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藏药巴朱抑制tlr4/md2复合物形成改善小鼠急性肾损伤的研究

藏药巴朱抑制TLR4/MD2复合物形成改善小鼠急性肾损伤的研究

引用

作者：詹洪洪西南大学

学位级别：硕士

藏医药作为中国四大民族医药之一,在西藏自治区不仅是重要的医疗卫生资源和高价值的经济资源,同时也是该地区优秀的民族文化资源。如今,藏医药已成为西藏支柱产业之一。藏药材是藏医药事业健康发展的重要物质基础和可持续发展的宝贵资... 详细信息

藏医药作为中国四大民族医药之一,在西藏自治区不仅是重要的医疗卫生资源和高价值的经济资源,同时也是该地区优秀的民族文化资源。如今,藏医药已成为西藏支柱产业之一。藏药材是藏医药事业健康发展的重要物质基础和可持续发展的宝贵资源。藏药巴朱,是紫茉莉科植物喜马拉雅紫茉莉(Oxybaphus himalaicus Edgew.)的根。据藏药经典《图鉴》记载,巴朱可生下身温,用于肾炎水肿等,为藏医“五根”药之上品。然而,目前关于巴朱的传统功效的现代药理研究报道极少。急性肾损伤(Acute kidney injury,AKI)是一系列临床症状的综合体,表现为肾功能在短时间内的迅速下降,肾脏组织中的炎症反应是不同诱因下AKI的主要共同点。因此,为从现代药理学角度评价巴朱治疗“肾炎水肿”的药效,本课题首先对巴朱进行乙醇提取,并对其乙醇总提物进行分离,筛选其中抗炎活性部位并探索其抗炎作用机制;同时,应用脂多糖(Lipopolysaccharide,LPS)建立AKI小鼠模型,评价巴朱抗炎活性部位改善小鼠AKI的药效作用。具体涵盖以下3个方面内容:1、巴朱的提取、分段及活性筛选(1)巴朱经乙醇回流提取得到巴朱乙醇总提物。(2)采用D101大孔树脂对巴朱乙醇总提物进行分离,以乙醇-水梯度洗脱,得到5个组分Fraction A-E。(3)以1μg/m L LPS诱导RAW264.7巨噬细胞炎症模型,对各部位进行抗炎活性筛选,发现Fraction B(标记为OE),具有较低的细胞毒性,且抑制一氧化氮(Nitric oxide,NO)释放作用最强,是主要的抗炎活性部位,故本研究以OE进行后续研究。(4)采用超高效液相色谱串联质谱对OE中的成分进行鉴定,通过与mz Cloud数据库进行比对,匹配到41个化合物mz Cloud Best Match打分高于85分。2、OE的体外抗炎活性评价(1)在LPS诱导的RAW264.7巨噬细胞模型中,OE呈浓度依赖性减少了NO的释放;Western blotting实验结果表明OE显著逆转了LPS诱导的i NOS、COX-2、TNF-α及IL-6等炎症相关蛋白的表达水平;q PCR实验结果表明OE显著下调了i NOS、COX-2、TNF-α、IL-6及MCP-1等炎症相关基因的表达水平。3、OE的抗炎作用机制研究(1)NF-κB是调控炎症信号转导的关键转录因子,免疫荧光及Western blotting的结果表明,OE逆转了LPS诱导的转录因子NF-κB的p65亚单位的入核及蛋白磷酸化,并显著减少了IκB蛋白的降解,从而抑制NF-κB的激活。(2)tlr4与其共受体md2形成复合物,可诱导NF-κΒ信号通路激活。采用免疫共沉淀实验探究OE对tlr4、md2的作用,结果表明80μg/m L的OE可显著抑制RAW264.7巨噬细胞中tlr4/md2复合物的形成,且同时抑制了tlr4介导的My D88及TRIF依赖性通路的激活。(3)tlr4的激活进一步引起MAPK通路的活化及IFN-β等Ⅰ型干扰素的编码。Western blotting结果表明,OE显著下调了tlr4激活介导的MAPK,包括JNK、ERK、p38等的蛋白磷酸化水平;采用q PCR对TRIF依赖性通路调节的IFN-β的m RNA水平进行检测,发现OE显著降低了LPS诱导的IFN-β的m RNA水平。(4)以si RNA转染RAW264.7巨噬细胞验证OE通过调控tlr4信号通路发挥抗炎作用的机制。Western blotting的结果表明,si tlr4干扰显著逆转了LPS诱导的p65的入核及蛋白磷酸化、IκB的降解及MAPK通路蛋白的蛋白磷酸化,且OE处理后相较于si tlr4单独处理未见显著降低,说明OE的作用被si tlr4抵消。(5)活性氧(Reactive oxygen species,ROS)是炎症反应中重要的介质,研究采用DCFH-DA法对RAW264.7巨噬细胞ROS水平进行检测,发现OE与内吞抑制剂Dynasore类似,显著减少了LPS诱导的巨噬细胞内ROS的生成。(6)进一步对OE调控ROS生成的潜在机制进行探究,免疫荧光的结果显示,与Dynasore相似,OE逆转了由LPS诱导的RAW264.7巨噬细胞内ROS生成的重要调节蛋白NOX2与内体标记蛋白EEA1在细胞质中的共定位。此外,Western blotting结果表明,OE显著降低了细胞中NOX2在胞质中蛋白表达水平,而在采用si tlr4处理细胞后发现,此作用被抵消。综上,OE通过抑制tlr4/md2复合物形成,调控My D88及TRIF依赖性通路的激活,并限制NOX2内吞,从而减少促炎因子及ROS的产生,进而缓解LPS诱导的炎症。4、OE减轻小鼠AKI的研究以100,200和400 mg/kg剂量的OE连续灌胃7天,随后腹腔注射LPS(10mg/kg)诱导小鼠AKI,评价OE

关键词：巴朱 OE 急性肾损伤 tlr4/md2 炎症

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原花青素B1通过tlr4/md2抑制LPS介导的炎症反应

原花青素B1通过TLR4/MD2抑制LPS介导的炎症反应

引用

作者：张健大连医科大学

学位级别：硕士

目的：脂多糖为革兰氏阴性细菌最主要的致病物质,又称内毒素,其诱发的一系列机体炎症细胞参与的炎性介质释放链级炎症反应,对人体组织造成损伤,甚至引发脓毒症导致全身多器官功能不全,危机生命。固有免疫细胞通过Toll样受体(tlrs)对内... 详细信息

目的：脂多糖为革兰氏阴性细菌最主要的致病物质,又称内毒素,其诱发的一系列机体炎症细胞参与的炎性介质释放链级炎症反应,对人体组织造成损伤,甚至引发脓毒症导致全身多器官功能不全,危机生命。固有免疫细胞通过Toll样受体(tlrs)对内毒素进行识别,比如单核细胞、巨噬细胞等表面的tlr4在结合LPS以后即被激活,通过一系列胞内信号传导,释放出以肿瘤坏死因子α(TNF-α)为代表的前炎症因子。tlr4与LPS并非直接结合,与前者同时表达的髓样分化蛋白2(md-2)介于两者之间,而且md-2内部具有LPS的关键毒性成分——脂质A的结合位点。tlr4下游接头分子是髓样细胞分化因子88(MyD88),介导非常重要的MyD88依赖性tlr4信号传导通路,即包括了NF-κ B及MAPK两条路径,该通路的激活导致了前炎症因子释放,如IL-1β、TNF-α。原花青素(Procyanidin)是一种富含多酚类的化合物,在抗炎免疫方面,其被发现能够减低前炎症因子的分泌。但是原花青素的抗炎机制目前还不完全清楚,有研究显示在体外细胞炎症模型中,原花青素对LPS介导的炎症反应的减轻作用与其对NF-κ B及MAPK两条信号通路的抑制有关。为了进一步探明原花青素与上游tlr4/md2复合受体的关系,本研究以完全表达tlr4的人单核细胞系(THP-1)细胞为模型,观察原花青素B1对LPS介导的炎症细胞tlr4/md2下游关键接头分子MyD88以及md-2的转录水平的影响。方法：人急性单核细胞白血病细胞系THP-1在37℃、5%CO2条件下,用含10%胎牛血清的RPMI1640培养基传代培养,细胞密度维持在5～10×105个/ml。药物实验期间所用细胞均处于对数生长期。采用CCK-8法测药物的细胞毒性,将THP-1细胞接种于96孔板中,细胞孵箱预培养,加入不同浓度的原花青素B110μl(终浓度为50～200μ g/ml),加入10μL的CCK-8试剂孵育培养后溶液测光吸收值(0D),并且以得到的安全的原花青素B1浓度范围进行后续实验。采用LPS诱导的THP-1细胞株建立细胞炎症反应模型,以ELISA法测TNF-α的释放含量,THP-1细胞接种于96孔板,孵箱预培养24h,之后以LPS(1μ g/ml)加或不加原花青素B1(100μ g/ml、50μ g/ml)刺激THP-1细胞,培养18h,分别收集各组细胞悬液离心后上清液体,与配置好的标准品一起行ELISA检测,以标准品的光吸收值(O D)建立标准曲线,进而得到各实验组TNF-α的释放量水平。沿用LPS诱导的THP-1细胞株建立细胞炎症反应模型,借助实时定量PCR法分析MyD88mRNA以及md-2mRNA转录水平的变化,设计合成人MyD88的基因序列、人md-2的基因序列及内参人甘油醛脱氢酶GAPDH的基因序列的引物,THP-1细胞接种于6孔板中,孵箱预培养24h,以LPS(1μg/ml)加或不加原花青素B1刺激THP-1细胞,培养18h。提取各实验组细胞总RNA,之后反转录成cDNA与引物进行目的基因扩增,计算MyD88mRNA及md-2mRNA相对定量。结果：CCK-8测试药物毒性的实验中,原花青素B1浓度不大于100μ g/ml的情况下THP-1细胞活力几乎不受影响,而当原花青素B1浓度在150μg/ml200μg/ml的情况下,THP-1细胞活力均受到损害。ELISA检测TNF-α释放量实验中,对于阴性对照组,LPS单独刺激组的TNF-α分泌水平明显升高,表明经过LPS的刺激,THP-1细胞做出免疫反应,经过一系列胞内信号传导,最终释放出前炎症因子。原花青素B1干扰组和LPS单独刺激组相比,其肿瘤坏死因子释放水平明显降低,且具有统计学差异。另外,由于原花青素B1干扰的剂量差异,原花青素B1100μg/ml组较原花青素B150μ g/ml组所释放的肿瘤坏死因子α水平更低,且这种差异同样具有统计学意义。Real-time PCR检测目的基因的实验中,和阴性对照组相比,LPS刺激组MyD88mRNA及md-2mRNA相对量显著提高,提示LPS可以显著上调THP-1细胞的MyD88mRNA及md-2mRNA表达。而原花青素B1干扰组MyD88mRNA及md-2mRNA相对量较LPS组显著下降,且差异具有统计学意义,提示原花青素B1对LPS介导的MyD88mRNA及md-2mRNA表达上调具有抑制作用。结论：原花青素B1对于THP-1细胞具有毒性,而当原花青素B1的浓度在100ug/ml及以下时,细胞活力不受损害。原花青素B1可明显降低LPS诱导下THP-1细胞肿瘤坏死因子α的释放,并且呈浓度依赖性。原花青素B1这种作用可能其抑制THP-1细胞炎症反应时MyD88mRNA及md-2mRNA表达上调有关,提示原花青素可能是一种潜在的tlr4/md2复合受体拮抗剂。

关键词：炎症原花青素B1 tlr4/md2 MyD88

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