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中国应用生理学杂志 2008年第2期24卷 144-146,232页

作者：刘鑫于洪伟王凤丹王建醒王淑娟于晓光哈尔滨医科大学基础医学学院生物化学与分子生物学教研室黑龙江哈尔滨150081

目的:构建酵母双杂交系统"诱饵"质粒载体pGBKT7-TACE,并检测其是否具有自身激活及毒性作用。方法:从小鼠肝组织提取总RNA,用RT-PCR的方法获得TACE,克隆于pGBKT7载体上,酶切鉴定及序列分析,并检测pGBKT7-TACE在MATH-MAKER GAL4 Two-Hybri... 详细信息

目的:构建酵母双杂交系统"诱饵"质粒载体pGBKT7-TACE,并检测其是否具有自身激活及毒性作用。方法:从小鼠肝组织提取总RNA,用RT-PCR的方法获得TACE,克隆于pGBKT7载体上,酶切鉴定及序列分析,并检测pGBKT7-TACE在MATH-MAKER GAL4 Two-Hybrid System 3中的自激活和毒性作用。结果:本实验成功构建了"诱饵"质粒载体pGBKT7-TACE,并证明其在酵母双杂交系统中无自激活及毒性作用。结论:构建的诱饵质粒pGBKT7-TACE可应用在酵母双杂交系统中,为筛选小鼠cDNA文库中与TACE相互作用的蛋白奠定实验基础。

关键词： tnf-α转化酶酵母双杂交系统自激活作用

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4-羟基异亮氨酸对3T3-L1脂肪细胞胰岛素抵抗的影响及分子机制

4-羟基异亮氨酸对3T3-L1脂肪细胞胰岛素抵抗的影响及分子机制

引用

作者：杜文华中科技大学

学位级别：硕士

第一部分4-羟基异亮氨酸对3T3-L1细胞的细胞毒性作用及对胰岛素抵抗状态的影响研究背景及目的：中药葫芦巴具有降糖降脂的功效，其有效性和安全性已被众多研究证实，因此被广泛应用于临床。葫芦巴种子提取物4-羟基异亮氨酸（4-Hydroxyi... 详细信息

第一部分4-羟基异亮氨酸对3T3-L1细胞的细胞毒性作用及对胰岛素抵抗状态的影响研究背景及目的：中药葫芦巴具有降糖降脂的功效，其有效性和安全性已被众多研究证实，因此被广泛应用于临床。葫芦巴种子提取物4-羟基异亮氨酸（4-Hydroxyisoleucine,4-HIL）被认为是发挥生物活性的重要成分之一。第一部分实验观察不同浓度4-HIL对3T3-L1细胞的细胞毒性作用，以及4-HIL对胰岛素抵抗（IR）状态的影响。方法：采用MTT法检测4-HIL的细胞毒性及药物安全性;以25mmol/L葡萄糖加0.6nmol/L胰岛素诱导3T3-L1脂肪细胞产生IR，同时予以不同浓度4-HIL干预，采用葡萄糖转运实验计算2-脱氧-[3H]-D-葡萄糖（2-DOG）摄取率。结果：在0～200μmol/L浓度范围内4-HIL对3T3-L1细胞无毒性作用;分化成熟的3T3-L1脂肪细胞在高糖高胰岛素作用18h后，葡萄糖摄取率降低67%，而加入不同浓度4-HIL后摄取率不同程度升高。结论：4-HIL具有较高的安全性，4-HIL能改善3T3-L1脂肪细胞的IR。第二部分4-羟基异亮氨酸对3T3-L1胰岛素抵抗细胞中TACE及TIMP3蛋白表达的影响研究背景及目的：胰岛素抵抗（insulin resistance，IR）是一种慢性低度炎症性疾病，脂肪组织过度产生炎症因子，如肿瘤坏死因子（Tumor necrosis factor-α，tnf-α）等影响胰岛素受体信号途径的多个环节，加重IR。具有这种生物活性的tnf-α往往指的是可溶型tnf-α（stnf-α）。体内stnf-α是由tnf-α转化酶（TACE）裂解跨膜型tnf-α（Tm-tnf-α）转化而来，而体内TACE的天然抑制剂为金属蛋白酶组织抑制剂（TIMP3）。因此，抑制TACE的表达和/或促进TIMP3的表达可下调stnf-α的产生，从而改善IR。本实验探讨4-HIL对3T3-L1胰岛素抵抗细胞中TACE及TIMP3蛋白表达的调节作用，观察4-HIL对3T3-L1细胞tnf-α受体(stnfRⅠ)表达的影响。方法：以不同浓度4-HIL干预3T3-L1胰岛素抵抗细胞，并予10μmol/L吡格列酮（PIO）作阳性对照。Western-blot法检测TACE、TIMP3蛋白表达水平;ELISA法检测细胞上清中stnfRⅠ水平。结果：4-HIL可下调TACE蛋白表达同时上调TIMP3蛋白表达，且呈剂量依赖关系（PtnfRⅠ分泌水平，且呈剂量依赖性（Ptnf-α比例相关。第三部分4-羟基异亮氨酸对3T3-L1细胞胰岛素信号通路的影响研究背景及目的：4-HIL的降糖机制可能与抑制葡萄糖吸收、促进胰岛素合成与分泌、激活胰岛素信号传导通路等途径相关。观察4-HIL对3T3-L1脂肪细胞胰岛素信号转导途径中重要蛋白表达的影响。方法：采用Western-blot法检测不同浓度4-HIL对3T3-L1胰岛素抵抗细胞中IRS-1、Akt、GLUT4蛋白表达水平，同时分析IRS-1及Akt丝氨酸磷酸化蛋白P-IRS-1Ser307、P-IRS-1Ser318、P-AktSer473表达的变化。结果：4-HIL可促进3T3-L1细胞胰岛素抵抗状态下的IRS-1、GLUT4蛋白表达（P<0.05），同时抑制磷酸化蛋白P-IRS-1Ser30（7P<0.001）、P-Akt Ser473（P<0.05）表达，对Akt、P-IRS-1Ser318无明显作用。结论：4-HIL可激活3T3-L1细胞胰岛素信号转导通路，从而改善IR。

关键词： 4-羟基异亮氨酸肥胖相关胰岛素抵抗可溶型tnf-α tnf-α转化酶 tnf-α转化酶抑制剂

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