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HSPA6在tbc1d3癌基因调节乳腺癌细胞增殖和化疗敏感性中的作用

HSPA6在TBC1D3癌基因调节乳腺癌细胞增殖和化疗敏感性中的作用

引用

作者：彭小伟东南大学

学位级别：硕士

研究目的tbc1d3癌基因最初是在人前列腺癌细胞中发现的,该基因在多种肿瘤包括前列腺癌、乳腺癌、膀胱癌、胰腺癌和骨髓增生异常综合征等组织中均高表达,高表达的tbc1d3能使小鼠NIH 3T3成纤维细胞恶性转化为肿瘤细胞,把恶性转化细胞注入... 详细信息

研究目的tbc1d3癌基因最初是在人前列腺癌细胞中发现的,该基因在多种肿瘤包括前列腺癌、乳腺癌、膀胱癌、胰腺癌和骨髓增生异常综合征等组织中均高表达,高表达的tbc1d3能使小鼠NIH 3T3成纤维细胞恶性转化为肿瘤细胞,把恶性转化细胞注入裸鼠体内,可导致肿瘤形成,但其机制尚不十分清楚,特别是tbc1d3对乳腺癌细胞的增殖和化疗敏感性的影响及其机制还有待阐明。我们前期的转录组高通量测序结果提示,癌基因tbc1d3高表达可上调人MCF-7乳腺癌细胞中HSPA6表达,而HSPA6属于热休克蛋白70(HSP70)家族,该家族成员在众多恶性肿瘤组织中高表达,能促进细胞增殖并在肿瘤的化疗耐药中至关重要。因此,本实验主要探讨癌基因tbc1d3对人乳腺癌细胞的增殖和化疗敏感性的影响以及HSPA6在其中的作用。研究方法1.为了探讨tbc1d3在调节人乳腺癌细胞增殖和化疗敏感性中的作用,我们以未转染细胞为空白对照,用Lipofectamine(?)3000方法将Flag空载体和Flag-tbc1d3质粒分别转染人MCF-7非三阴性乳腺癌细胞和BT549三阴性乳腺癌细胞,24 h后,用CCK8方法检测转染后不同时间点(如0h、12 h、24 h、36 h、48 h)、抗肿瘤药物表阿霉素(Epirubicin,EPI)处理细胞后不同时间点(如0h、12 h、24 h、36h、48 h)、或不同浓度(如0、2.5、5、10、20、40、80 mmol/L)EPI处理细胞24 h后存活的细胞,分析癌基因tbc1d3高表达对人乳腺癌细胞的增殖和化疗敏感性的影响。2.为了研究癌基因tbc1d3在调节人乳腺癌细胞的增殖和化疗敏感性中的作用机制,我们用Lipofectamine(?)3000方法将Flag空载体和Flag-tbc1d3分别转染MCF-7细胞或BT549细胞,然后提取细胞总RNA进行实时定量RT-PCR,检测HSPA6 mRNA水平,或提取细胞裂解物进行Western blot,检测HSPA6蛋白水平,以验证我们前期的转录组高通量测序结果:tbc1d3高表达上调MCF-7细胞中HSPA6表达。3.为了明确HSPA6在癌基因tbc1d3调节人乳腺癌细胞增殖和化疗敏感性中的作用,我们以Flag空载体为对照,用Lipofectamine(?)3000方法将Flag-tbc1d3分别转染 MCF-7 和 BT549 细胞,用 dMSO、HSPA6 功能抑制剂 Apoptozole(AZ)、EPI 单独,或AZ和EPI两者合用处理细胞,24 h后,用CCK8方法检测存活的细胞,分析HSPA6功能抑制对癌基因tbc1d3调节乳腺癌细胞增殖和化疗敏感性的影响。4.为初步探讨HSPA6功能的抑制使tbc1d3促进乳腺癌细胞增殖和降低细胞EPI化疗敏感性的作用丧失机制,我们以Flag空载体为对照,用Lipofectamine(?)3000方法将Flag-tbc1d3分别转染人乳腺癌MCF-7和BT549细胞,并用dMSO或15 μmol/L AZ处理细胞,24 h后,用Western blot方法检测细胞内Flag-tbc1d3蛋白水平,分析HSPA6功能抑制对人乳腺癌细胞内tbc1d3蛋白稳定性的影响。研究结果***1d3癌基因促进人乳腺癌细胞增殖和降低乳腺癌细胞对表阿霉素化疗的敏感性:在探讨tbc1d3调节人乳腺癌细胞增殖和化疗敏感性的研究中,CCK8细胞增殖实验显示,与未转染细胞和转染Flag空载体细胞相比较,转染Flag-tbc1d3的人MCF-7和BT549乳腺癌细胞增殖显著增加。用不同浓度表阿霉素(Epirubicin,EPI)进行的CCK8细胞毒性实验显示,随着EPI浓度的增高,未转染组、转染Flag空载体组和转染Flag-tbc1d3组的存活细胞数均逐渐减少,除所用的最低浓度2.5 mmol/L和最高浓度80 mmol/L外,在 5、10、20、40 和 60 mmol/L 等其它浓度,Flag-tbc1d3 转染使 MCF-7细胞和BT549细胞对EPI的敏感性显著降低,MCF-7和BT549细胞存活分别较Flag空载体组和未转染组增加最多可达约60%和约30%。用20 mmol/L和40 mmol/L的EPI处理细胞不同时间的CCK8细胞毒性实验显示,EPI处理12 h后,Flag-tbc1d3虽能使MCF-7细胞和BT549细胞对较高浓度(40mmol/L)EPI的敏感性均显著降低,但仅能显著降低BT549细胞对低浓度(20mmol/L)EPI的敏感性;处理24h和36h后,Flag-tbc1d3使两种细胞无论对较高还是较低浓度EPI的敏感性均显著降低;处理48 h后,Flag-tbc1d3虽能显著降低两种细胞对较低浓度(20 mmol/L

关键词： tbc1d3 增殖热休克蛋白A6 表阿霉素 Apoptozole

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癌基因tbc1d3的功能研究

癌基因TBC1D3的功能研究

引用

作者：朱羽桐浙江大学

学位级别：硕士

tbc1d3是一类在灵长类动物中特有的并在人类基因组中出现重复的癌基因,在部分前列腺癌和乳腺癌中都发现了它的扩增。扩增是癌基因常见的激活方式,表现为包括双微体和均质染色区在内的染色体异常所导致的基因拷贝数目的增加。tbc1d3发生... 详细信息

tbc1d3是一类在灵长类动物中特有的并在人类基因组中出现重复的癌基因,在部分前列腺癌和乳腺癌中都发现了它的扩增。扩增是癌基因常见的激活方式,表现为包括双微体和均质染色区在内的染色体异常所导致的基因拷贝数目的增加。tbc1d3发生扩增的原因及其致癌机制尚未清楚。Hippo信号通路是近年来发现的一条在生理情况下控制器官大小的信号通路,它的异常调控会导致肿瘤的发生。在哺乳动物中,经典的Hippo信号通路由激酶Mstl/2,激酶Lats1/2以及它们的效应蛋白YAP/TAZ构成。我的研究发现tbc1d3是一个全新的Hippo信号通路调控基因,实验表明,它的过表达可以显著激活Hippo通路下游的辅转录因子YAP和TAZ。为了更好地阐明tbc1d3对Hippo信号通路的调控作用,我构建了四环素诱导]HBC1d3C表达的稳定细胞系,利用该细胞系进行的一系列研究发现,tbc1d3C可以与小G蛋白RhoA的鸟苷酸交换因子GEF-H1直接相互作用,使其脱离细胞微管骨架而活化,之后进入细胞质激活RhoA。活化的RhoA促使微丝发生聚合,对Lats1/2激酶进行抑制,最终导致YAP和TAZ的去磷酸化激活。总结来看,本研究发现了灵长类动物特有的基因tbc1d3通过抑制Hippo通路来促进肿瘤发生的可能机制;提出了一个新的GEF-H1激活途径;此外,更深入地阐明了Hippo信号通路从微管解聚到YAP/TAZ激活的中间过程,深化了我们对细胞骨架调控Hippo通路的理解。

关键词： tbc1d3 Hippo信号通路 RhoA GEF-H1

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tbc1d3表达上调降低人乳腺癌MCF-7细胞对长春新碱敏感性

TBC1D3表达上调降低人乳腺癌MCF-7细胞对长春新碱敏感性

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中国病理生理学会受体、肿瘤和免疫专业委员会联合学术会议

作者：何泽王丛阳王辉王露徐宁田田郭丹沈传陆东南大学医学院病理与生理教研室

目的研究乳腺癌细胞中tbc1d3表达上调时细胞对长春新碱(VCR)敏感性的变化,探讨tbc1d3表达是否影响VCR对乳腺癌的治疗效果。方法用RT-PCR方法扩增人tbc1d3的基因,酶切鉴定和测序确认,tbc1d3基因与pcdNA3.0分别经过BamH I和Xho I双酶切、... 详细信息

目的研究乳腺癌细胞中tbc1d3表达上调时细胞对长春新碱(VCR)敏感性的变化,探讨tbc1d3表达是否影响VCR对乳腺癌的治疗效果。方法用RT-PCR方法扩增人tbc1d3的基因,酶切鉴定和测序确认,tbc1d3基因与pcdNA3.0分别经过BamH I和Xho I双酶切、dNA纯化试剂盒纯化,通过T4 dNA ligase连接构建表达tbc1d3的真核表达载体pcdNA3-HA-tbc1d3;以MCF-7乳腺癌细胞为研究对象,实验组转染pcdNA3-HA-tbc1d3,对照组转染pcdNA3.0,western blot检测tbc1d3在MCF-7细胞中的表达;用MTT细胞增殖实验检测VCR处理下细胞生长抑制率,比较tbc1d3表达上调后VCR对细胞生长抑制率的变化。结果BamH I、Xho I双酶切和测序显示构建的pcdNA3-HA-tbc1d3正确;western blot显示转染pcdNA3-HA-tbc1d3的MCF-7细胞tbc1d3表达阳性;不同浓度(20、100、500nM)的VCR处理下,与对照组比实验组MCF-7细胞的生长抑制率均有显著下降(Ptbc1d3表达上调时,细胞对VCR敏感性降低,抑制tbc1d3可望提高长春新碱对乳腺癌的治疗效果。

关键词： MCF-7 乳腺癌细胞人乳腺癌 tbc1d3 长春新碱

来源： cnki会议评论

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