对筛选出的差异miRNAs初步归类分析,为后续BVDV感染MDBK细胞并在细胞内复制的相关分子机制研究奠定了基础。本试验通过BVDV感染宿主细胞的差异microRNA靶基因分析,筛选出与炎症反应相关的显著差异性microRNA,即bta-miR-2904,预测靶基因为tnfaip8l2(肿瘤坏死因子-α诱导蛋白8-2型),通过转染miR-2904研究其在BVDV感染MDBK细胞过程中的调控作用,并验证其靶基因。将试验细胞分为六个组;A组为正常MDBK细胞;B组为MDBK细胞接种BVDV;C组为MDBK细胞转染miR-2904 mimic;D组为MDBK细胞转染miR-2904 inhibit;E组为MDBK细胞接种BVDV后转染miR-2904 mimic;F组为MDBK细胞接种BVDV后转染miR-2904 inhibit。48 h后,收获细胞,提取细胞miRNA,RNA和蛋白。qRT-PCR检测各组细胞miR-2904、BVDV5′UTR、相关炎症因子COX-2、Il-8、GRO-α以及靶基因tnfaip8l2的mRNA表达水平,WB检测tnfaip8l2的蛋白表达水平。结果显示,cpBVDV感染MDBK细胞后与正常MDBK细胞相比,miR2904的表达水平显著上升(P<0.05);MDBK细胞转染miR-2904 m

关键词： BVDV microRNA miR-2904 tnfaip8l2 炎症反应病毒复制

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TIPE2诱导巨噬细胞凋亡在动脉粥样硬化中的作用

TIPE2诱导巨噬细胞凋亡在动脉粥样硬化中的作用

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作者：耿铭鸿山东大学

学位级别：硕士

研究目的动脉粥样硬化(Atherosclerosis, AS)是一种严重威胁到人类健康的慢性炎症性疾病,以动脉血管壁内膜血脂沉积、血管平滑肌细胞和纤维结缔组织增生、内膜的纤维性增厚以及粥样斑块的形成为主要特征,但其具体机制尚不明确。近年的... 详细信息

研究目的动脉粥样硬化(Atherosclerosis, AS)是一种严重威胁到人类健康的慢性炎症性疾病,以动脉血管壁内膜血脂沉积、血管平滑肌细胞和纤维结缔组织增生、内膜的纤维性增厚以及粥样斑块的形成为主要特征,但其具体机制尚不明确。近年的研究表明,局部和全身性的免疫反应贯于动脉粥样硬化发病的全过程,伴随着由单核/巨噬细胞、平滑肌细胞、内皮细胞、淋巴细胞、肥大细胞及树突状细胞等组成的复杂细胞网络之间的交互作用。其中,作为固有免疫系统重要成员之一的单核/巨噬细胞在动脉粥样硬化这一疾病的发生及发展过程中的作用非常关键。活化后的巨噬细胞可以通过分泌炎性细胞因子、基质金属蛋白酶等,对AS的发展起促进作用。此外,研究表明,巨噬细胞的凋亡在AS的发生、发展以及不稳定斑块的形成与破裂中发挥极其重要的作用。同时,巨噬细胞具有连接固有免疫与适应性免疫的桥梁作用,通过大量研究表明,巨噬细胞的凋亡发生于动脉粥样硬化的多个环节,对其机制的研究可为揭示动脉粥样硬化发生的分子机制以及利用免疫手段干预动脉粥样硬化的预防及治疗奠定良好基础。 TIPE2/,肿瘤坏死因子α诱导的蛋白8-2(Tumor necrosis factor-a induced protein-8-like2)是2008年发现的新型抗炎免疫分子。研究发现,TIPE2可选择性表达于胸腺、脾脏、淋巴结等免疫器官,此外尚可表达于具有内分泌功能的组织细胞、泌尿生殖细胞、造血细胞以及炎症组织中。研究发现,TIPE2-/-小鼠,会表现出脾脏肿大、体重下降以及白细胞增多等症状,并最终由于多器官发生炎症而导致死亡。同时,通过对慢性乙型肝炎患者的外周血检测发现,在患者的单个核细胞中,TIPE2表达下调,并与血清AST、AlT水平等呈负相关,说明TIPE2可能与乙肝的发生有密切关系。同时,通过对糖尿病肾病的研究发现,TIPE2肾小球中表达明显上调,说明TIPE2可能与糖尿病肾病的发生有密切关系。研究还发现,在SlE(系统性红斑狼疮)患者的外周血单个核细胞中,TIPE2表达被下调,同时,与病情的活动性指标之间存在负相关性,这些说明,说明TIPE2可能与系统性红斑狼疮的发生有密切关系。此外,TIPE2可通过负性调节机体的固有免疫及适应性免疫,发挥维持免疫稳态的作用。本课题组前期研究表明,TIPE2具有抗动脉粥样硬化作用,TIPE2基因缺失的巨噬细胞可抵抗lPS诱导的细胞死亡,这些现象提示TIPE2可能通过调节巨噬细胞的死亡影响动脉粥样硬化的发生以及发展过程。因为细胞凋亡和细胞自噬均可引起细胞死亡,为此,为明确TIPE2调控细胞死亡的确切分子机制,本课题开展了对TIPE2与巨噬细胞凋亡与自噬的研究。利用体外细胞试验系统地研究了动脉粥样硬化发生时TIPE2与巨噬细胞中凋亡相关分子的关系及TIPE2在巨噬细胞自噬中的作用,这为进一步研究动脉粥样硬化的免疫学机制提供了实验和理论依据,并且为动脉粥样硬化的预防及治疗提供新的靶点。材料方法 1.腹腔巨噬细胞的诱导活化取8-10周龄雄性C57Bl/6野生型小鼠以及TIPE2基因敲除小鼠(TIPE2-/-),腹腔注射6%的无菌淀粉,96小时后无菌分离取原代腹腔巨噬细胞,以含10%FBS的高糖DMEM培养基放于37℃,5%C02的培养箱中过夜培养,换液时,用无血清DMEM培养基洗涤一次,使未贴壁的巨噬细胞以及少量的红细胞被弃掉,保留贴壁的巨噬细胞,然后换含双抗的无血清DMEM培养基,静息24小时,然后加以含oxlDl的完全培养基刺激,分别检测TIPE2对巨噬细胞凋亡的调控和巨噬细胞自噬的调控,检测TIPE2对巨噬细胞凋亡的死亡受体通路、线粒体凋亡通路以及内质网应激(ERS)中相关基因转录的调控并对相关信号通路进行检测。 ***2对巨噬细胞死亡的调控 2.1检测TIPE2对巨噬细胞死亡的影响以上述方法获得的腹腔巨噬细胞,经50μg/ml的oxlDl刺激后用台盼蓝染色后,显微镜下观察拍照并做死亡细胞数量的百分比统计。 2.2.检测TIPE2对巨噬细胞自噬的影响以上述方法获得的腹腔巨噬细胞,经50μg/ml的oxlDl刺激后收集细胞,Western bolt以及real-time PCR分别检测lC3蛋白以及Atg5基因的表达。 2.3.检测TIPE2对巨噬细胞凋亡的影响以上述方法获得的腹腔巨噬细胞,经50μ/ml的oxlDl刺激后用TUNEl染色后,显微镜下观察拍照并做凋亡细胞数量的百分比统计。 2.3.1细胞凋亡的检测以上述方法获得的腹腔巨噬细胞,经50μg/ml的oxlDl刺激后收集细胞,Annexin V/PI流式抗体孵育,用流式细胞仪检测巨噬细胞的凋亡。 2.3.2TIPE2对巨噬细胞中caspase3活化的调控以上述方法获得的腹腔巨噬细胞,经50μg/m

关键词： tnfaip8l2 巨噬细胞动脉粥样硬化细胞凋亡细胞自噬

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