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ETS家族转录因子GABPA通过调节管腔-基底分化抑制膀胱癌恶性表型的机制研究

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ETS家族转录因子GABPA通过调节管腔-基底分化抑制膀胱癌恶性表型...

作者：代明锴山东大学

学位级别：硕士

端粒酶逆转录酶（tert）是端粒酶（Telomerase）的核心成分,tert具有激活端粒酶活性的作用,可以使已分化的细胞向着持续分裂的肿瘤细胞转变,所以在人体内正常细胞中的tert活性受到严格的控制,但在膀胱癌和脑胶质瘤等多种恶性肿瘤细胞中... 详细信息

端粒酶逆转录酶（tert）是端粒酶（Telomerase）的核心成分,tert具有激活端粒酶活性的作用,可以使已分化的细胞向着持续分裂的肿瘤细胞转变,所以在人体内正常细胞中的tert活性受到严格的控制,但在膀胱癌和脑胶质瘤等多种恶性肿瘤细胞中都发现了 tert突变的启动子,而ETS家族转录因子GABPA及其伴侣GABPB1可以协同激活这些肿瘤细胞中突变的tert启动子的活性从而导致细胞中端粒酶的活性增强。已有研究证明下调肿瘤细胞中GABPA/GABPB1复合物的含量可以抑制端粒酶的活性,从而消除胶质细胞瘤细胞的恶性潜能。所以GABPA/B1被认为是一个肿瘤治疗的靶点。然而在膀胱癌的发病机制中GABPA所扮演的角色尚不明确。我们在研究初期认为GABPA在膀胱癌中同样扮演一个致瘤因子的角色,然而通过进一步的研究我们却意外地发现膀胱癌细胞中GABPA表达下降虽然会抑制tert的表达,但同时会显著增强膀胱癌细胞的增殖、侵袭、干细胞特性以及对抗肿瘤药物顺铂的耐药性,而当其表达增高时则出现相反的结果。并且在裸鼠膀胱癌异种移植模型中,过表达GABPA的膀胱肿瘤细胞在小鼠体内的转移侵袭能力明显被抑制。通过进一步研究,我们发现GABPA会直接激活驱动尿路上皮细胞进行管腔分化的关键转录因子FoxA1和GATA3的转录活性,这一点提示GABPA可能与膀胱癌管腔分化相关。通过分析TCGA/GEO数据库中的临床病例信息,我们发现管腔亚型膀胱癌中GABPA表达显著高于基底亚型膀胱癌,并且结合TCGA数据库中的病例信息和我们自己收集的膀胱癌患者资料分析,可以看出当膀胱癌患者体内GABPA基因的表达量较低时,其生存期显著缩短。所以,尽管GABPA可以促进tert的表达,从而有可能诱导癌症的发生,但是GABPA通过调控膀胱癌细胞管腔分化的特征基因FoxA1和GATA3的表达,可以促进细胞的管腔性分化从而抑制膀胱癌向侵袭性程度和增殖能力更强的基底亚型发展。所以我们认为GABPA在膀胱癌中起着抑癌作用。研究目的:通过调控GABPA在膀胱癌细胞中的表达,从而研究其对tert活性的调节作用以及观察GABPA在膀胱癌细胞中是否可以通过刺激FoxA1和GATA3的转录表达从而促进膀胱癌的管腔分化,同时通过干预膀胱癌细胞中GABPA的表达,从而观察GABPA对膀癌细胞的增殖、侵袭、干细胞特性、以及其对顺铂耐药性的影响。通过研究GABPA在分子生物学层面对膀胱癌的发生和发展过程中的具体作用,可为膀胱癌的诊断和治疗提供新的靶标。研究方法:（1）通过分析TCGA和GEO数据库中的病例资料,我们比较了膀胱癌患者中不同的病理类型（管腔亚型和基底亚型）中的GABPA与tert、以及GABPA与FoxA1/GATA3的mRNA的表达的相关性。（2）将2006年至2016年在山东大学第二医院接受手术的112名膀胱癌患者纳入研究。并用免疫组织化学技术检测膀胱癌病理样本的石蜡切块中GABPA和FoxA1表达含量,以及GABPA和FoxA1表达相关性。（3）通过培育三种膀胱癌细胞（J82、SW1710、HT1197）从而建立比较全面的细胞层面的样本,并且在这些细胞系中通过转染GABPA siRNA或者GABPA过表达质粒从而敲降或者上调GABPA在这些细胞中的表达,48h后提取细胞中的RNA、72h后提取细胞内的总蛋白,并且通过实时定量PCR技术以及western-blot技术检测敲降或者过表达的效果,然后再用RT-PCR技术以及蛋白印迹技术检测上述干预之后的这些细胞中的tert的mRNA的水平的变化以及FoxA1/GATA3的mRNA和蛋白水平的变化,并通过ChIP验证GABPA对FoxA1和GATA3的转录是否存在激活作用。同时用BrdU、细胞流式、Trans-well、顺铂耐药等实验检测调节GABPA表达之后的膀胱癌细胞的增殖、侵袭特性和顺铂耐药性的变化。（4）通过将稳定过表达GABPA的J82细胞（J82/GABPA）和空载体对照细胞（J82/control）经尾静脉注射至6周龄的雄性BALB/c裸鼠体内,并在10周之后处死小鼠,收集小鼠的肝脏、肺脏等器官,并用BOUIN’S固定液处理,通过HE染色,以及免疫组织化学技术检测切片中ki67的表达评估肿瘤在小鼠体内侵袭、转移情况,从而判断GABPA在活体内对膀胱肿瘤细胞的侵袭转移能力的影响。（5）统计学方法:Student’sttest、Mann-Whitney U-test、Chi2-test、Fisher’s exact test 用于单一变量分析。Spearman’s Rank-Order Correlation 确定相关系数 ρ和P值。OS和DFS用Kaplan Meier图显示,生存分析采用log-rank检验。使用median separation将GABPA转录本的水平分为高表达组和低表达组。所有检验均为双侧检验,P值＜

关键词：膀胱癌 GABPA tert 管腔分化侵袭增殖

抑癌基因TCEAL7在乳腺组织中的表达及与人端粒酶逆转录酶的关系

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广东医学 2016年第7期37卷 1030-1034页

作者：高金亮周勇河南省南阳市中心医院乳腺甲状腺外科 473009

目的探讨抑癌基因TCEAL7在乳腺组织中的表达特征及其与人端粒酶逆转录酶(h tert)间的相互关系。方法运用RT-PCR技术检测乳腺良性组织及乳腺癌组织中TCEAL7、h tert的表达状况,收集对应患者的临床及基本病理资料[包括年龄、淋巴结转移状... 详细信息

目的探讨抑癌基因TCEAL7在乳腺组织中的表达特征及其与人端粒酶逆转录酶(h tert)间的相互关系。方法运用RT-PCR技术检测乳腺良性组织及乳腺癌组织中TCEAL7、h tert的表达状况,收集对应患者的临床及基本病理资料[包括年龄、淋巴结转移状态、TNM分期及免疫组化结果(ER、PR及HER2表达情况)],利用统计学方法分析讨论它们之间的相互关系。结果 TCEAL7基因在14例乳腺良性组织中全部表达,但在55例乳腺癌组织中却没有发现表达;h tert在乳腺良性组织中有1例表达,在乳腺癌组织中有40例表达。h tert(+)及APBs(+)组之间年龄、肿瘤大小、淋巴结转移及病理分期均差异无统计学意义。在分析h tert与临床基本资料时,发现其与临床分期相关。结论抑癌基因TCEAL7在乳腺正常组织中高表达,在乳腺癌组织中几乎没有表达。在细胞水平,TCEAL7基因在端粒延长替代机制细胞中高表达,而在端粒酶阳性细胞中低表达,并且促进h tert的转录,发现h tert表达与肿瘤的病理分期相关。

关键词： TCEAL7 h tert ALT APBs

rs401681和rs402710在人群中促进多种癌症发展的机制研究

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rs401681和rs402710在人群中促进多种癌症发展的机制研究

作者：杨煜臣陕西师范大学

学位级别：硕士

在全世界,癌症是患病人数众多的一种疾病,同时也是死亡率最高的几种疾病之一,对人类的健康产生了巨大威胁。癌症的的发生是由多种因素引起的,包括环境中的危险因素和遗传易感性等。目前,癌症遗传易感性常用研究方法之一就是GWAS（Genome... 详细信息

在全世界,癌症是患病人数众多的一种疾病,同时也是死亡率最高的几种疾病之一,对人类的健康产生了巨大威胁。癌症的的发生是由多种因素引起的,包括环境中的危险因素和遗传易感性等。目前,癌症遗传易感性常用研究方法之一就是GWAS（Genome-wide association study）,即全基因组关联分析。多个GWAS研究显示:位于5p15.33区域中基因CLPTM1L（CLPTM1 like）的内含子中的SNP标记rs401681与肺癌、胰腺癌、膀胱癌、结直肠癌、黑色素细胞瘤和宫颈癌等六种癌症的遗传易感性密切相关。由于rs401681位于CLPTM1L的内含子区域中,CLPTM1L被认为涉及以上六种癌症的发生发展,并且认为rs401681通过调控CLPTM1L的表达与六种癌症相关。然而,该假说及其调控机制并没有实验证据的支持。此外,由于空间的限制,只有一小部分标签SNP被包含到GWAS研究中进行基因分型。因此,六种癌症的真实致病SNP可能不是rs401681或者不仅仅是rs401681,而是与rs401681连锁的SNP。然而,rs401681附近区域的连锁不平衡模式从来没有被研究。在本研究中,我们聚焦于多个人群,试图去揭示在5p15.33区域中的与六种癌症相关的真实的功能突变及其调控机制。通过对多个人群的千人基因组计划数据中该区域的基因型数据的分析,SNP位点rs402710被发现与rs401681连锁。因此,这两个SNP位点均有可能是以上六种癌症的遗传易感性位点。但是,这两个SNP位点在六种癌症的研究中呈现出两种不同的研究结果。在肺癌的研究中,我们首先分别构建了包含rs401681和rs402710位点的两种pGL3-promotor质粒以及相对应的SNP位点定点突变质粒。我们将以上质粒分别转染到肺上皮细胞Beas-2B中进行荧光双报告实验。结果显示,在肺细胞Beas-2B中,SNP位点rs401681和rs402710均为功能性位点,可调控基因的表达。染色质免疫共沉淀实验结果显示SNP位点rs401681及rs402710分别位于转录因子HNF-4A和MAF1的结合位点中,通过影响转录因子的结合效率来调控基因表达。染色质构象捕获实验结果则显示,包含rs401681和rs402710位点的DNA片段调控的靶基因不是CLPTM1L基因,而是tert基因。而目前的研究显示tert基因与癌症的发生发展密切相关,因此,我们的研究结果解释了这两个SNP与肺癌相关的分子机制。在胰腺癌、膀胱癌、结直肠癌、黑色素细胞瘤和宫颈癌等五种癌症的研究中,我们同样进行了荧光双报告实验。结果显示,在以上五种癌症的细胞中,SNP位点rs401681和rs402710均为功能性位点,可以调控基因表达。但是与肺癌细胞中结果不同的是,利用以上五种癌细胞进行的染色质构象捕获实验结果显示,包含rs401681和rs402710位点的DNA片段调控的靶基因不再是tert基因,而是一段DNA非编码区。因此,我们怀疑该区段可能存在未知的编码基因。通过生物信息学分析以及数据库搜索,我们发现该区段的确存在一个未被研究过的lncRNA（long non-coding RNA）基因。

关键词：癌症 GWAS SNP tert lncRNA

增龄对小鼠肺纤维化模型端粒酶活性影响的研究

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增龄对小鼠肺纤维化模型端粒酶活性影响的研究

作者：孙素雅山西医科大学

学位级别：硕士

目的:通过对青年小鼠及老年小鼠的肺纤维化过程中E-钙粘蛋白(E-Cadherin,E-Cad)、α平滑肌肌动蛋白(α-SMA)、波形蛋白(Vimentin)及端粒酶逆转录酶(tert)的表达水平进行研究,对比不同年龄的小鼠肺纤维化模型病变的程度及端粒酶活性的高... 详细信息

目的:通过对青年小鼠及老年小鼠的肺纤维化过程中E-钙粘蛋白(E-Cadherin,E-Cad)、α平滑肌肌动蛋白(α-SMA)、波形蛋白(Vimentin)及端粒酶逆转录酶(tert)的表达水平进行研究,对比不同年龄的小鼠肺纤维化模型病变的程度及端粒酶活性的高低,研究增龄对小鼠肺纤维化程度及纤维化过程中端粒酶活性变化的影响。方法:将50只20周龄的雄性C57BL/6小鼠随机分为两组,其中25只小鼠作为青年组,另外25只饲养25周作为老年组,将青年组及老年组再随机分成对照组(n=5)及博来霉素(BLM)造模组(n=20)。对照组气管注入0.9%氯化钠注射液于第28天处死,留取左肺;博来霉素造模组小鼠平均分为四组,每组5只,分别在气管注入博莱霉素稀释液(5mg/kg)的第7、14、21、28天处死,留取左肺标本。对肺组织进行HE染色及Masson染色,观察小鼠肺纤维化模型是否造模成功。运用肺组织石蜡切片免疫组化染色法,对可反映小鼠肺纤维化病变程度的上皮细胞标志蛋白E-钙粘蛋白(E-Cadherin,E-Cad),间质细胞标志蛋白α平滑肌肌动蛋白(α-SMA)、波形蛋白(Vimentin)及可反映端粒酶功能活性的指标端粒酶逆转录酶(tert)进行平均灰度值检测,对比各项指标在青年小鼠和老年小鼠的对照组与造模组间的差异,结果分析采用独立样本量t检验统计分析法并对其进行相关性分析。结果:小鼠肺组织石蜡切片HE染色及Masson染色结果表明气管注入BLM诱导小鼠肺纤维化模型成功。老年小鼠肺纤维化病变程度较青年小鼠严重。在模型组中,与青年组相比,E-Cadherin在老年组中表达少(Ptert在老年组中表达率波动范围大,其阳性率随时间变化先升后降(Ptert)功能先升后降。老年小鼠端粒酶活性波动值比青年小鼠波动值大,增龄可通过影响小鼠肺纤维化模型中端粒酶的活性来改变肺纤维化病变程度。

关键词：特发性肺纤维化端粒及端粒酶 tert 增龄

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脑胶质瘤相关分子特征分析

脑胶质瘤相关分子特征分析

作者：王皓山东大学

学位级别：硕士

目的:随着近些年来对胶质瘤分子特征研究的深入,越来越多的研究表明胶质瘤的分子特征以及其相关的信号通路参与了胶质瘤的发生与发展,对胶质瘤的增殖、侵袭以及转移等有着重要的影响,对这些分子特征进行深入的分析有助于将组织学类似但... 详细信息

目的:随着近些年来对胶质瘤分子特征研究的深入,越来越多的研究表明胶质瘤的分子特征以及其相关的信号通路参与了胶质瘤的发生与发展,对胶质瘤的增殖、侵袭以及转移等有着重要的影响,对这些分子特征进行深入的分析有助于将组织学类似但生物学行为有着显著差异的胶质瘤进行分类,这样可以有助于我们在临床上对各种不同分型的胶质瘤患者进行个体化治疗,从而改善患者的预后,实现真正的精准诊疗。资料与方法:本研究纳入了自2016年3月至2018年10月之间在山东大学齐鲁医院神经外科行手术治疗并且术后病理确诊为脑胶质瘤的患者共129例,将129例脑胶质瘤患者的冰冻肿瘤组织、血液配对标本进行全外显子检测并对129例患者进行严密的随访观察,将所得的临床资料与外显子资料结合进行相关统计学分析。结果:1.IDH基因突变分析结果:在男性胶质瘤患者与女性胶质瘤患者中IDH基因突变的频率无明显差异(P>0.05);在年龄小的胶质瘤患者中IDH基因突变的频率高于其在年龄大的胶质瘤患者中突变的频率(P0.05);在IDH突变型胶质瘤患者中1p/19q联合缺失的频率高于其在IDH野生型胶质瘤患者中的频率(Ptert启动子突变情况分析:在不同性别、不同的年龄段、低级别与高级别、初发与复发以及IDH突变型与野生型的胶质瘤患者中tert启动子突变的频率均无明显差异(P>0.05);在1p/19q联合缺失的胶质瘤患者中tert启动子突变的频率高于其在1p/19q完整的胶质瘤患者中突变的频率(Ptert启动子突变的频率和其在“胶母-wt”组中突变的频率无明显差异(P>0.0167);在“星型-mut”组中tert启动子突变的频率低于其在“少突”组中突变的频率(Ptert启动子突变的频率低于其在“胶母-wt”组中突变的频率(Ptert启动子突变型与野生型胶质瘤患者中ATRX基因突变的频率均无明显差异(P>0.05);在女性胶质瘤患者中ATRX基因突变的频率高于其在男性胶质瘤患者中突变的频率(P0.0167);在“星型-mut”组中ATRX基因突变的频率和其在“胶母-wt”组中突变的频率无明显差异(P>0.0167),在“星型-mut”组中ATRX基因突变的频率高于其在“少突”组中突变的频率(Ptert启动子突变型与野生型的胶质瘤患者中TP53基因突变的频率均无明显差异(P>0.05);在年龄小的胶质瘤患者中TP53基因突变的频率高于其在年龄大的胶质瘤患者中突变的频率(P0.0167);在“星型-mut”组中TP53基因突变的频率高于其在“胶母-wt”组中突变的频率(ptert启动子突变型与野生型、1p/19q联合缺失与完整、ATRX基因突变型和野生型以及TP53基因突变型和野生型的胶质瘤患者中UGT1A6基因H54Q突变的频率均无明显差异(P>0.05);在“星型-mut,,、“少突,”以及“胶母-wt”三组中UGT1A6基因H54Q突变的频率无明显差异(P>0.05);UGT1A6 H54Q突变型胶质瘤患者的中位生存时间(14.4±7.9月)小于UGT1A6H54Q野生型胶质瘤患者的中位生存时间(21.7±8.0月)(Ptert启动子突变、ATRX基因突变、TP53基因突变、H3F3A和HIST1H3B

关键词：胶质瘤 IDH tert 1p/19q UGT1A6

染料木黄酮对人乳腺癌细胞株端粒酶活性的影响及其作用机制

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染料木黄酮对人乳腺癌细胞株端粒酶活性的影响及其作用机制

作者：封明霞第三军医大学

学位级别：硕士

乳腺癌已经成为全球女性发病率最高的恶性肿瘤,每年新发乳腺癌病例120万,50万妇女死于乳腺癌。膳食因素对于乳腺癌的发生发展具有重要影响,通过膳食途径防治乳腺癌已成为乳腺癌综合防治的重要策略之一。大量流行病学研究结果表明,乳腺... 详细信息

乳腺癌已经成为全球女性发病率最高的恶性肿瘤,每年新发乳腺癌病例120万,50万妇女死于乳腺癌。膳食因素对于乳腺癌的发生发展具有重要影响,通过膳食途径防治乳腺癌已成为乳腺癌综合防治的重要策略之一。大量流行病学研究结果表明,乳腺癌的发病率与大豆摄入量呈负相关。大豆及其制品富含染料木黄酮(Genistein,GEN)、黄豆苷元(daidzein)和大豆黄素(glycetin)等异黄酮(isoflavones)成分,GEN作为大豆中的主要异黄酮成分,其分子结构特征与机体内源性雌激素相似,具有模拟或拮抗雌激素的双重调节活性,同时还是蛋白酪氨酸激酶(protein tyrosine kinase,PTK)活性抑制剂,大量体内外实验证实GEN具有抑制乳腺癌细胞增殖、诱导凋亡、抑制乳腺癌血管生成等抗乳腺癌作用,从而被认为是大豆抗癌的主要活性成分。虽然GEN抗乳腺癌作用的研究已有大量报道,但其抗癌作用的分子机制尚未完全阐明。端粒(Telomere)是真核生物细胞线性染色体末端的一种特殊结构,随着细胞有丝分裂次数的增加而不断缩短,当其缩短至某一临界值时,最终引起细胞衰老死亡。端粒酶(Telomerase)是一种特殊的核糖核蛋白复合体,其主要功能是维持端粒的长度。在正常体细胞中端粒酶活性不表达或是低表达,但在生殖细胞、干细胞中高表达,在肿瘤细胞中端粒酶活性检出率更是高达85%以上,大量研究资料表明端粒酶的激活是影响肿瘤发生发展的重要环节。人端粒酶包括3个主要组成部份,即人端粒酶RNA(human telomerase RNA,hTR),端粒酶相关蛋白(telomerase associated protein 1,TP1),端粒酶逆转录酶(human telomerase reverse transcriptase,htert),htert又称为端粒酶催化亚单位(hEST2 )。在端粒酶激活过程中,htert起着限速作用,是恶性肿瘤发生发展的重要影响因素。htert的表达水平和翻译后调节(磷酸化修饰、核转位)对于端粒酶活性调节有重要影响。临床研究资料表明乳腺癌中端粒酶阳性率在90%以上,目前国内外已有大量以端粒酶作为乳腺癌治疗靶点的研究报道。 GEN抗乳腺癌作用与端粒酶活性调节之间的关系研究报道较少,本研究以雌激素受体(estrogen receptor,ER)表达阳性(ER+)的MCF-7和ER表达阴性(ER-)的MDA-MB-231两种人乳腺癌细胞株为对象,首先通过MTT实验、TRAP-ELISA分别观察不同剂量的GEN在雌激素E2存在或缺失情况下对两种乳腺癌细胞生长和端粒酶活性的影响,初步明确GEN和E2对乳腺癌细胞端粒酶的调节作用及其与乳腺癌细胞增殖的关系;然后再通过RT-PCR、western-blot、免疫细胞化学等方法,研究GEN对乳腺癌细胞htert mRNA和htert、p-Akt蛋白表达,以及核因子NF-κB p65和热休克蛋白90(HSP90)核转位的影响,以期探讨GEN和E2调节乳腺癌细胞端粒酶活性的可能分子机制。主要实验结果和结论如下: 1.对于雌激素依赖性的乳腺癌MCF-7细胞, 10-9 mol/L的雌激素E2明显促进其增殖,并明显增强端粒酶活性,低浓度(5×10-6 mol/L)的GEN单独作用时与E2的作用类似,高浓度(40,80×10-6 mol/L)的GEN单独作用时呈剂量依赖性明显抑制端粒酶活性和细胞增殖,低浓度的GEN与E2联合作用时,端粒酶活性和细胞增殖较对照组无明显变化(p >0.05),而高浓度的GEN与E2联合作用时,端粒酶活性和细胞增殖均明显降低(p 0.05),而不同浓度的GEN无论是在雌激素E2存在还是缺失的情况下,均明显抑制端粒酶活性和细胞增殖,且抑制效应与GEN呈浓度依赖性。以上结果表明,雌激素E2仅对雌激素依赖性乳腺癌MCF-7细胞端粒酶活性和细胞增殖产生明显影响,而GEN对雌激素依赖性和非依赖性的乳腺癌细胞端粒酶活性和细胞增殖的都会产生影响,E2和GEN对乳腺癌端粒酶活性的影响与增殖能力的变化趋势一致,提示二者可能通过调节乳腺癌细胞端粒酶活性,进而影响细胞增殖能力的变化。 2.对于ER+乳腺癌MCF-7细胞,10-9 mol/L的雌激素E2明显促进htert mRNA和蛋白表达,低浓度(5×10-6 mol/L)的GEN单独作用时与E2的作用类似,高浓度(40×10-6 mol/L)的GEN单独作用时明显抑制htert mRNA和蛋白表达,低浓度的GEN与E2联合作用时,htert mRNA和蛋白表达水平与对照组无明显差异,而高浓度的GEN与E2联合作用时,htert mRNA和蛋白表达水平明显降低。对于ER-乳腺癌MDA-MB-231细胞,雌激素E2对hTE

关键词：染料木黄酮雌二醇端粒端粒酶人乳腺癌细胞MCF-7和MDA-MB-231 tert Akt NF-κB HSP90

端粒逆转录酶基因修饰蒙古羊输卵管上皮细胞系的建立

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端粒逆转录酶基因修饰蒙古羊输卵管上皮细胞系的建立

作者：海勒思内蒙古农业大学

学位级别：硕士

输卵管是卵子运输、储存、精子获能、受精和早期胚胎发育的重要部位。输卵管上皮细胞支持胚胎的发育并为胚胎早期发育提供理想的生理生化环境,但相比于其他体细胞,输卵管上皮细胞体外增殖分裂能力较弱,无法作为种质资源细胞库的种子细... 详细信息

输卵管是卵子运输、储存、精子获能、受精和早期胚胎发育的重要部位。输卵管上皮细胞支持胚胎的发育并为胚胎早期发育提供理想的生理生化环境,但相比于其他体细胞,输卵管上皮细胞体外增殖分裂能力较弱,无法作为种质资源细胞库的种子细胞长期保存,也不能满足其他实验研究与应用的需求。因此,本论文以蒙古羊为研究对象,通过酶消化法培养蒙古羊输卵管上皮细胞,采用脂质体转染法将端粒逆转录酶基因（tert）转入蒙古羊输卵管上皮细胞,经G418抗性筛选,建立端粒逆转录酶基因修饰的蒙古羊输卵管上皮细胞系（tert-SOECs）,并进行相关鉴定。主要研究结果如下:1.建立了蒙古羊输卵管上皮细胞（SOECs）系。采集健康蒙古羊输卵管组织,胰蛋白酶消化法分离、纯化了蒙古羊原代输卵管上皮细胞,培养细胞呈现出上皮细胞典型的鹅卵石形状,并稳定表达上皮细胞特异性标记物角蛋白18（CK18）。传代培养发现该细胞冻存、复苏后仍能保留较好的生长特性。2.建立了端粒逆转录酶基因修饰的蒙古羊输卵管上皮细胞系（tert-SOECs）。利用脂质体转染法将p CI-neo-h tert质粒转入蒙古羊输卵管上皮细胞（SOECs）,经G418筛选得到端粒逆转录酶基因修饰的蒙古羊输卵管上皮细胞系（tert-SOECs）,琼脂糖凝胶电泳检测证实端粒逆转录酶基因（tert）成功转入蒙古羊输卵管上皮细胞,目前可传至P15,并稳定表达上皮细胞特异性标记物角蛋白18（CK18）。P5端粒逆转录酶基因修饰的蒙古羊输卵管上皮细胞（tert-SOECs）体外培养的细胞倍增时间平均为46.61 h,P3、P5蒙古羊输卵管上皮细胞（SOECs）体外培养的细胞倍增时间平均分别为51.86 h、65.03 h。端粒逆转录酶修饰后的蒙古羊输卵管上皮细胞（tert-SOECs）体外增殖分裂能力比修饰前SOECs明显提高,达到了预期的效果。综上所述,本研究建立的端粒逆转录酶基因修饰的蒙古羊输卵管上皮细胞系（tert-SOECs）具有较强的体外增殖分裂能力,并依然保持了输卵管上皮细胞特有的生物学特性,为其作为种质资源细胞库种子细胞及后续实验研究奠定了必要的基础。

关键词：蒙古羊输卵管上皮细胞 tert tert-SOECs

JSRV-Env真核表达产物与体外细胞作用后对细胞信号通路中关键酶的影响

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JSRV-Env真核表达产物与体外细胞作用后对细胞信号通路中关键酶的...

作者：孙丽红内蒙古农业大学

学位级别：硕士

背景：绵羊肺腺瘤(OPA)是由绵羊肺腺瘤病毒(JSRV)引发的一种接触传染性肺脏肿瘤疾病。env基因是JSRV的癌基因,透明质酸酶2 (Hyal-2)是JSRV的作用受体。JSRV的囊膜蛋白(Env)转化NIH 3T3细胞是通过其胞质尾(CT)直接激活信号通路;而Env转... 详细信息

背景：绵羊肺腺瘤(OPA)是由绵羊肺腺瘤病毒(JSRV)引发的一种接触传染性肺脏肿瘤疾病。env基因是JSRV的癌基因,透明质酸酶2 (Hyal-2)是JSRV的作用受体。JSRV的囊膜蛋白(Env)转化NIH 3T3细胞是通过其胞质尾(CT)直接激活信号通路;而Env转化上皮细胞,是先与其受体Hyal-2结合,进而激活下游细胞信号通路。目的：绵羊Hyal-2是JSRV Env诱导细胞转化的受体,研究绵羊Hyal-2与Env之间的相互作用,对于揭示JSRV致瘤机理具有重要意义。方法：1.采用绵羊Hyal-2基因真核表达质粒pDsRed-monomer-N1-Hyal-2转染TC-1细胞,经G418筛选、纯化,构建稳定表达绵羊Hyal-2的TC-1细胞系。在核酸水平及蛋白水平上分别利用RT-PCR方法和Western blot方法验证Hyal-2在TC-1细胞内表达的稳定性,并通过激光共聚焦显微镜来观察载体自带红色荧光来确定Hyal-2蛋白在细胞内的定位。2.采用pEGFP-C1-env瞬时转染TC-1细胞、TC-1-Hyal2细胞和NIH 3T3细胞。通过RT-PCR方法和Western blot方法验证Env在上述3种细胞内的表达,同样使用激光共聚焦来观察Env在上述3种细胞内的定位。3.转染pEGFP-C1-env后,通过荧光定量PCR和Western blot方法分别检测其对细胞中AKT、ERK和tert表达量的影响。结果及结论：1.建立了稳定表达绵羊Hyal-2蛋白的TC-1细胞系,命名为TC-1-Hyal2。2.完成了pEGFP-C1-env真核表达质粒瞬时转染NIH 3T3细胞、TC-1细胞和TC-1-Hyal2细胞。3.转染pEGFP-C1-env后,TC-1-Hyal2细胞和TC-1细胞中AKT、ERK和tert表达量均升高,并且在TC-1-Hya12细胞中的表达量比TC-1细胞中升高更显著。4.绵羊Hyal-2蛋白具有促进JSRV Env诱导TC-1细胞转化的作用。

关键词： JSRV-Env TC-1细胞 AKT ERK tert

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胃肠道上皮干细胞标记物的筛选

胃肠道上皮干细胞标记物的筛选

作者：赵晔郑州大学

学位级别：硕士

背景：干细胞（stem cells）是一类未分化的细胞或原始细胞，具有通过自我复制产生相同的子代细胞，以及通过终末分化来生成组织中的全部成熟细胞成分的能力，可终生存在于器官的组织中。同时近年来提出的肿瘤干细胞学说认为肿瘤组织中... 详细信息

背景：干细胞（stem cells）是一类未分化的细胞或原始细胞，具有通过自我复制产生相同的子代细胞，以及通过终末分化来生成组织中的全部成熟细胞成分的能力，可终生存在于器官的组织中。同时近年来提出的肿瘤干细胞学说认为肿瘤组织中存在极少量瘤细胞，在肿瘤中充当干细胞的角色，具有无限增生的潜能，在启动肿瘤形成和生长中起着决定性的作用，而其余大多数细胞，经过短暂的分化，最终死亡。正常组织中的干细胞与肿瘤干细胞在特性上的相似之处使其关系的研究越来越成为基础研究的一大热点。有学者提出的肿瘤干细胞假说认为肿瘤起源于正常干细胞遗传突变的积累。由于胃肠道组织细胞更新频率较高，使得胃肠道上皮粘膜细胞处于持续的高再生状态下。在调节胃肠道内环境的稳定、保持细胞的凋亡、衰老以及新细胞的增殖、分化之间的平衡方面，胃肠道干细胞扮演着非常关键的角色。胃肠道干细胞属于成体干细胞，目前认为在胃内，上皮干细胞位于腺体峡部并随着其逐渐分化成熟同时向上移行至胃腔、向下移行至腺体更低的位置;在肠道，上皮干细胞位于小肠隐窝的基底部，潘氏细胞上方、大约第2-7层细胞的位置，有4-6个，位于降结肠隐窝基底部的最下部，大约1-4个，随着向肠腔表面迁移的同时不断增殖和分化（潘氏细胞除外）。要想对干细胞及肿瘤干细胞理论进行进一步的研究，首先要分离和确认干

关键词：胃肠道干细胞干细胞标记物 Musashi-1 tert Oct-4 Nestin