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棉花学报 2019年第5期31卷 381-393页

作者：张华崇张文蔚简桂良李蔚中国农业科学院植物保护研究所/植物病虫害生物学国家重点实验室北京100193 黄冈市农业科学院湖北黄冈438000

【目的】类甜蛋白(Thaumatin-like proteins,tlp)参与多种植物病原真菌侵染后的防御反应。本研究通过在全基因组分析tlp基因,为深入探究其在介导棉花抗黄萎病通路中的分子机理提供基础。【方法】分别利用生物信息学方法和荧光定量聚合... 详细信息

【目的】类甜蛋白(Thaumatin-like proteins,tlp)参与多种植物病原真菌侵染后的防御反应。本研究通过在全基因组分析tlp基因,为深入探究其在介导棉花抗黄萎病通路中的分子机理提供基础。【方法】分别利用生物信息学方法和荧光定量聚合酶链式反应技术对陆地棉中的tlp基因进行全基因组鉴定和响应棉花黄萎病菌侵染表达分析。【结果】共鉴定出88个tlp基因;通过系统发育分析和序列特征分析可将棉花tlp家族分为10类。tlp基因家族外显子数量介于1~5之间,内含子介于0~4之间,同组成员具有相似的基因结构。大部分tlp含有5个保守的motif,具有相同的基序组织模式,均为Motif 5_4_2_3_1。染色体定位显示87个tlp基因定位于陆地棉20条染色体上,其中A亚组和D亚组各分布有42和45个,其在染色体上的分布存在串联重复现象。响应病原菌侵染表达分析显示,黄萎病菌侵染可以诱导6个候选基因的表达,不同抗性品种相对表达量达到峰值的时间不同,且耐病品种(GZ-1)上述基因表达量比感病品种(86-1)有增高的趋势。【结论】该研究结果有助于了解棉花tlp基因家族的进化与功能。

关键词：陆地棉 tlp基因全基因组分析表达分析

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突变体模式下CmFADs/Cmtlp基因的耐寒功能研究

突变体模式下CmFADs/CmTLP基因的耐寒功能研究

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作者：于艳双吉林农业大学

学位级别：硕士

白屈菜(Chelidonium majus L.)为罂粟科(Papaveraceae)白屈菜属(Chelidonium L.)多年生草本植物,富含各类生物碱,具有明确的消炎止咳等药理活性。在植物生理学特性上,其具有极强耐寒、抗寒性,对耐寒抗寒研究及相关基因挖掘具有重要意义... 详细信息

白屈菜(Chelidonium majus L.)为罂粟科(Papaveraceae)白屈菜属(Chelidonium L.)多年生草本植物,富含各类生物碱,具有明确的消炎止咳等药理活性。在植物生理学特性上,其具有极强耐寒、抗寒性,对耐寒抗寒研究及相关基因挖掘具有重要意义和价值。本实验室前期构建了白屈菜低温胁迫应答转录组数据库,通过筛选发现脂肪酸去饱和酶基因(Fatty acid desaturase,FAD2、FAD3)与类甜蛋白基因(Thanmatin-like protein,tlp)在低温胁迫下显著上调表达,表现出与耐寒、抗寒高度相关的生理功能。本研究通过异源转化拟南芥构建了转基因突变体At Cmfad2、At Cmfad3及At Cmtlp,旨在基于模式植物背景下深入研究和阐明白屈菜FAD2、FAD3和tlp基因的功能,特别是在冷冻胁迫时的基因表达特性和耐寒功能。拟南芥(Arabidopsis thaliana,(Col).)为转基因受体,目的基因Cm FAD2、Cm FAD3、Cm tlp来源于白屈菜,以生态型野生型拟南芥(Wt)为对照,对At Cmfad2、At Cmfad3及At Cmtlp突变体(T3)植株进行低温冷冻胁迫下基因表达特性分析、生理学研究、基于转录组的突变体耐寒机理研究、基于目的基因定位突变体耐寒机制解析4个方面的研究,解析白屈菜中FAD2、FAD3及tlp基因耐寒、抗寒生理功能。研究取得以下结果:1.基于荧光定量PCR方法,对不同温度胁迫下的目的基因表达特性分析发现,与野生型Wt相比,At Cmfad2、At Cmfad3及At Cmtlp突变体植株在各温度点均显著表达,其中冷冻阶段变化最显著。2.检测不同温度胁迫下野生型Wt及At Cmfad2、At Cmfad3、At Cmtlp突变体植株各项生理指标发现,与野生型相比,各突变体植株的相对电导率、丙二醛(MDA)含量均在低温冷冻胁迫下逐渐升高,脱驯化胁迫下含量降低。NBT和DAB染色均在冷冻阶段染色面积加大,颜色加深,脱驯化阶段染色面积减少,颜色变浅。叶绿素a、叶绿素b及总叶绿素含量均在低温冷冻阶段逐渐降低,脱驯化阶段恢复正常。类胡萝卜素、可溶性糖(SS)与游离脯氨酸(Pro)及可溶性蛋白(SP)在冷冻阶段含量显著增加,脱驯化阶段恢复正常。超氧化物歧化酶(SOD)、过氧化物酶(POD)、过氧化氢酶(CAT)活性均在冷冻阶段活性最高,而谷胱甘肽过氧化物酶(GPX)、谷胱甘肽还原酶(GR)、多酚氧化酶(PPO)及抗坏血酸酶(APX)均在冷驯化阶段活性最高,脱驯化阶段活性降低。生长素(IAA)与脱落酸(ABA)在冷冻阶段含量最高,脱驯化阶段恢复正常,赤霉素(GA)随着温度降低含量逐渐减少,在冷冻阶段达到最低值,脱驯化阶段含量增加。可以看出Wt、At Cmtlp、At Cmfad2及At Cmfad3在低温、冷冻阶段的生理激素显著表达,且低温冷冻阶段生理及激素响应为At Cmtlp、At Cmfads>Wt,At Cmtlp>At Cmfads。3.对Wt、At Cmtlp在20℃、4℃及-40℃下处理的植株幼苗进行转录组测序发现,与Wt相比,At Cmtlp在各温度点的差异表达基因显著增加,且在冷冻阶段差异表达基因最多,表达变化率最大。GO富集分析显示差异基因主要富集到光合作用过程,对寒冷的反应,多糖代谢过程等,KEGG富集通路显示主要富集到植物激素信号转导、昼夜节律、淀粉和蔗糖代谢等过程。对低温冷冻阶段的差异表达基因筛选发现,显著上调的为信号转导、光合作用、植物激素、抗寒相关酶及蛋白、糖代谢相关通路,与前文生理及激素指标测定结果相符合。4.通过染色体步移方法检测突变体At Cmtlp、At Cmfad2及At Cmfad3中目的基因插入位点,结果发现,At Cmtlp插入到3个位点,与tlp原位点存在显著差异,插入位点分别为FKBP样蛋白、TBF相关因子13及肌凝蛋白结合蛋白;上游调控基因为GT2,F-box及DUF1685蛋白;下游调控基因为RING/U-box,α同种型诱导蛋白6及MYB60。At Cmfad2插入到1个位点,与FAD2原位点存在显著差异,插入位点为组氨酸激酶成员;上游调控基因为RING/U-box;下游调控基因为SCP1。At Cmfad3定位到2个位点,与FAD3原位点存在显著差异,定位位点分别为CDF5,ATMFP2;上游调控基因为MYB结构域蛋白,DIN3蛋白;下游调控基因为类同源结构域蛋白,富含氨基酸的家族蛋白。以上基因发现广泛参与并调控了植株的抗寒能力、生理激素的应答、形态发育、生命周期延长。由此可见At Cmtlp、At Cmfad2及At Cmfad3植株具有极强的抗寒能力以及显著的形态差异和生命周期特性与插

关键词：白屈菜 FADs基因 tlp基因生理功能分子机制

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山核桃Cctlp家族鉴定及其在病原菌响应中的功能初探

山核桃CcTLP家族鉴定及其在病原菌响应中的功能初探

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作者：李佩佩浙江农林大学

学位级别：硕士

山核桃(Carya cathayensis Sarg.)营养物质丰富,已成为林农的主要收入来源,但在生产过程中出现干腐病、根腐病等病害。类甜蛋白(Taumatin-like proteins,tlps)是参与植物病原菌防御过程的重要蛋白,但在山核桃中发挥何种功能尚未可知。... 详细信息

山核桃(Carya cathayensis Sarg.)营养物质丰富,已成为林农的主要收入来源,但在生产过程中出现干腐病、根腐病等病害。类甜蛋白(Taumatin-like proteins,tlps)是参与植物病原菌防御过程的重要蛋白,但在山核桃中发挥何种功能尚未可知。本文结合多种手段对该基因家族的功能进行了研究。主要研究结果如下:(1)山核桃Cctlp家族含有40条基因,系统发育分析显示这些基因分为3类。该家族大部分基因编码的蛋白含有8个稳定的二硫键,G-X-[GF]-X-C-X-T-[GA]-D-C-X(1,2)-G-X-(2,3)-C的保守序列和REDDD的完整结构。(2)进化树分析发现与拟南芥三个类甜蛋白基因同源性较高的山核桃基因有9个。外源激素处理山核桃幼苗叶片,通过qRT-PCR,发现这9个山核桃基因中在SA处理后上调,而对外源MeJA/ETH处理响应较不一致,上调趋势不显著。(3)茶藨子葡萄座腔菌(Botryosphaeria dothidea)接种山核桃茎后,接种部位出现明显的黑色病斑,9个Cctlp基因中的7个Cctlp基因的表达量显著上调。接种7天后,植物体内的JA和H2JA的含量显著升高,而JA-Phe,SA与SAG的含量显著下降。SA相关基因的表达量于早期被诱导上调,而JA相关基因表达模式不同,JA负调控因子JAZ基因的表达量在接种后7天为最小值。(4)烟草亚细胞定位分析显示大部分Cctlp蛋白定位于细胞膜与细胞质上。(5)Cctlp30异源表达拟南芥株系对丁香假单胞菌pst DC3000与***的抗性显著增强,然而对灰霉菌(Botrytis cinerea)的抗性显著降低。同时,过表达株系接种病原菌后,体内ROS积累水平也显著提高。综上所述,山核桃tlp家族含有40个成员,其中9个Cctlp基因对激素SA,JA,ETH和病原菌***有不同的响应。***接种山核桃,在早期可能通过SA信号调控Cctlp的表达介导其抗病性,而在后期通过JA。ROS可能在过表达Cctlp30植株响应病原菌时发挥作用。此研究对山核桃Cctlps家族成员的抗病功能进行了初步探究,为今后山核桃分子育种改良提供指导。

关键词：山核桃茶藨子葡萄座腔菌 tlp基因激素亚细胞定位

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