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实验动物科学 2023年第6期40卷 19-25页

作者：匡嘉兵郭松雷建平程煜方武汉市第四医院骨科武汉430060

目的探究miR-494在骨质疏松大鼠中的表达及其调控机制。方法选取30只8周龄雌性Sprague-Dawley大鼠,构建骨质疏松大鼠模型。双能X线吸收仪测定骨密度。ELISA检测大鼠血清中骨钙素(BGP)和总碱性磷酸酶(TALP)含量。分类培养大鼠骨髓间充... 详细信息

目的探究miR-494在骨质疏松大鼠中的表达及其调控机制。方法选取30只8周龄雌性Sprague-Dawley大鼠,构建骨质疏松大鼠模型。双能X线吸收仪测定骨密度。ELISA检测大鼠血清中骨钙素(BGP)和总碱性磷酸酶(TALP)含量。分类培养大鼠骨髓间充质干细胞(BMSCs)。qRT-PCR检测miR-494和tlr4 mRNA的表达。Western blot检测tlr4蛋白的表达。双荧光素酶报告基因验证miR-494与tlr-4的靶向关系。CCK8实验检测各组BMSCs的增殖能力。茜素红S染色检测各组BMSCs成骨分化情况。油红O染色检测各组BMSCs成脂分化情况。结果和NC组相比,OP组大鼠骨密度、BGP含量、细胞增殖能力、矿化结节数均显著降低,TALP含量、miR-494和tlr4的表达、脂肪细胞数均显著升高(P494 inhibitor组大鼠骨密度、BGP含量、细胞增殖能力、矿化结节数均显著升高,TALP含量、miR-494和tlr4的表达、脂肪细胞数均显著降低(P494 inhibitor组相比,OP+miR-494 inhibitor+tlr-4 vector组大鼠骨密度、BGP含量、细胞增殖能力、矿化结节数均显著降低,TALP含量、miR-494和tlr4的表达、脂肪细胞数均显著升高;OP+miR-494 inhibitor+sh tlr-4组大鼠骨密度、BGP含量、细胞增殖能力、矿化结节数均显著升高,TALP含量、miR-494和tlr4的表达、脂肪细胞数均显著降低(P494通过促进tlr-4通路的表达,加快大鼠骨质疏松的进展,为骨质疏松的发病机制提供新的理论依据。

关键词： miR-494 tlr-4通路骨质疏松发病机制

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二草清肝汤对内毒素性肝损害模型大鼠肝脏Kupffer细胞tlr-4信号转导通路的影响

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中华中医药学刊 2018年第6期36卷 1522-1525页

作者：刘三海吴春明林上助欧阳钦黄强陈靓温州市中医院肝病科浙江温州325000 温州市中医院消化科浙江温州325000

目的：探讨二草清肝汤对内毒素性肝损害模型大鼠肝脏Kupffer细胞的活化及功能依赖tlr4信号传导通路的影响。方法：120只雄性Wistar大鼠,随机分成空白组、模型组、二草清肝汤大剂量（20 g/kg）和小剂量组（10 g/kg）,每组30只,连续灌胃给... 详细信息

目的：探讨二草清肝汤对内毒素性肝损害模型大鼠肝脏Kupffer细胞的活化及功能依赖tlr4信号传导通路的影响。方法：120只雄性Wistar大鼠,随机分成空白组、模型组、二草清肝汤大剂量（20 g/kg）和小剂量组（10 g/kg）,每组30只,连续灌胃给药12 d。末次给药4 h后,除空白组外所有大鼠腹腔注射D-Gal N（800 mg/kg）/LPS（0.04 mg/kg）诱导内毒素性肝损害,造模后1、2、4、6、12、24 h每组取5只大鼠,Western印迹法检测Kupffer细胞Toll样受体-4（tlr-4）、TIR结构域的衔接蛋白（TRIF）、IL-1相关蛋白激酶（IRAK）、核因子-κB（NF-κB）蛋白表达变化。结果：造模后1、2 h,各组大鼠tlr-4、TRIF、IRAK、NF-κB蛋白表达无显著差异。造模后4、6、12、24 h,与空白组比较,模型组大鼠肝脏Kupffer细胞tlr-4、TRIF、IRAK、NF-κB蛋白表达明显增多（P〈0.05）;与模型组比较,二草清肝汤大、小剂量组大鼠肝脏Kupffer细胞tlr-4、TRIF、IRAK、NF-κB蛋白表达明显减少（P〈0.05）;大、小剂量组同时间比较无显著差异。结论：二草清肝汤可能通过抑制tlr-4信号转导通路的活性发挥其抗炎效应。

关键词：二草清肝汤内毒素性肝损害大鼠 Kupffer细胞 tlr-4通路

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黄连碱体外抑制caspase-1剪切活性及其基于tlr-4炎症信号转导通路抗炎机制研究

黄连碱体外抑制caspase-1剪切活性及其基于TLR-4炎症信号转导通路...

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作者：吴嘉思成都中医药大学

学位级别：硕士

目的:三黄泻心汤作为经典方剂临床上常用于动脉粥样硬化,上呼吸道感染,糖尿病肾病,胃炎胃溃疡等疾病的治疗,化学成分研究显示其主要含有大黄酸、大黄素、芦荟大黄素、盐酸小檗碱、黄连碱、巴马汀、黄芩苷、黄芩素、汉黄芩素等成分。课... 详细信息

目的:三黄泻心汤作为经典方剂临床上常用于动脉粥样硬化,上呼吸道感染,糖尿病肾病,胃炎胃溃疡等疾病的治疗,化学成分研究显示其主要含有大黄酸、大黄素、芦荟大黄素、盐酸小檗碱、黄连碱、巴马汀、黄芩苷、黄芩素、汉黄芩素等成分。课题组前期研究炎症通路级联放大效应探索了大黄-黄芩“相使为用”增效的分子机制,建立了LPS诱导小鼠腹膜巨噬细胞Raw264.7炎症模型,以对LPS介导产生NO的抑制作用为评价指标,对黄连5个主要单体成分进行了活性筛选,针对抑制活性最佳的黄连碱对该模型中NF-κB、MAPK以及JAK/STAT炎症信号通路的激活进行了深入研究。然而,研究未涉及三黄泻心汤成分对NLRP3炎症小体通路的影响。Caspase-1作为NLRP3炎症小体的重要组成部分之一,通过体外构建caspase-1抑制剂筛选体系,再对三黄泻心汤主要单体成分进行目的性筛选,可为三黄泻心汤以及单体成分的临床使用提供理论依据。方法:(1)以caspase-1 c DNA为模板,分别以(BamH I-p20,p20-Sal I)、(BamH I-p10,p10-Sal I)以及(BamH I-p20,p10-Sal I)为上下游引物,进行PCR扩增后,使用限制性内切酶Sal I、BamHI分别消化扩增后的产物以及原核表达载体pColdI,采用T4连接酶将目的片段与原核载体连接成重组质粒,转化如宿主细胞并进行复制,利用载体自身具备的抗Amp抗生素基因,筛出重组质粒;(2)将构建好的重组质粒转入表达感受态细胞Trans BL21(DE3),利用异丙基硫代半乳糖苷(IPTG)在原核表达系统中诱导外源基因的表达。pCold I载体携带冷应激基因cspA启动子,能够在低温条件下表达,通过抑制其他蛋白质的表达来提高目的蛋白的产量。(3)亲和层析法纯化蛋白:pCold I载体携带6×His标签(His-tag),该标签能够与二价金属离子,如Ni、Co等螯合,通过亲和层析的方法对目标蛋白进行纯化。(4)构建caspase-1体外活性筛选体系,对三黄泻心汤主要单体成分小檗碱(Ber)、黄连碱(Cop)、表小檗碱(Epi)、巴马汀(Pal)、药根碱(Jatr)、大黄酸(Rhe)、大黄素(Emo)、芦荟大黄素(Alo)、大黄酚(Chry)、大黄素甲醚(Phy)、黄芩苷(Bae)、黄芩素(Bai)、汉黄芩素(Wogi)以及汉黄芩苷(Woga)进行抑制活性筛选,终浓度50μM;以VX-765(100nM)为阳性对照;(5)Raw264.7细胞接种于6孔板,密度达到80%换无血清培养基,黄连碱(1-30μM)作用2h后,LPS(1μg/mL)继续刺激24h,裂解细胞;SDS-PAGE上样检测,分别使用anti-tlr-4和anti-MyD88一抗检测各组蛋白表达;(6)Raw264.7细胞接种于6孔板中过夜培养,以Cop(1-30μM)、Ber 30μM预处理1h后加入Alexa Fluor 488 conjugated LPS孵育20min。使用4%多聚甲醛固定20min,tlr-4一抗于4℃条件下孵育2h,Alexa Fluor 545 conjugate二抗孵育1h,于激光共聚焦显微镜下观察。(7)THP-1细胞接种于24孔板中,100nM PMA诱导24h贴壁。用不含血清培养基换液,(1-30μM)Cop预处理1h后,分别采用IFN-γ(1000U)以及IFN-γ(1000U)+LPS(1μg/ml)继续刺激24h后,收集培养基上清,用于NO水平的检测。(8)SD大鼠脚底皮下注射角叉菜胶(carrageenan)建立足肿胀模型,使用足趾容积检测仪0-4h内检测黄连碱对carrageenan诱导的大鼠足肿胀以及体表温度升高的影响;收集大鼠肿胀部位皮下组织,冰面上匀浆,离心后得到匀浆液上清,采用Elisa法检测各组大鼠肿胀部位组织中细胞因子NO以及TNF-α的水平。结果:(1)PCR扩增产物通过1%琼脂糖凝胶电泳检测,在1000bp左右能看见明显的特异性条带;p20、p10、p10(D381E)、p20p10以及p20p10(D381E)与pCold I双酶切后,连接酶分别连接过夜并转化进DH5α感受态细胞,挑取5个单克隆进行酶切鉴定以及菌落的PCR鉴定,结合测序结果表明所筛选的菌落为阳性克隆;(2)考马斯亮蓝染色,结果表明IPTG诱导后,p20、p10以及p20p10蛋白大量表达,在25kDa、14.4kDa以及45kD左右有明显条带;(3)亲和层析法纯化以上蛋白后,在包含Ac-WEHD-AMC的体系中不具有剪切活性;将上述蛋白纯化前的裂解液上清加入体系中,结果显示p20p10与p20p10(D381E)裂解液上清具备剪切活性;(4)以上泻心汤单体成分中,Cop、Jatr以及Emod

关键词：黄连碱重组质粒 caspase-1 tlr-4通路 carrageenan

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