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病原体特异性核酸序列标签筛选流程的建立及标签qPCR阵列验证

病原体特异性核酸序列标签筛选流程的建立及标签qPCR阵列验证

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作者：李泽第三军医大学

学位级别：硕士

病原体的检侦是传染病防控的重要环节,面对上千种已知和未知病原体,传统的病原体分离培养存在盲目性,通量低,周期较长,病原体的确认需要流行病学、病原学、血清学、形态学及免疫组织化学等多方面证据[1,2]。且有的病原体无法分离培养,... 详细信息

病原体的检侦是传染病防控的重要环节,面对上千种已知和未知病原体,传统的病原体分离培养存在盲目性,通量低,周期较长,病原体的确认需要流行病学、病原学、血清学、形态学及免疫组织化学等多方面证据[1,2]。且有的病原体无法分离培养,有的病原体没有易感的动物模型可以验证。如果在传染病发生的早期先对病原体核酸或蛋白进行快速高通量检侦,缩小可疑感染病原体的鉴别范围,可为后续病原体分离鉴定、血清学检测、临床诊断和对症治疗提供方向。随着二代测序技术的广泛应用,物种和病原体基因组信息呈爆炸性增长,基因组大数据的挖掘和利用成为生物、医药领域大数据应用的前沿领域[3,4]。要实现病原体的高通量快速检侦,基础则在于构建完整、高效的病原体标签序列数据库,所谓病原体标签序列(signature),是指能够用来检测病原体存在和能区分其与其它病原体的特异性核酸序列[5]。而要构建完整、高效的病原体标签序列数据库,则必须通过基于大数据的智能计算过程,建立适合的算法和标签序列比对及输出流程。本研究以卫生部2006年发布的《人间流传的主要致病微生物》目录、罗恩杰主编《病原生物学》、李凡和徐志凯主编《医学微生物学》[6,7],列出当前主要致病567种病原体目录为基础,结合16S序列专业库Silva(http://***/contact/)[8-10]、细菌致病基因VFDB库(http://***/VFs/***)[11-14]、耐药基因ARDB库(http://***/)[15],旨在摸索构建出一套高效实用的病原体特异性核酸标签筛选体系。并在筛选体系基础上,提出分级标签策略,即:属标签+种标签+致病基因标签+耐药基因标签共同表征/定义病原体,最终实现多靶点全覆盖达到一次性检测所有病原体及其致病耐药特征的理想目标。通过我们的研究,取得了如下阶段性成果:1)在MUMmer+Insignia[5]基础上摸索建立了核酸特异性标签自主筛选流程tmmu signature workflow,并实现流程可视化。流程将比对背景缩小到所有目标病原体核酸序列集合,同时为加快MUMmer匹配后Insignia过程,对文件按照Taxon进行了切分。为减少特异性标签流失,将BLAST库设为Nt库与WGS序列库集合,并剔除其中所有人工合成序列。BLAST筛选设置两个重要参数,一是按名称(双重)判定是否同种病原体,二是将覆盖度设为90%,即标签若与其它物种序列覆盖度达到90%,则标签判定为不特异;2)通过多种计算验证,tmmu signature workflow精确计算流程不适于细菌属标签比对(无论是基于16S序列,还是基于属间全基因组序列),属标签可利用clustal Omega找到属保守区段,再通过多条标签检测来覆盖个别碱基差异,达到提示病原体属存在的检侦结果;3)tmmu signature workflow精确计算流程不仅适用于有全基因组的DNA序列,也适用于有全基因组的RNA序列。同时还适用于短序列(16S序列除外,同属间辨识度不够,无法区分到种),没有全基因组的病原体和致病基因、耐药基因片段序列,也可通过同种、同基因短序列间不求交策略进入流程获得特异性标签序列;4)建立了15种高致病出血热病毒qPCR阵列和29种分枝杆菌qPCR阵列,经验证以ZEBOV为代表的高致病出血热病毒qPCR阵列,阳性质粒5×107-5×101拷贝/μl做标准曲线相关系数R2>0.99,灵敏度可达5×101拷贝。准确性重复性实验结果批内变异系数(CV)为0.88%-2.50%、批间CV为1.75%-3.31%。以结核杆菌等为代表的29种分枝杆菌qPCR阵列,阳性质粒5×107-5×103拷贝/μl做标准曲线相关系数R2>0.99,灵敏度可达5×103拷贝。两条结核杆菌探针,23例结核杆菌痰涂阳性样本检测均阳性,20例结核杆菌痰涂阴性患者检测均阴性,特异性100%,敏感性100%。以9例Gene X-pert MTB(赛沛)检测阳性样本为对照,1号探针检测有7个样本阳性,2号探针检测有7个样本阳性,两条探针阳性结果不完全重叠,出现互补,共有8个样本阳性。侧面说明多靶点检测病原体优于单靶点检测,为我们之后的万条标签检测千种病原体panel打下基础。

关键词：高通量检侦病原体目录标签筛选体系分级标签策略 tmmu signature workflow 出血热病毒qPCR阵列分枝杆菌qPCR阵列

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