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Influence of Glyphaea brevis twig extract on nucleus, tight junctions and expression of inhibin-β, stem cell factor, and androgen binding protein in tm4 Sertoli cells

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Asian pacific Journal of Reproduction 2019年第4期8卷 157-166页

作者： Janet Olayemi Olugbodi Oladipupo David Oluwafemi Adeleke Ojo Afolabi Clement Akinmoladun Department of Biochemistry Bingham UniversityAbuja-Keffi RoadKaruNigeria Department of Medical Bioscience University of the Western CapeBellvilleCape TownSouth Africa Phytomedicine and Biochemical Toxicology Unit Department of BiochemistryAfe Babalola UniversityPMB 5454Ado-EkitiNigeria Phytomedicine Biochemical Pharmacology and Toxicology LaboratoriesDepartment of BiochemistrySchool of SciencesPMB 704The Federal University of TechnologyAkureNigeria

Objective: To examine the influence of Glyphaea (G.) brevis twig extract on the mitochondrial dehydrogenase activity, integrity of the tight junctions between adjacent cells, mitochondria, apoptosis, nucleus and expression of inhibin-β, stem cell factor, and androgen binding protein in tm4 Sertoli cells. Methods: tm4 cell line was used in this study as it exhibited properties similar to the Sertoli cells. tm4 Sertoli cells were exposed to G. brevis twig extract (0.1, 1.0, 10.0, 100.0, or 1000.0μg/mL) for 24, 48 and 72 h. Parameters studied included cell viability [3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyl tetrazolium bromide assay], mitochondrial membrane potential (tetra methyl rhodamine ethyl ester dye), transepithelial electrical resistance, apoptosis (Annexin V Alexa Fluor?488/propidium iodide assay) and mRNA expression (quantitative reverse transcription polymerase chain reaction). Results: G. brevis twig extract had no cytotoxic impact on cell viability, thus, considerably increasing the activity of mitochondrial dehydrogenase enzyme after 24 and 72 h exposure. Transepithelial electrical resistance values revealed substantial (Ptment. Moreover, there was a significant decrease in mitochondrial depolarization of tm4 Sertoli cells exposed to G. brevis twig extract when compared to controls. In addition, G. brevis twig extract significantly reduced necrosis and apoptosis of tm4 Sertoli cells when compared to control. Nevertheless, fluorescence microscopy revealed that the nuclei were egg-shaped and marked uniformly with consistent cell shape at the middle of the tm4 Sertoli cells. Significant stimulatory effects were observed on mRNA levels of inhibin-β, androgen binding protein and stem cell factor. Conclusions: G. brevis twig extract may increase the secretory roles of tm4 Sertoli cells, cells proliferation, as well as cell-cell tight junction integrity. Thus, G. brevis twig may enhance spermatogenesis

关键词： Glyphaea brevis twig tm4 Sertoli cell line Inhibin-β Androgen binding protein

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原花青素对玉米赤霉烯酮诱导小鼠睾丸tm4支持细胞凋亡的保护作用

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黑龙江畜牧兽医 2017年第6期 23-27页

作者：师维王光磊郭佳怡张燚杨淑华张文奎李鹏龙淼沈阳农业大学沈阳110866

为了研究原花青素对玉米赤霉烯酮诱导的小鼠睾丸支持细胞tm4凋亡的保护作用,试验采用体外培养小鼠睾丸支持细胞tm4,用MTT法分别测定原花青素(PC)、玉米赤霉烯酮(ZEA)对tm4细胞生长的影响,流式细胞术检测PC对ZEA诱导的tm4细胞凋亡的保护... 详细信息

为了研究原花青素对玉米赤霉烯酮诱导的小鼠睾丸支持细胞tm4凋亡的保护作用,试验采用体外培养小鼠睾丸支持细胞tm4,用MTT法分别测定原花青素(PC)、玉米赤霉烯酮(ZEA)对tm4细胞生长的影响,流式细胞术检测PC对ZEA诱导的tm4细胞凋亡的保护作用,并检测PC、ZEA引起的总超氧化物歧化酶(T-SOD)的活性变化及丙二醛(MDA)的含量变化。结果表明:PC可显著增加tm4细胞的存活率,抑制tm4细胞的凋亡,提高T-SOD活性,降低MDA含量;有效抑制ZEA诱导的tm4细胞凋亡,主要是通过抗氧化作用对经ZEA染毒的tm4细胞起到保护作用。

关键词：原花青素玉米赤霉烯酮 tm4 支持细胞氧化损伤细胞凋亡

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EAATs底物转运过程中转运区与三聚体界面的相对运动及tm4功能分析

EAATs底物转运过程中转运区与三聚体界面的相对运动及TM4功能分析

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作者：容秀良南方医科大学

学位级别：硕士

谷氨酸是中枢神经系统最重要的兴奋性神经递质,一方面,它从突触前膜释放到突触间隙,作用于突触后膜,传递兴奋性信号,维持正常的细胞信号转导;另一方面,它是一种潜在的神经毒素,释放到突触间隙的谷氨酸发挥效应后需要及时回收入细胞内,... 详细信息

谷氨酸是中枢神经系统最重要的兴奋性神经递质,一方面,它从突触前膜释放到突触间隙,作用于突触后膜,传递兴奋性信号,维持正常的细胞信号转导;另一方面,它是一种潜在的神经毒素,释放到突触间隙的谷氨酸发挥效应后需要及时回收入细胞内,否则蓄积的高浓度谷氨酸会产生兴奋性毒性效应。由于缺乏谷氨酸代谢酶系统,释放到突触间隙的谷氨酸主要依靠突触前膜及神经胶质细胞上的兴奋性氨基酸转运体(Excitatory amino acid transporters,EAATs)摄取回收。因此EAATs对兴奋性突触信号的终止,正常兴奋性传导的维持,兴奋性中毒的预防有重要意义。研究显示EAATs功能失调与多种神经退行性疾病相关,它的结构、功能及转运机制的研究可能给临床上这些疾病的预防和治疗提供线索,因此阐明EAATs转运机制显得尤为重要。EAATs主要通过自身构象不断发生改变来完成底物和离子的转运,它在底物转运循环三维空间构象的变化过程(包括如何与底物和离子结合与解离,参与位点等)是转运机制的研究重点。EAATs的晶体结构解析有一定难度,但其原核生物同源体GltPh的晶体结构可用作EAATs研究的参考模板。研究表明,GltPh羧基端和氨基端分别形成两个区:转运区和三聚体界面。转运区主要由发夹结构(helical hairpin,HP)1、HP2和跨膜区段(transmembrane domain,tm)7、tm8组成,这几个区段参与底物及离子结合位点的构成,并且HP1、HP2分别作为控制底物结合和解离的细胞内外闸门。整个转运区在底物转运过程向胞内运动并发生旋转;而tm2、tm4和tm5组成的三聚体界面在转运循环中趋于静止,起维持平衡的作用。关于EAATs转运区内各区段在底物转运过程中构象改变的研究很多,但是转运区和三聚体界面之间的构象变化研究很少。我们首先分析了 EAATs底物转运过程中转运区与三聚体界面之间的构象变化关系,完善了 EAATs的转运机制。然后进一步分析tm4区段在转运底物过程中的构象改变,揭示真核tm4区段在转运循环中所负功能。第一章GLT-1底物转运过程中tm5与HP2的相对运动我们首先研究胶质细胞谷氨酸转运体(glial glutamate transporter-1,GLT-1)转运区与三聚体界面之间的构象改变。之前的研究表明HP2作为细胞外闸门参与底物和离子的转运;tm5区段部分位点参与转运通道的组成。本课题中我们首先研究tm5与HP2之间的构象变化关系。在tm5和HP2上挑选位点配对,构建了 I283C/S443C和S287C/S443C突变体。然后加入氧化剂Copper(Ⅱ)(1,10-Phenanthroline)3(CuPh)孵育,检测它对突变体底物摄取功能的影响。结果发现CuPh作用后I283C/S443C和S287C/S443C对底物的摄取减少,而其它对照组的底物摄取功能不受影响,说明这两对突变体的两个半胱氨酸之间形成了二硫键,并且这个二硫键的形成只发生在同一个单体内。加入还原剂二硫苏糖醇(DL-Dithiothreitol,DTT)孵育后 I283C/S443C 和 S287C/S443C 的转运活性有所恢复,这反向验证了二硫键的形成。动力学参数检测结果显示,CuPh孵育后I283C/S443C和S287C/S443C与底物的亲和力降低,并且I283C/S443C转运功能受损。至此我们推测这两对位点在空间距离上十分邻近。然后加入不同的细胞外介质,检测它们对CuPh氧化抑制效应的影响。不同细胞外介质对I283C/S443C和S287C/S443C转运活性的影响不同。在加入底物谷氨酸(L-glutamate,L-glu)或K+,使转运体向胞内开放比例增加时,CuPh对I283C/S443C转运活性抑制效应减弱,对S287C/S443C转运活性抑制效应进一步增强。加入底物非转运性抑制剂D,L-threo-β-benzyloxyaspartate(DL-TBOA)对两者转运活性影响不大。加入非透膜性疏基试剂(2-trimethylammonium)methanethiosulfonate(MTSET),检测各个位点的水相通透性。S287C对MTSET不敏感,各时相水相通透性变化不大。I283C和S443C水相通透性变化一致:在转运体向胞内开放时相比例增加时,二者水相通透性降低。综上,我们认为GLT-1转运底物过程中tm5区段和HP2区段之间发生了复杂的相对运动:HP2向胞内运动并不仅仅是简单的直线运动,而是伴随着旋转,旋转方向为偏离tm5上Ile-283位点。而之前根据GltPh晶体学结构模拟计算,发现GltPh上分别对应于GLT-1的Ile-283和Ser-443位点的Val-201和Gly-357位点之间的距离在从胞外开放时相

关键词：构象改变 EAATs tm4 HP1 HP2 tm5

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他克林、虾青素对LPS诱导tm4细胞和小鼠睾丸炎性损伤的保护作用

他克林、虾青素对LPS诱导TM4细胞和小鼠睾丸炎性损伤的保护作用

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作者：蔡金霞广西大学

学位级别：硕士

他克林是1995年至1996年期间美国食品和药物管理局批准用于治疗阿尔兹海默症的第一种药物。广西大学动物解剖实验室已有研究发现,他克林在猪精子液态保存和冷冻保存方面都有很好的抗凋亡效果。虾青素是一种天然类胡萝卜素,国内外对其抗... 详细信息

他克林是1995年至1996年期间美国食品和药物管理局批准用于治疗阿尔兹海默症的第一种药物。广西大学动物解剖实验室已有研究发现,他克林在猪精子液态保存和冷冻保存方面都有很好的抗凋亡效果。虾青素是一种天然类胡萝卜素,国内外对其抗炎症、抗氧化和增强免疫等药理作用进行了广泛研究,但在动物炎症方面的应用还没有深入的研究,故其在用于治疗动物疾病及替代抗生素功能上还有待研究与开发。本研究试图从体内、体外两个层面探索他克林、虾青素对小鼠睾丸支持细胞(Mouse testicular support cells,tm4)和小鼠睾丸的抗炎保护作用,进而助力高质量精子的产生及药物的推广应用。具体研究内容及结果如下:试验1.小鼠tm4细胞的培养及脂多糖(Lipopolysaccharide,LPS)诱导浓度探索。将小鼠tm4细胞系用含有5%马血清、2.5%胎牛血清、1%双抗的DMEM/F12细胞培养基中培养,观察细胞生长周期,并采用油红O特异染色法鉴定细胞纯度,采用CCK8及ELISA法检测LPS对tm4细胞损伤的程度。结果提示,tm4细胞培养4 h后出现贴壁;12 h后几乎全部贴壁,整体轮廓清晰并伴有触角;培养24 h之后,细胞已基本具备成熟细胞的轮廓伸出触角,呈不规则型且开始增殖;培养48 h之后,细胞之间相互连接形成网状,逐渐形成单层贴壁细胞。油红O染色细胞纯度>98%,其中LPS浓度为1μg/m L诱导处12 h更容易产生炎性损伤(Ptm4细胞保护作用的评价。试验分为4组(空白组,LPS组,LPS+Tac组,LPS+Asx组)。取生长状态良好的对数期tm4细胞,以每孔1×10个细胞的密度接种于6 m L培养板中,空白组加DMEM/F12溶液3 m L,LPS组加含LPS(1μg/m L)的DMEM/F12溶液3 m L,LPS+Tac组细胞先诱导损伤后再加含他克林(0.01μg/m L、1μg/m L、100μg/m L、10000μg/m L)的DMEM/F12溶液3 m L,LPS+Asx组细胞先诱导损伤后再加含虾青素(1μg/m L)的DMEM/F12溶液3 m L。按试剂盒提取细胞总RNA与蛋白质进行荧光定量PCR与WB试验。结果显示,与空白组相比,LPS组显著上调IL-6、TNF-α的m RNA及NF-κB蛋白表达(P4只5周龄正常雄性小鼠,分为4组(空白组,LPS组,LPS+Tac组,LPS+Asx组),每组6只。空白组每只注射200μL生理盐水。LPS组小鼠腹腔注射30 mg/kg LPS诱导损伤12 h;LPS+Tac组注射30 mg/kg LPS诱导损伤12 h后,再注射0.05 mg/kg他克林保护1.5 h;LPS+Asx组注射30 mg/kg LPS诱导损伤12 h后,再注射0.8 mg/kg虾青素保护6 h。解剖取出一侧睾丸制成石蜡切片,运用HE染色法观察组织病理形态,另一侧睾丸进行q RT-PCR和WB检测。鉴定结果提示,LPS诱导损伤模型成功,且0.05mg/kg他克林、0.8 mg/kg虾青素显著抑制LPS诱导的雄性小鼠睾丸异常损伤。与空白组相比,LPS组显著上调IL-6、TNF-α、HSP70的m RNA及TLR4、HSP70蛋白表达(P4、HSP70蛋白表达(P4蛋白表达(Ptm4细胞和小鼠睾丸保护作用机制及最佳保护浓度,结果提示,0.01μg/m L他克林、1μg/m L虾青素能显著抑制LPS处理的体外培养的小鼠tm4细胞损伤以及0.05 mg/kg他克林、0.8 mg/kg虾青素能显著抑制体内小鼠睾丸的异常损伤。试验结果为推动他克林、虾青素在实际生产中对雄性动物生殖器官的抗炎保护机制和高质量精子的产生提供了一定的理论依据。

关键词：他克林虾青素炎性损伤 tm4 睾丸脂多糖

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Sertoli's细胞的培养及转gdnf基因的tm4细胞系的建立

Sertoli's细胞的培养及转gdnf基因的TM4细胞系的建立

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作者：唐丽娟曲阜师范大学

学位级别：硕士

精原干细胞(spermatogonial stem cells, SSCs)的体外培养与分化研究是近年来生殖生物学的研究热点,也是揭示精子发生机理的新途径。许多的研究已经表明,SSCs的体外增殖需要饲养层细胞和多种生长因子的支持。在睾丸曲细精管中,支持细胞(... 详细信息

精原干细胞(spermatogonial stem cells, SSCs)的体外培养与分化研究是近年来生殖生物学的研究热点,也是揭示精子发生机理的新途径。许多的研究已经表明,SSCs的体外增殖需要饲养层细胞和多种生长因子的支持。在睾丸曲细精管中,支持细胞(Sertoli cells)是生精上皮中的唯一体细胞,为生精细胞发育提供必要的营养和生长因子,包括胶质细胞源神经营养因子(glial cell line-derived neurotrophic factor, GDNF)和成纤维细胞生长因子(fibroblast growth factor, FGF)等。研究还表明,睾丸中的Sertoli's细胞等分泌GDNF,并且在体外培养SSCs时,高浓度的GDNF促进SSCs的增殖,低浓度的GDNF会促进SSCs分化。因此,在本研究中,我们首先通过分离和培养小鼠睾丸的Sertoli's细胞,获得Sertoli's细胞纯培养物,然后从培养的Sertoli's细胞中克隆gdnf基因,转入到睾丸支持细胞系tm4中表达,意在得到超表达GDNF的tm4细胞作为SSCs培养时的饲养层细胞,达到SSCs长期培养的目的。为获得高纯度的Sertoli's细胞培养物,我们对已经报道的方法进行了改良。此改良方法主要包括二步酶消化、分级离心和差异贴壁分选等。所用小鼠是出生后0-5天的昆明白乳鼠。通过形态学观察和Sertoli's细胞标志分子vimentin的免疫细胞化方法来确定Sertoli's细胞的纯度。在分子生物学操作时,我们应用Trizol试剂法提取培养的Sertoli's细胞的总RNA,通过RT-PCR方法获得gdnf基因,应用T4 DNA连接酶将gdnf基因克隆到pMD-T载体上,然后转化感受态大肠杆菌DH5,并筛选出阳性重组子。在基因测序正确后,将gdnf基因克隆到真核表达载体pcDNA3.1上。通过脂质体法转染培养的tm4细胞,利用G418筛选获得阳性tm4细胞并进行克隆培养。为验证gdnf基因在转基因tm4细胞中的表达状况,我们进行了免疫细胞化学和Western bloting检测。对培养的睾丸细胞培养物的形态学观察表明,培养细胞的形态符合各文献报道的Sertoli's细胞的特征;vimentin免疫细胞化学检测表明,98%以上的培养细胞是vimentin阳性细胞,也就是说培养物是高纯度的Sertoli's细胞。Sertoli's细胞在体外培养时,不能长期保持。一般情况下,细胞只能传代3-5次,维持增殖时间在20天左右。对我们所提取的支持细胞总RNA,琼脂糖甲醛变性凝胶电泳检测表明无明显降解,完整性好;对RT-PCR法克隆的gdnf基因的琼脂糖凝胶电泳结果表明,条带符合预期的大小;测序结果表明,克隆的gdnf基因序列正确,我们已经扩增出了gdnf目的基因;对重组质粒pcDNA3.1-gdnf双酶切结果显示,gdnf真核表达载体构建正确;通过提取转gdnf基因的tm4细胞的总RNA,利用gdnf基因的特异性引物所进行的RT-PCR结果表明,gdnf基因在转基因tm4细胞中有表达;应用兔抗小鼠GDNF抗体进行的免疫细胞化学检测和Western Blot显示,实验组tm4细胞中有高效的gdnf基因表达。总之,通过本研究,我们成功的高纯度的分离和培养了小鼠Sertoli's细胞,从培养的Sertoli's细胞中克隆了gdnf基因,并获得了高表达GDNF的转基因tm4细胞系。

关键词： ICR小鼠支持细胞体外培养 GDNF tm4 转基因

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tm4型空调小喷嘴的性能分析及应用效果

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北京纺织 1986年第6期 29-33页

作者：李铁钢天津第四棉纺织厂

tm;型离心式小喷嘴试制成功后,我们及时的组织了由专业技术干部、技术工人参加的测试小组,分别对国内正广泛应用的几种喷嘴和原罗瓦离心式小喷嘴及tm;小喷嘴进行了大量的对比试验。一、测试了在不同的工作压力下,各种喷嘴的流量,有效射... 详细信息

tm;型离心式小喷嘴试制成功后,我们及时的组织了由专业技术干部、技术工人参加的测试小组,分别对国内正广泛应用的几种喷嘴和原罗瓦离心式小喷嘴及tm;小喷嘴进行了大量的对比试验。一、测试了在不同的工作压力下,各种喷嘴的流量,有效射程和喷射锥角。二,测试了在不同的工作压力下各种喷嘴的雾化程度。三,测试了各种喷嘴扩大试验面上机应用的对比情况。现将测试情况和工作原理分述如下。一、单嘴试验: 1.离心式喷嘴是由进液管、旋流室和喷口组成（tm;小喷嘴也同样）。实验方法如图一。

关键词：雾化程度密度有效射程 tm4 喷水量空调

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Mutated elements of a complex promoter (Amh) can help to demonstrate the role of certain elements in controlling differential gene expression

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American Journal of Molecular Biology 2012年第4期2卷 351-358页

作者： David W. Dresser The Ashworth Laboratory The University of Edinburgh Edinburgh UK

Amh is a single copy gene which is expressed in different ways during mammalian development. Several potential promoter elements have been identified using physiological experimentation and on the basis of interspecific sequence comparison. The role of putative promoter elements in controlling gene expression has been investigated by many workers over the last two decades and here by individually mutating each element. Expression was measured in vitro in cells of Sertoli descent by flowcytometry using EGFP as a reporter gene. Three lines of murine cells were used;pre- and post-pubertal Sertoli and granulosa cells. Differences between the three lines of cells, support the view that differentiation in this in vitro model system is likely to be at the level of available transcription factors at given points in development.

关键词： Anti-Mullerian Hormone SDM Site Directed Mutation Murine SMAT-1 tm4 Sertoli Cell Lines KK1 Granulosa Cell Line

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从ERα-Nrf2信号通路探讨淫羊藿苷对衰老Sertoli细胞功能的影响

从ERα-Nrf2信号通路探讨淫羊藿苷对衰老Sertoli细胞功能的影响

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作者：陈茜三峡大学

学位级别：硕士

目的:（1）建立D-半乳糖（D-Galactose,D-gal）诱导的小鼠Sertoli细胞株tm4细胞衰老模型;（2）研究淫羊藿苷（Icariin,ICA）对衰老Sertoli细胞株tm4细胞的改善作用,并从ERα-Nrf2信号通路探讨其分子机制。方法:1、将培养的小鼠Sertoli... 详细信息

目的:（1）建立D-半乳糖（D-Galactose,D-gal）诱导的小鼠Sertoli细胞株tm4细胞衰老模型;（2）研究淫羊藿苷（Icariin,ICA）对衰老Sertoli细胞株tm4细胞的改善作用,并从ERα-Nrf2信号通路探讨其分子机制。方法:1、将培养的小鼠Sertoli细胞株tm4细胞给予D-gal刺激,实验分为Control组、D-gal 100 m M组和150 m M组。检测指标如下:（1）MTT筛选D-gal浓度;（2）光镜观察tm4细胞形态变化;（3）β-半乳糖苷酶（β-gal）染色法观察细胞衰老情况;（4）RT-PCR检测衰老相关基因P16和P21 m RNA表达水平;（5）免疫荧光法检测P21表达及定位;（6）流式细胞术检测tm4细胞周期变化及细胞凋亡;（7）RT-PCR及Western blot法检测tm4分泌的相关因子GDNF、BMP4、SCF和PLZF m RNA和蛋白表达水平;（8）Western blot法检测Nrf2信号通路相关蛋白（Nrf2、HO-1和NQO-1）的表达;（9）免疫荧光法检测Nrf2表达及定位。2、将培养的tm4细胞分为Control组、D-gal组、DMSO组和ICA（0.01、0.05、0.1、0.5、1、2、4、8μM）组,通过MTT筛选出ICA药物浓度。随后再将实验分为Control组、D-gal组、D-gal+ICA（0.5μM）组和D-gal+ICA（1μM）组。检测指标如下:（1）β-gal染色法观察ICA对衰老tm4细胞的影响;（2）Western blot法检测tm4细胞分泌因子GDNF、BMP4、SCF和PLZF蛋白表达水平;（3）荧光探针DCFH-DA法检测ICA对衰老tm4细胞中ROS水平的影响;（4）Western blot法检测Nrf2、HO-1和NQO-1蛋白表达水平;（5）免疫荧光法检测Nrf2的表达及定位;（6）Western blot法检测tm4细胞雌激素受体ERα、ERβ的蛋白表达水平。3、将培养的tm4细胞给予ICA（1μM）预保护后,转染ERαsi RNA至tm4细胞中,同时给予D-gal刺激。检测指标如下:（1）免疫荧光法筛选tm4细胞中si RNA瞬时转染浓度;（2）Western blot法筛选ERαsi RNA最佳沉默效率;（3）将tm4细胞分为Negative Control组、D-gal组、D-gal+ICA组和D-gal+ICA+ERαsi RNA组,采用β-gal染色法观察给予ERαsi RNA后,ICA对衰老tm4细胞的影响;（4）Western blot法检测ERα、Nrf2、HO-1、NQO-1、GDNF、BMP4、SCF和PLZF的蛋白表达水平;（5）免疫荧光法检测Nrf2的表达及定位。结果:1、（1）MTT结果显示,与Control组比较,D-gal为100 m M和150 m M浓度时tm4细胞活性显著下降且不低于50%;（2）光镜结果显示,D-gal 100 m M和150 m M组中细胞形态不完整,细胞表面粗糙,胞质出现空泡化,且部分细胞由长梭形逐渐变圆、细胞体积及细胞核显著增大,且D-gal 150 m M组细胞体积增大更明显,伴有细胞数量减少的现象;（3）β-gal染色结果显示,与Control组比较,D-gal 100 m M组和D-gal 150m M组衰老细胞数量均显著增多;（4）RT-PCR结果显示,与Control组比较,D-gal 100m M和150 m M组衰老基因P16、P21 m RNA表达均显著上调;（5）免疫荧光结果显示,与Control组比较,D-gal 100 m M和150 m M组tm4细胞核内P21荧光表达明显增加,表明衰老细胞数量增多;（6）凋亡结果显示,D-gal 100 m M组细胞早期凋亡比率与Control组无明显差异,而D-gal 150 m M组细胞早期凋亡比率较前两者有所增加,表明D-gal 100 m M组成功诱导tm4细胞衰老;（7）周期结果显示,与Control组比较,D-gal100 m M和150 m M组处于G1期的细胞比例增高、S期细胞比例降低,细胞阻滞于G0/G1期,表明D-gal刺激影响了tm4细胞的分裂和增殖;（8）RT-PCR及Western blot结果显示,与Control组比较,D-gal 100 m M和150 m M组中tm4细胞分泌的细胞因子GNDF、SCF、BMP4和PLZF m RNA及蛋白表达水平均显著降低;（9）Western blot结果显示,D-gal 100 m M和150 m M组Nrf2、HO-1、NQO-1的蛋白表达水平显著下调;（10）免疫荧光结果显示,与Control组比较,D-gal

关键词：淫羊藿苷衰老 Sertoli细胞 tm4 ERα-Nrf2信号通路

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靶向干扰五种基因对PC12细胞增殖的影响

靶向干扰五种基因对PC12细胞增殖的影响

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作者：宋士娜昆明医学院

学位级别：硕士

[目的]研究磷酸吡哆醛激酶(pyridoxal kinase, PDXK)、电压依赖性阴离子通道2(VDAC2, voltage-dependent anion channels 2)、鸟苷酸解离抑制因子α(RhoGDP dissociation inhibitor, RhoGDI-α)、原肌球蛋白4(tropomyosin 4, tm4)、β-突轴核蛋白(β-synuclein,β-sncb)在PC12细胞生长中的作用。 [方法]化学合成三条分别针对PDXK、VDAC2、RhoGDI-α、tm4、β-sncb五个基因的siRNA序列(Si-r-PDXK1、2、3, Si-r-VDAC2、2、3, Si-r-RhoGDI-a、2、3, Si-r-tm4、2、3, Si-r-β-sncb、2、3),同时化学合成一条随机阴性序列对照siRNA SCR(scramble siRNA);使用阳离子脂质体Lipofectamine2000tm作为转染试剂,将PDXK、VDAC2、RhoGDI-α、tm4、β-sncb基因的siRNA转染入大鼠肾上腺嗜铬瘤细胞(PC12细胞),RT-PCR技术筛选出最佳干扰序列;24h时用免疫细胞化学染色观察细胞内五种蛋白表达情况、MTT法检测五种基因干扰对PC12细胞增殖和细胞形态及数量的影响。 [结果] 1、PDXK基因干扰结果：Si-r-PDXK组与siRNA SCR组相比,PDXK mRNA表达明显被抑制,胞浆内PDXK蛋白表达明显下降,而Si-r-PDXK组和Si-r-PDXK组与siRNA SCR组相比PDXK mRNA表达未被抑制(P0.05)。 4、tm4基因干扰结果：与siRNA SCR组比较,Si-r-tm4终浓度为80nM及Si-r-tm4终浓度为50nM、80nM、100nM对tm4 mRNA的表达具有抑制作用(Ptm4终浓度为50nM组和Si-r-tm4终浓度为80nM及100nM组细胞活力与siRNA SCR组细胞活力相比均减低(Ptm4终浓度为50nM、80nM及Si-r-tm4终浓度为50nM、80nM、100nM与siRNA SCR组比较,细胞数量明显减少(Ptm4、β-sncb基因表达,其中PDXK、VDAC2、tm4、β-sncb表达降低后可明显抑制PC12细胞增殖及生长。然而尽管RhoGDI-a基因被有效干扰,但对PC12细胞生长没有明显影响。本实验不仅建立了体外RNA干扰技术,而且利用该技术发现四种基因能影响PC12细胞存活及生长,从而为研究损伤状态下这些基因的体内功能提供了前期实验证据。

关键词： RNA干扰 PC12细胞 PDXK VDAC2 RhoGDI-α tm4 β-sncb

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基于tm4C123单片机的模拟电磁曲射炮设计与试验——2019全国电子设计竞赛H题试析

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赤峰学院学报（自然科学版） 2019年第12期35卷 45-48页

作者：陈颜皓南京邮电大学电子与光学工程学院

基于2019年全国大学生电子设计竞赛中H题"模拟电磁曲射炮"的任务要求,设计了模拟电磁炮自动控制系统.系统以TI公司的tm4系列单片机作为电磁炮的控制核心,采用LDX-218数字舵机驱动云台.可实现通过串口屏输入射击距离和偏转角;通过激光测... 详细信息

基于2019年全国大学生电子设计竞赛中H题"模拟电磁曲射炮"的任务要求,设计了模拟电磁炮自动控制系统.系统以TI公司的tm4系列单片机作为电磁炮的控制核心,采用LDX-218数字舵机驱动云台.可实现通过串口屏输入射击距离和偏转角;通过激光测距结合OpenMV摄像头的图像处理捕获引导标识从而对电磁炮进行智能控制.3个基本要求测试任务全部完成,3个发挥部分测试任务部分完成,作品获得该次竞赛江苏省二等奖.

关键词：电磁炮舵机云台 tm4 OpenMV摄像头

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