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壮骨健膝方对巨噬细胞极化的影响及作用机制研究

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世界中医药 2024年第13期19卷 1959-1965页

作者：张鹏郭洁梅肖艳陈鹏张英杰刘俊陈雨邱梦婷苏友新福建中医药大学中医学院福州350122 福建中医药大学康复学院福州350122

目的:探讨壮骨健膝方对巨噬细胞经典活化型(M1)/替代活化型(M2)极化的影响及作用机制。方法:佛波酯诱导人单核白血病细胞分化为非活化巨噬细胞(M0),脂多糖刺激M0复制M1极化模型,将细胞分为空白组(M0+空白血清)、模型组(M1+空白血清)、... 详细信息

目的:探讨壮骨健膝方对巨噬细胞经典活化型(M1)/替代活化型(M2)极化的影响及作用机制。方法:佛波酯诱导人单核白血病细胞分化为非活化巨噬细胞(M0),脂多糖刺激M0复制M1极化模型,将细胞分为空白组(M0+空白血清)、模型组(M1+空白血清)、抑制剂组(M1+NF-κB抑制剂+空白血清)、壮骨健膝方组(M1+含药血清)。干预24 h后,检测各组M1标志分子诱导型一氧化氮合酶(iNOS)、主要组织相容性复合体Ⅱ(MHC-Ⅱ)、单核细胞趋化蛋白1(MCP-1),M2标志分子分化簇206、163、209(CD206、163、209)mRNA表达,炎症介质白细胞介素1β(IL-1β)、肿瘤坏死因子α(TNF-α),抗炎因子IL-4、IL-10水平及mRNA表达,核因子κB(NF-κB)信号通路中节点蛋白核内NF-κBp65、NF-κBp50及NF-κB抑制蛋白α(IκBα)表达。结果:模型组M1标志分子、炎症介质及NF-κBp65、NF-κBp50蛋白均高于空白组(P巨噬细胞M1极化,促进M2极化,其机制可能与降低细胞中NF-κB信号通路活性有关。

关键词：壮骨健膝方含药血清膝骨关节炎巨噬细胞极化 M1/M2型巨噬细胞滑膜炎 thp-1源巨噬细胞

金黄色葡萄球菌胞内感染巨噬细胞模型的建立和环状RNA表达谱的差异分析

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金黄色葡萄球菌胞内感染巨噬细胞模型的建立和环状RNA表达谱的差...

作者：王曦苏州大学

学位级别：硕士

目的:金黄色葡萄球菌是导致人类多种感染的临床常见病原菌,长期以来被认为是胞外病原菌,但越来越多的研究证实其可以在多种细胞内生存,是典型的兼性胞内寄生菌,但金黄色葡萄球菌的相关胞内生存机制尚不清楚。环状RNA(circRNA)是近年来... 详细信息

目的:金黄色葡萄球菌是导致人类多种感染的临床常见病原菌,长期以来被认为是胞外病原菌,但越来越多的研究证实其可以在多种细胞内生存,是典型的兼性胞内寄生菌,但金黄色葡萄球菌的相关胞内生存机制尚不清楚。环状RNA(circRNA)是近年来新发现的一种具有调节功能的RNA,其参与了多种生物学功能,但其在金黄色葡萄球菌致病过程中的作用机制鲜有报道。与此同时,临床上作为诊断金标准的传统病原菌培养鉴定技术,由于其费时耗力,诊断效能较低,因而无法满足临床所需的快速诊断需求,故急需探寻能快速诊断金黄色葡萄球菌感染的新型诊断标志物。本文旨在建立金黄色葡萄球菌胞内感染人巨噬细胞的感染模型,分析巨噬细胞经金黄色葡萄球菌胞内感染后其环状RNA表达谱的差异,对差异表达的circRNA进行GO和KEGG功能分析,通过生物信息学技术构建circRNA-miRNA-靶基因的调控通路,并初步探讨差异表达的circRNA在金黄色葡萄球菌胞内感染巨噬细胞中的作用机制,为探寻有望用于金黄色葡萄球菌感染性疾病快速分子诊断的circRNA标记物提供强有力的实验依据。方法:(1)金黄色葡萄球菌胞内感染人巨噬细胞实验。thp-1源巨噬细胞置于含10%胎牛血清的RPMI1640培养基中,37℃、5%CO2培养箱中培养,用25ng/ml浓度的PMA作用72h诱导thp-1源巨噬细胞贴壁成为巨噬细胞。挑取金黄色葡萄球菌单菌落于20 ml LB液体培养基中,37℃、250 rpm培养过夜,将菌液按1:100的比例转移到20 ml LB培养基中,250 rpm,37℃振荡至OD600为0.6,然后以10:1,20:1,30:1和40:1四个不同感染指数分别感染巨噬细胞细胞,同时设置不加菌的对照组,细菌感染2小时后,用庆大霉素杀死胞外菌,使胞内菌与细胞作用不同的时间(12h、24h、36h),通过显微镜观察细胞形态、检测细胞培养上清中的细胞因子、流式细胞术检测细胞存活率等一系列实验,以确定金黄色葡萄球菌胞内感染人巨噬细胞合适的感染指数和感染时间,建立用于后续表达谱分析的感染模型。(2)金黄色葡萄球菌胞内感染后的巨噬细胞circRNA表达谱分析。根据上述建立的金黄色葡萄球菌胞内感染人巨噬细胞模型,进行三次生物学重复,收集巨噬细胞,通过 NEBNext? Ultra? Ⅱ Directional RNA Library Prep Kit 构建测序文库,使用BioAnalyzer 2100 system对文库进行质控和定量,并采用Illumina NovaSeq6000仪器进行150bp双端测序,完成全转录组测序分析。根据测序结果分析人巨噬细胞经金黄色葡萄球菌胞内感染后circRNA表达谱的特征,然后以表达量差异两倍为界筛选金黄色葡萄球菌胞内感染后的巨噬细胞差异表达的circRNA,并随机选取其中4个差异表达的circRNA进行RT-qPCR验证,以检验上述转录组的测序结果。(3)差异表达的circRNA在金黄色葡萄球菌感染胞内感染人巨噬细胞中的作用机制初探。通过生物信息学分析,对上述差异表达的circRNA进行GO和KEGG通路分析,对其进行注释和功能推测,结合差异表达的蛋白编码的靶基因,利用Cytoscape等工具构建可能的circRNA—miRNA—靶基因的海绵机制调控通路,重点选择其中一条通路 hsairc016408—hsa-miR-421—AURKA,利用 RT-qPCR 方法调查金黄色葡萄球菌胞内感染巨噬细胞后hsa-miR-421和AURKA的表达变化,以进一步验证上述经生物信息学技术分析构建的调控通路,并初步探讨hsairc016408—hsa-miR-421—AURKA调控通路的海绵机制及其在金黄色葡萄球菌胞内感染巨噬细胞中的作用。结果:(1)金黄色葡萄球菌胞内感染人巨噬细胞实验模型的建立。分别用侵袭指数为10:1,20:1,30:1和40:1的金黄色葡萄球菌进行胞内感染巨噬细胞,发现侵袭指数在20:1的情况下细胞状态最佳,仅观察到少量细胞裂解,但大部分细胞形态完整,同时培养基中仅出现少量游离的细菌。在侵袭指数为10:1的情况下,由于细菌较少,尚有巨噬细胞未被细菌感染,而在30:1和40:1的侵袭指数下,在培养基中出现大量游离的细菌,且细胞状态也欠佳。用20:1的金黄色葡萄球菌与巨噬细胞共孵育不同时间后,细胞因子检测结果显示被细菌胞内感染的巨噬细胞上清液中TNF、IL-6的含量较之对照组明显增高(P细胞因子(IL-17,IFN,IL-10,IL-4,IL-2)的分泌与共孵育时间无显著相关性(P>0.05)。显微镜观察发现细菌侵袭细胞12h和24h后,大部分细胞形态正常且完整,但在细菌侵袭细胞36h后,镜下可见大量细

关键词： circRNA 金黄色葡萄球菌胞内感染 thp-1源巨噬细胞高通量测序细胞功能 ce-RNA网络

重组人B型利钠肽抑制氧化低密度脂蛋白诱导的巨噬细胞氧化应激及炎症反应

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中国心血管杂志 2018年第6期23卷 490-494页

作者：孟利民杨华信栓力刘吉祥赵秀峰刘丽军杨瑞波常超邯郸市第一医院心内一科 056002

目的探讨重组人B型利钠肽(rh BNP)对氧化低密度脂蛋白(ox-LDL)诱导的巨噬细胞氧化应激和炎症反应的抑制作用。方法建立ox-LDL干预thp-1源巨噬细胞的模型,分为3组:对照组、100μg/ml ox-LDL组和100μg/ml ox-LDL+10-9mol/L rh BNP组。收... 详细信息

目的探讨重组人B型利钠肽(rh BNP)对氧化低密度脂蛋白(ox-LDL)诱导的巨噬细胞氧化应激和炎症反应的抑制作用。方法建立ox-LDL干预thp-1源巨噬细胞的模型,分为3组:对照组、100μg/ml ox-LDL组和100μg/ml ox-LDL+10-9mol/L rh BNP组。收集各组细胞,应用共聚焦显微镜测定细胞内活性氧(ROS)水平,采用逆转录聚合酶链反应法(RT-PCR)及生物化学法分别检测超氧化物歧化酶(SOD)和丙二醛(MDA)基因的表达及活性,采用酶联免疫吸附法检测白细胞介素37(IL-37)的水平。结果与对照组相比,100μg/ml ox-LDL组的ROS水平升高(527. 30%±36. 20%比100. 00%±0. 00%),SOD mRNA的表达和活性降低[0. 53±0. 18比1. 00±0. 00;(256. 60±8. 20) U/ml比(355. 80±9. 58) U/ml],MDA mRNA的表达和含量升高[1. 59±0. 23比1. 00±0. 00;(29. 40±1. 68) nmol/ml比(5. 94±0. 51) nmol/ml],IL-37水平降低[(48. 05±3. 01) ng/L比(57. 82±2. 26) ng/L](均为P thp-1源巨噬细胞的氧化应激及炎症反应。

关键词：重组人B型利钠肽 thp-1源巨噬细胞氧化低密度脂蛋白超氧化物歧化酶丙二醛白细胞介素37

LncRNA-PVT1在巨噬细胞炎症反应中的表达及与炎症基因相关性研究

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岭南急诊医学杂志 2019年第1期24卷 6-9页

作者：郑胜才廖文华邹子俊曾可静周明根郑煜凯何志捷中山大学孙逸仙纪念医院重症医学科 510120

目的:研究长链非编码RNA(LncRNA)PVT1在LPS诱导thp-1源巨噬细胞炎症反应中的表达及其与炎症基因表达相关性,推测lncRNA-PVT1在脓毒症急性肺损伤炎症反应中的可能作用。方法:通过LPS刺激thp-1源巨噬细胞产生炎症反应造模,利用RT-qPCR检测... 详细信息

目的:研究长链非编码RNA(LncRNA)PVT1在LPS诱导thp-1源巨噬细胞炎症反应中的表达及其与炎症基因表达相关性,推测lncRNA-PVT1在脓毒症急性肺损伤炎症反应中的可能作用。方法:通过LPS刺激thp-1源巨噬细胞产生炎症反应造模,利用RT-qPCR检测,比较不同刺激浓度(0、0.5、5.0μg/ml,8 h)下各组细胞中lncRNA-PVT1及TNF-α、IL-1βmRNA表达情况。结果:与对照组相比,IL-1β及TNF-αmRNA在LPS不同刺激浓度下,均表达上调,且具有统计学差异(均P1β及TNF-αmRNA表达量上升,呈浓度依赖,在LPS 5.0μg/ml作用8 h下,IL-1β及TNF-αmRNA表达量达峰值。与对照组相比,在5.0μg/ml LPS组中ln-cRNA-PVT1表达明显上调,具有统计学差异(P1)。相关性分析发现5μg/ml LPS刺激8 h后,thp-1源巨噬细胞中lncRNA-PVT1相对表达量分别与IL-1β及TNF-αmRNA相对表达水平呈正相关(分别为R^2134,P=0.0125;R^215)。结论:LncRNA-PVT1在LPS致thp-1源巨噬细胞炎症反应中高表达,且与TNF-α及IL-1βmRNA表达呈正相关,提示该lncRNA-PVT1在脓毒症急性肺损伤炎症反应中可能起重要作用。

关键词：急性肺损伤脓毒症长链非编码RNA PVT1 thp-1源巨噬细胞