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tlc-紫外分光光度法定量检测紫杉醇

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生物技术 2001年第1期11卷 45-47页

作者：庄晓蕾于树宏王人为王刚河北师范大学生命科学学院河北石家庄050016

采用ＴＬＣ法进行了红豆杉培养细胞中紫杉醇的分离、纯化。展层剂为甲醇－氯仿（１：１２）时，分离出与紫杉醇标准品Ｒｆ值相同的色斑。同时，结合紫外分光光度法进行紫杉醇的定量检测，其平均回收率为ＨＰＬＣ法的９１.８Ｚ％。

关键词：紫杉醇 tlc 紫外吸收 tlc-紫外分光光度法定量检测

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东北红豆杉细胞培养高效提取紫杉醇技术体系研究

东北红豆杉细胞培养高效提取紫杉醇技术体系研究

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作者：赵晶吉林大学

学位级别：硕士

红豆杉中的抗癌活性成分紫杉醇能够有效抑制肿瘤细胞的增生和繁殖,对多种癌症的防治具有显著疗效,被世人誉为“植物黄金”。但红豆杉生长缓慢,且紫杉醇含量极低,无法满足日益增长的市场需求,由于东北红豆杉是国家的一级保护植物,当务之... 详细信息

红豆杉中的抗癌活性成分紫杉醇能够有效抑制肿瘤细胞的增生和繁殖,对多种癌症的防治具有显著疗效,被世人誉为“植物黄金”。但红豆杉生长缓慢,且紫杉醇含量极低,无法满足日益增长的市场需求,由于东北红豆杉是国家的一级保护植物,当务之急就是在保护红豆杉资源的前提下,利用现代科技手段通过不同途径获得紫杉醇。细胞培养生产紫杉醇的方法具有诸多优势,使其越来越受到研究人员的青睐。经文献调研显示,国内外有相关报道,但大多数都是对基础理论的研究,对高效获取紫杉醇的应用技术研究报道偏少,尤其是趋于产业化的技术体系的构建至今仍是空白。因此,本文以东北红豆杉为原料,通过检测技术的优化、愈伤组织诱导、高产细胞株系筛选,建立细胞悬浮体系,并通过添加代谢调节因子提高细胞悬浮体系中的紫杉醇产量,初步构建“东北红豆杉细胞悬浮培养高效获取紫杉醇的技术体系”。为东北红豆杉生产紫杉醇的规模化、商业化、产业化奠定了良好的基础,对于长白山野生资源药用植物的合理开发与高效利用提供了技术支持,具有重要的现实意义与深远的社会影响。本文获得的研究结论如下： 1.通过单因素试验与Box-Behnken试验设计对东北红豆杉中紫杉醇的超声波提取及其快速分离检测的研究表明：单因素试验的最佳提取溶剂为乙醇-二氯甲烷(1：1),料液比为1：50,超声时间为1h,超声功率为200W;tlc-紫外分光光度法分离检测紫杉醇的修正系数K为0.009152;多因素试验以液料比(X1)、超声时间(X2)、超声功率(X3)为自变量,紫杉醇提取量为因变量进行响应曲面分析,得到回归方程为：Y=127.78+3.86X1+6.06X2+1.65X3-3.68X12-8.23X22-5.95X32+0.57X1X2+2.05X1X3+1.80X2X3 最佳提取工艺为料液比1：53.23mL/g,超声时间1.11h,超声功率207.88W,此时的紫杉醇提取量为130.576μg/g。 2.东北红豆杉愈伤组织诱导和继代培养的研究表明：以东北红豆杉幼茎为外植体,添加NAA2mg/L+6-BA0.5mg/L的改良B5培养基诱导愈伤组织效果最佳：11天即出现愈伤组织,诱导率达到94.9%,鲜重增殖倍数为1.13;将愈伤组织附着于外植体上直接继代比剥离后单独继代的效果好,直接继代愈伤组织增殖多,褐化程度轻;使用7.5mg/L柠檬酸作为抗褐化剂可使继代的愈伤组织增殖2.36倍,并且消除褐化现象;连续继代8-9次可使愈伤组织鲜重增殖及紫杉醇含量达到稳定(最高值),继代8次后,愈伤组织鲜重增殖3.83倍,紫杉醇含量为227μg/g,比从植物中直接提取提高了73.85%。 3.东北红豆杉高产细胞株系培育方法的筛选试验研究表明：条件培养和看护培养均可实现在较低的细胞密度下获得较高的植板率,根据细胞克隆的生长情况及适当的植板率,确定细胞浓度为3×102个/mL效果最好;悬浮培养12d的细胞作为克隆材料时,出现细胞克隆的时间最短,16d的细胞作为克隆材料时,植板率最高;稳定性试验分析结果显示,继代细胞系的增长率在固体培养基上比液体培养基中稳定,但紫杉醇含量均存在一定波动。 4.东北红豆杉细胞悬浮培养高效诱导的试验研究表明：东北红豆杉悬浮细胞生长曲线呈“S”型,细胞鲜重在第24天时达到最大,为54.5g/L;通过添加7种调节因子进行细胞诱导,茉莉酸甲酯、水杨酸、苯丙氨酸及赤霉素对东北红豆杉悬浮细胞生长及产紫杉醇的影响较为明显;以该四种调节因子的浓度为自变量,悬浮细胞收获时细胞内紫杉醇总产量为因变量,进行二次通用旋转组合试验设计,得到回归方程(经α=0.10显著水平剔除不显著项)为： Y=4.32000-0.12000X1+0.06667X2+0.10000X3-0.03333X4-0.40667X12-0.32167X22-0.22167X32-0.57667X42+0.02500X1X3+0.01500X2X4 代谢调节因子浓度的最佳组合为：茉莉酸甲酯100μmol/L,水杨酸20mg/L,苯丙氨酸400mg/L,赤霉素2mg/L,此时,细胞内紫杉醇总产量高达4.32mg/L 悬浮细胞生长第7天加入调节因子得到的细胞内外紫杉醇总产量最高,为4.855mg/L,紫杉醇释放率为10.48%;红豆杉悬浮细胞生长体系中小剂量连续添加调节因子比一次性大剂量添加效果好,细胞鲜重和紫杉醇总产量分别提高6.08%和11.57%;悬浮细胞生长体系中,紫杉醇的合成代谢滞后于细胞的生长。

关键词：东北红豆杉紫杉醇 tlc-紫外分光光度法细胞培养高效提取诱导体系

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