检索结果-南通市图书馆

作者：张欢甘肃农业大学

学位级别：硕士

我国是世界牦牛拥有量最多的国家,但牦牛的生长周期长,繁殖性能远远低于其他牛种,这限制了牦牛畜牧业经济的进一步发展。跨膜蛋白18(tmem18)是一个末端为低聚嘧啶的基因,该基因与动物生长发育和繁殖性能密切相关。鉴于此,本研究对有关牦... 详细信息

我国是世界牦牛拥有量最多的国家,但牦牛的生长周期长,繁殖性能远远低于其他牛种,这限制了牦牛畜牧业经济的进一步发展。跨膜蛋白18(tmem18)是一个末端为低聚嘧啶的基因,该基因与动物生长发育和繁殖性能密切相关。鉴于此,本研究对有关牦牛tmem18基因多态性及其功能的进行研究。通过荧光定量PCR和蛋白免疫印迹法分别检测了tmem18在牦牛不同组织中mRNA和蛋白的表达情况,并利用免疫组织化学染色技术对牦牛不同组织中tmem18蛋白定位;以192头牦牛血样DNA构建混合池,扩增tmem18基因内含子1和外显子5的序列。运用高分辨率熔解曲线分析技术(high resolution melting curve,HRM)统计基因型分型以及运用SPSS 21.0分析基因多态位点与生产性能关联;在质粒pIRES2-EGFP的多克隆位点插入tmem18基因构建真核表达载体pIRES2-EGFP-tmem18,用脂质体技术转染牦牛胎儿成纤维细胞。利用蛋白免疫印迹法、荧光定量PCR技术检测牦牛胎儿成纤维细胞转染前后tmem18基因的表达量。研究结果如下:(1)tmem18蛋白在牦牛各组织器官中均有表达,其中睾丸中mRNA和蛋白表达量极显著高于其他组织(Ptmem18阳性免疫反应;而在睾丸中精原细胞、初级精母细胞和次级精母细胞中tmem18阳性反应明显高于其他组织(Ptmem18基因内含子1处存在2个多态位点,分别是:861(A/G)和1267(C/T),外显子5处存在1个多态位点为4447(C/T)。关联分析表明,牦牛tmem18基因861(A/G)位点的不同基因型与牦牛的体高、体重、胴体重和屠宰率差异性显著(Ptmem18基因4447(C/T)位点的不同基因型与牦牛的体斜长、管围、胸围、体重、胴体重、净肉重、净肉率和屠宰率均存在显著性差异(Ptmem18真核表达载体,验证发现转染成纤维细胞tmem18蛋白和mRNA的表达量显著提高(Ptmem18与牦牛生产性状相关的多态位点并成功构建的真核表达载体pIRES2-EGFP-tmem18,为今后牦牛遗传改良和克隆技术以及基因的功能研究提供基础。

关键词：牦牛 tmem18 表达与定位 SNP HRM 载体构建

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人工锌指核酸酶介导细胞水平tmem18敲除及其功能分析

人工锌指核酸酶介导细胞水平TMEM18敲除及其功能分析

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作者：卜昱翎华东师范大学

学位级别：硕士

tmem18基因作为新发现的与肥胖相关基因,受到人们广泛的关注,然而其功能并不完全为人所知。为此,我们利用人工锌指核酸酶技术对tmem18进行敲除,构建tmem18表达量下调的细胞系,为研究tmem18的功能提供模型。从分子水平上解析tmem18的功... 详细信息

tmem18基因作为新发现的与肥胖相关基因,受到人们广泛的关注,然而其功能并不完全为人所知。为此,我们利用人工锌指核酸酶技术对tmem18进行敲除,构建tmem18表达量下调的细胞系,为研究tmem18的功能提供模型。从分子水平上解析tmem18的功能与肥胖之间的关系。这对肥胖机制的研究、肥胖防治以及药物开发都有非常重要的意义。我们首先对本实验室原有的人工锌指核酸酶质粒中野生的核酸内切酶FokI酶切结构域进行突变,以提高打靶的特异性和效率。我们建立了一种利用非重叠引物通过一步PCR进行长距离多位点质粒突变的方法,并成功地利用其实现了质粒中野生的FokI的多位点突变,构建了现有的人工锌指核酸酶质粒。我们利用报告基因方法,对构建的锌指核酸酶进行活性评估。我们构建了一个在绿色荧光蛋白表达序列中插入锌指核酸酶识别位点的打靶质粒pCDNA3.1(+)-meGFP及一个缺乏启动子与起始密码子的供体质粒pCDNA3.1(+)-ddeGFP,当我们单独将meGFP质粒转染C2C12细胞,并建立成稳定细胞株,该细胞不表达绿色荧光蛋白。而我们在该稳定株中再共转染供体质粒ddeGFP和锌指核酸酶质粒时,通过锌指核酸酶介导的基因打靶以及同源重组修复机制对已突变的eGFP进行修复,从而恢复绿色荧光蛋白的表达,笔者通过检测细胞的荧光,验证了锌指核酸酶的打靶活性。实验结果表明,构建的锌指核酸酶具有良好的打靶活性。笔者成功的利用人工锌指核酸酶敲除了小鼠原代骨骼肌细胞和C2C12细胞中的tmem18蛋白。蛋白质分析结果表明,转染锌指核酸酶的细胞中,tmem18表达水平显著下降,从而验证了锌指核酸酶能特异性识别tmem18中的打靶位点并敲除该基因。同时,我们利用RNAi干扰技术建立了 tmem18敲下的稳定细胞株,为后续tmem18功能的研究奠定了基础。蛋白质电泳分析表明,随着tmem18的敲除或敲下,β-catenin与磷酸化Akt的蛋白质水平下调,Wnt信号与胰岛素信号通路均受到损伤。研究表明,tmem18与Wnt信号通路的蛋白质之间存在相互作用,并可能与Wnt信号通路中复合物的形成有关。tmem18的下调会导致GSK-3的表达水平上升,同时可以抑制具有活性的Ser(21/9)磷酸化的GSK-3的水平显著减少。这说明随着tmem18的表达下调,可以引起GSK-3的活性提高。而GSK-3活性的提高,将促进β-catenin的降解,使Wnt信号通路受损。同时,GSK能磷酸化胰岛素底物(IRS-1),从而促进胰岛素受体底物的降解,抑制胰岛素信号通路。同时,我们发现GSK-3活性增强,也会降低胰岛信号通路中的相关激酶如Akt的磷酸化水平降低,使胰岛素信号通路受损。tmem18通过上述机制来调控Wnt信号通路与胰岛素信号通路,也可能是与肥胖相关的分子机制。

关键词：锌指核酸酶 tmem18 Wnt信号通路胰岛素信号通路

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Attmem18 plays important roles in pollen tube and vegetative growth in Arabidopsis

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Journal of Integrative Plant Biology 2016年第7期58卷 679-692页

作者： Xiao-Ying Dou Ke-Zhen Yang Zhao-Xia Ma Li-Qun Chen Xue-Qin Zhang Jin-Rong Bai De Ye Beijing Radiation Center 12 Haidian NanluBeijing 100875China State Key Laboratory of Plant Physiology and Biochemistry College of Biological SciencesChina Agricultural University2 Yuanmingyuan XiluBeijing 100193China.

In flowering plants, pollen tube growth is essential for delivery of male gametes into the female gametophyte or embryo sac for double fertilization. Although many genes have been identified as being involved in the process, the molecular mechanisms of pollen tube growth remains poorly understood. in this study, we identified that the Arabidopsis Transmembrane Protein 18 （Attmem18） gene played important roles in pollen tube growth. The Attmem18 shares a high similarity with the Transmembrane 18 proteins （tmem18s） that are conserved in most eukaryotes and may play important roles in obesity in humans. Mutation in the Attmem18 by a Ds insertion caused abnormal callose deposition in the pollen grains and had a significant impact on pollen germination and pollen tube growth. Attmem18 is expressed in pollen grains, pollen tubes, root tips and other vegetative tissues. The pollen-rescued assays showed that the mutation in Attmem18 also caused defects in roots, stems, leaves and transmitting tracts. Attmem18-GFP was located around the nuclei. Genetic assays demonstrated that the localization of Attmem18 around the nuclei in the generative cells of pollen grains was essential for the male ***, expression of the rice TM EM18-homologous protein （Ostmem18） driven by LAT52 promoter could recover the fertility of the Arabidopsis attmem18 mutant. These results suggested that the tmem18 is important for plant growth in Arabidopsis.

关键词： Arabidopsis male gametophyte plant pollen tmem18 transmembrane protein

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肉质性状相关基因的表达及消化道菌群多样性与动物生长发育的关系

肉质性状相关基因的表达及消化道菌群多样性与动物生长发育的关系

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作者：张冉山东大学

学位级别：硕士

汶上芦花鸡和鲁西黄牛作为我省优良的地方畜禽品种,肉用性能的潜力很大,充分利用和发展它们的优良特性,培育具有独特遗传性状和优点的地方品种,是我国畜禽业应对国外畜禽产品挑战的重要战略目标。然而,单纯通过传统的遗传改良和营养调... 详细信息

汶上芦花鸡和鲁西黄牛作为我省优良的地方畜禽品种,肉用性能的潜力很大,充分利用和发展它们的优良特性,培育具有独特遗传性状和优点的地方品种,是我国畜禽业应对国外畜禽产品挑战的重要战略目标。然而,单纯通过传统的遗传改良和营养调控手段来提高畜禽的肉质已面临瓶颈,故而利用传统方法结合分子生物学手段对畜禽的生长发育进行研究和改善,对于畜禽品种的改良、大规模养殖和生产均有着重要的实际意义。本研究运用现代分子生物学技术手段,通过对肉质性状的候选基因进行序列多态性分析,从而发掘优势基因,为基因新资源的创新奠定技术基础;同时还能为肉质优良性状提供原材料并加快育种进程,因此经济效益和社会效益都非常可观。论文选择了与肌肉性状相关的负向调控因子—肌肉生长抑制素(myostatin,MSTN)基因和与脂肪代谢相关的跨膜蛋白18(tmem18)基因作为候选基因对汶上芦花鸡和育肥期的鲁西黄牛进行肉质性状研究,分析这两个基因的SNPs位点在汶上芦花鸡和鲁西黄牛中的遗传多样性。通过分析SNPs位点与品质性状间的相关性,评价其遗传效应;通过真核表达载体构建、转染及半定量RT-PCR和Real-time PCR等方式进行功能验证,明确其遗传机制,寻找与品质性状相关的分子标记,进而建立起一种优质畜禽分子标记辅助选择方法。研究结果表明,汶上芦花鸡MSTN基因上游序列共有13个E-box(基因转录调控元件),其中E3-box和E4-box存在多态性位点。对MSTN基因的体内表达和体外表达研究表明,E-box在调节MSTN基因转录的过程中起着重要作用,E-box多态性可以改变MSTN基因的表达水平,不同的E-box对于MSTN基因的转录调控能力不同。鲁西黄牛MSTN基因起始密码子上游861bp为SNP位点,通过体外表达实验发现包含该位点的上游序列对启动子具有一定的活化作用,进一步实验结果表明该SNP位点可能参与调节启动子活性,在调节MSTN基因的转录过程中起到重要作用。鲁西黄牛tmem18基因起始密码子上游541bp为SNP位点,体外表达实验结果表明该位点对启动子也有明显的调节作用。动物消化道是一个复杂多样的生态环境,其中微生物种类繁多,数量巨大,这些微生物对宿主的各项生理生化反应、食物的消化和营养物质的吸收、机体免疫调节等方面作用重大,动物消化道与微生物群落之间存在发育共生关系,消化道菌群失调会引发机体胃肠道屏障功能减弱、对营养物质的利用率降低、机体免疫功能低下等问题,进而会影响到动物的正常生长和发育。本文利用基于16SrDNA的PCR-DGGE技术研究了不同油菜籽饲喂水平的鲁西黄牛肠道微生物菌群结构及组成,以及对鲁西黄牛生长发育状况的影响。研究结果表明,消化道不同部位具有其特殊的微生物群落。直肠内微生物的多样性最高,其次是大肠和小肠,瘤胃内的微生物种类和数量较少,主要是产甲烷菌。在菜籽水平高的大肠组份中发现了大量假单胞菌属,这些个体表现出腹泻症状,因此证实了饲喂高菜籽含量对机体的消化作用产生负面影响。这些结果将有助于我们对鲁西黄牛消化道微生物群落的组成结构、功能、影响和调控措施等有更一步的了解,方便我们得到家畜消化道菌群的微生态结构与家畜生长性能之间的关系,同时也为合理的利用菜籽作为绿色饲料添加剂、改善营养条件、调控肠道菌群平衡、提高肉牛抗病能力和生产性能提供了科学而有效地依据。

关键词：汶上芦花鸡鲁西黄牛 MSTN tmem18 消化道菌群多样性

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