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中国动脉硬化杂志 2007年第7期15卷 567-567页

作者：曾颖谭玉林易光辉冯惊涛孙琳曾德星夏军辉王静尹小波南华大学心血管疾病研究所湖南省衡阳市421001

目的观察阿托伐他汀对氧化型低密度脂蛋白诱导的thp1巨噬细胞脂质蓄积及CD36表达的影响。方法用50mg/L氧化型低密度脂蛋白与不同浓度(0/μmol/L、0.312μmol/L、1.25μmol/L和5μmol-L)的阿托伐他汀共同孵育24h,空白组作为对照,用液体... 详细信息

目的观察阿托伐他汀对氧化型低密度脂蛋白诱导的thp1巨噬细胞脂质蓄积及CD36表达的影响。方法用50mg/L氧化型低密度脂蛋白与不同浓度(0/μmol/L、0.312μmol/L、1.25μmol/L和5μmol-L)的阿托伐他汀共同孵育24h,空白组作为对照,用液体闪烁计数法检测细胞[3H]胆固醇流入情况,油红O染色观察细胞内脂质蓄积情况,高效液相色谱分析法检测细胞内总胆固醇水平,逆转录聚合酶链反应与Westem blotting分别检测thp1巨噬细胞CD36 mRNA与蛋白质的表达。[第一段]

关键词：病理学与病理生理学动脉粥样硬化 thp1巨噬细胞阿托伐他汀 B类清道夫受体CD36 氧化型低密度脂蛋白脂质蓄积

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ox-LDL通过PKA/PKC途径上调PHF2促进thp-1巨噬细胞炎症反应

ox-LDL通过PKA/PKC途径上调PHF2促进THP-1巨噬细胞炎症反应

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作者：李永朝南华大学

学位级别：硕士

目的:本实验通过培养thp-1巨噬细胞,探讨蛋白激酶(protein kinase,PK)/PHF2途径在ox-LDL诱导thp-1巨噬细胞的炎症反应过程中的作用,从而进一步明确动脉粥样硬化(Atherosclerosis,As)的发生机制。方法:利用ox-LDL处理thp-1巨噬细胞,采用... 详细信息

目的:本实验通过培养thp-1巨噬细胞,探讨蛋白激酶(protein kinase,PK)/PHF2途径在ox-LDL诱导thp-1巨噬细胞的炎症反应过程中的作用,从而进一步明确动脉粥样硬化(Atherosclerosis,As)的发生机制。方法:利用ox-LDL处理thp-1巨噬细胞,采用RNA干扰和特异性抑制剂,Western blotting和PCR检测PKA、PKC、PHF2、TNF-α、CXCL4、CXCL10的表达和活性变化。结果:*** Blotting结果显示ox-LDL可呈浓度依赖性上调thp1巨噬细胞中PKA、PKC蛋白的表达水平(pthp-1巨噬细胞TNF-α、CXCL4、CXCL10等炎症因子表达。

关键词： thp1巨噬细胞炎症血浆低密度脂蛋白蛋白激酶途径植物同源结构域指蛋白2

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CILP2诱导thp1源性泡沫细胞形成

CILP2诱导THP1源性泡沫细胞形成

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作者：冉文侠重庆医科大学

学位级别：硕士

第一部分人CILP2基因真核表达载体的构建和鉴定目的：构建人pIRES2-EGFP-CILP2-Flag质粒方法：提取HEK293细胞mRNA，逆转录成模板DNA,高保真酶PCR获取CILP2-Flag基因片段，经BglII和EcoRI双酶切，连接重组至pIRES2-EGFP空载质粒上。双... 详细信息

第一部分人CILP2基因真核表达载体的构建和鉴定目的：构建人pIRES2-EGFP-CILP2-Flag质粒方法：提取HEK293细胞mRNA，逆转录成模板DNA,高保真酶PCR获取CILP2-Flag基因片段，经BglII和EcoRI双酶切，连接重组至pIRES2-EGFP空载质粒上。双酶切和基因测序鉴定质粒构建效果。结果：BglII和EcoRI双酶切重组质粒，经琼脂糖凝胶电泳，在约3.5kb和5.3kb处出现条带，初步鉴定重组质粒构建成功。测序结果经NCBI blast对比分析，核酸序列与GenBank中CILP2CDS区序列同源性完全一致，且C端正确带上Flag片段。结论：成功构建pIRES2-EGFP-CILP2-Flag标签质粒，为后续实验奠定了良好的实验基础。第二部分cilp2基因在小鼠体内表达分布和不同病理模型中的表达差异目的：检测cilp2基因在正常C57BL/6J小鼠体内的mRNA表达分布，以及在ApoE-/-小鼠和冠心病人中的mRNA和蛋白表达差异。方法：取普食喂养C57BL/6J12周龄雄性小鼠3只脱颈处死，留取心，肝，脾，胃，肌肉，脑，肾，肺组织，提取mRNA,逆转录成cDNA, RT-PCR测定cilp2表达分布;取C57BL/6J和ApoE-/-12周龄雄性小鼠，取主动脉和冠状动脉组织，提取mRNA和蛋白，分别用RT-PCR和western blot方法检测cilp2表达;取冠心病人和正常人骨骼肌组织，提取mRNA和蛋白， RT-PCR和western blot方法检测CILP2表达差异;重复实验3次。结果：cilp2在小鼠肌肉中表达较高，其后依次是心脏、大脑、肾脏、肺、胃、脾、肝脏和小肠;ApoE-/-小鼠肌肉、主动脉和冠状动脉组织cilp2含量较C57BL/6J小鼠明显增高;冠心病人骨骼肌中CILP2表达较正常人明显增高。结论：cilp2在动脉粥样硬化疾病模型中表达显著升高，可能在动脉粥样硬化形成过程中产生影响。第三部分CILP2分泌蛋白的验证目的：验证CILP2为分泌蛋白。方法：分别用pIRES2-CILP2-Flag质粒和pIRES2-EGFP空载质粒转染HEK293T细胞48h，提取胞内蛋白和上清培养液。用anti-Flag M2亲和磁珠免疫沉淀蛋白，western blot检测目的蛋白。各取三人300ul血浆，PBS稀释30倍，10%SDS-PAGE凝胶做western blot检测人血浆中CILP2含量，以及正常人和冠心病人血浆中CILP2表达差异。结果：转染CILP2-Flag质粒的细胞上清中含有CILP2蛋白;人血浆中含有CILP2蛋白;冠心病人血浆中CILP2蛋白含量显著高于正常人。结论：CILP2是一种分泌蛋白，在冠心病人血浆中含量高于正常人。第四部分CILP2对thp1源性泡沫细胞形成的作用目的：探讨CILP2对泡沫细胞形成的影响和可能机制。方法：oxLDL作用于thp1巨噬细胞，RT-PCR检测细胞内CILP2mRNA随oxLDL作用时间和剂量的变化;将CILP2腺病毒感染thp1巨噬细胞48h，RT-PCR方法检测清道夫受体(SR-AI，CD36，CD68，LOX-1)，TF，PAI-1mRNA的表达变化;在oxLDL存在下，感染CILP2腺病毒，油红O检测thp1巨噬细胞甘油三酯聚集情况。结果：thp1巨噬细胞内CILP2mRNA表达随oxLDL作用剂量和时间增加而增加，分别在20ug/ml和24h表达量达到最高;感染CILP2腺病毒48h后,细胞内CILP2mRNA和蛋白水平显著升高(p 1、TF和PAI-1mRNA改变没有显著差异;油红O染色显示，在oxLDL存在下，感染CILP2腺病毒细胞内脂质聚集明显增高(pthp1巨噬细胞对脂质摄取，形成泡沫细胞。

关键词： CILP2 真核载体构建质粒构建 cilp2 ApoE-/- 动脉粥样硬化 RT-PCR 分泌蛋白冠心病免疫沉淀动脉粥样硬化 thp1巨噬细胞 oxLDL CILP2 清道夫受体

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